大熊貓源乳酸菌的降膽固醇作用研究

馬 纓，殷紅濤

（1.綿陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川綿陽621006；2.四川省綿陽農(nóng)業(yè)學(xué)校生物系，四川綿陽621000）

大熊貓源乳酸菌的降膽固醇作用研究

馬 纓1，殷紅濤2*

（1.綿陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川綿陽621006；2.四川省綿陽農(nóng)業(yè)學(xué)校生物系，四川綿陽621000）

為篩選出高效降膽固醇乳酸菌，本試驗利用MRS培養(yǎng)基從大熊貓糞便中分離得到乳酸菌，采用磷硫鐵比色法對該乳酸菌的體外降膽固醇能力進行測定，并利用經(jīng)典分類法對其進行細菌學(xué)鑒定。結(jié)果表明：該乳酸菌為乳桿菌屬嗜酸乳酸菌，能夠耐受pH值為3的酸性環(huán)境和0.3%的膽鹽，在對數(shù)生長期降膽固醇能力最強，膽固醇降低率為29.8%。

乳酸菌；大熊貓；降膽固醇

膽固醇對人體具有極其重要的生理作用，但是過高的膽固醇含量卻會嚴(yán)重危害人體健康。與使用藥物來降低血清膽固醇水平的方法比較，生物降血清膽固醇法有著較強的專一性、相對使用安全、反應(yīng)條件較為溫和、降解效率高等特性（張麗娜等，2007）。乳酸菌是大熊貓腸道優(yōu)勢菌，本試驗對分離得到的乳酸菌生長特性及體外降膽固醇作用進行研究，旨在為今后益生乳酸菌及功能性乳產(chǎn)品的開發(fā)利用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 試驗材料

大熊貓糞便采自成都動物園；MRS培養(yǎng)基、生理生化試驗所需試劑，均為市售分析純。

YP2002電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司生產(chǎn)；DL-1萬用電爐，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司生產(chǎn)；DNP-9272-1A電熱恒溫培養(yǎng)箱、JB-CJ-1B凈化工作臺、HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋，均為金壇市晶玻實驗儀器廠生產(chǎn)；XFS-280A手提式高壓蒸汽滅菌鍋、THZ-82A氣浴恒溫振蕩器，均為金壇市醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)；TD5K-Ⅱ低速離心機，長沙東旺實驗儀器有限公司生產(chǎn)；UV-5500紫外分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司生產(chǎn)；麥克奧迪BA200光學(xué)顯微鏡，成都麥克奧迪儀器有限公司生產(chǎn)。

2 試驗方法

2.1 MRS培養(yǎng)基的制備MRS培養(yǎng)基配方：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、酵母粉5 g、吐溫-80 1 mL、無水乙酸鈉5 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸二胺2 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、碳酸鈣30 g，加蒸餾水至1000 mL，pH值為6.6～6.8，121℃滅菌20 min待用（管立軍等，2009）。

2.2 乳酸菌的分離稱取1 g大熊貓糞便樣品，溶于9 mL無菌水中，振蕩均勻；吸取樣品0.5 mL至4.5 mL無菌水中，梯度稀釋至1×10-6。取1×10-4、1×10-5、1×10-63種稀釋液各0.1 mL，采用涂布法，在含3%CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基上進行分離，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑選生長快、溶鈣透明圈與菌落直徑值較大的菌株以備用（葛紅蓮等，2009）。

2.3 乳酸菌降膽固醇作用的初篩將篩選的菌株接種于含2%溴百里香草酚蘭的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察其顏色變化，如果變黃，則說明該菌株能夠利用膽固醇產(chǎn)酸（劉文華等，2008）。

2.4 乳酸菌降膽固醇作用的復(fù)篩以雞蛋黃作為膽固醇源添加到滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，混合均勻；以5%的接種量加入菌液，37℃恒溫培養(yǎng)30 h，每隔6 h取培養(yǎng)液5 mL，8000 r/min離心10 min，取上清按磷硫鐵比色法測定膽固醇含量（居華等，2007）。

磷硫鐵比色法：取9 mL甲醇和0.1 mL發(fā)酵上清液加入離心管中，8000 r/min離心5 min；取2 mL上清液加入試管中，再沿管壁緩慢加入2 mL配制好的磷硫鐵試劑，室溫下放置30 min，在紫外分光光度計550 nm波長處進行比色，并記錄結(jié)果。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制降膽固醇曲線。

磷硫鐵試劑：稱取5 g FeCl3·6H2O溶于200 mL濃磷酸中，取該溶液40 mL用濃硫酸定容到500 mL即得。

式中：C為空白對照在550 nm波長處OD值；A為菌株發(fā)酵后培養(yǎng)液在550 nm波長處OD值。

2.5 乳酸菌對pH值為3環(huán)境耐受力的測定將菌懸液接種于pH值為3的MRS液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)0、1、2、3、4、5 h時取樣，進行梯度稀釋，平板法測定乳酸菌活菌數(shù)。繪制以時間為橫坐標(biāo)、單位菌落總數(shù)的對數(shù)值（取以10為底的對數(shù)）為縱坐標(biāo)的耐酸性曲線。

2.6 乳酸菌對0.3%膽鹽環(huán)境耐受力的測定將菌懸液按2%的接種量分別接種到不含牛膽鹽（即空白）和含0.3%的牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h之后分別測定其OD值，并按公式（膽鹽耐受力/%=含有膽鹽培養(yǎng)基的OD值/空白培養(yǎng)基的OD值×100）計算菌株對膽鹽的耐受能力。

2.7 生長曲線的測定按5%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，每2 h取樣一次，用紫外分光光度計測定不同時間段培養(yǎng)液的OD值，未接種的培養(yǎng)液作為空白對照。繪制以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)的生長曲線（徐晶雪等，2009）。

2.8 產(chǎn)酸特性的測定按5%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，每2 h取樣一次，測定不同時間段菌液的pH值。將培養(yǎng)時間作為橫坐標(biāo)、pH值作為縱坐標(biāo)繪制pH值曲線。

2.9 細菌學(xué)鑒定形態(tài)鑒定：將分離得到的乳酸菌接種于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落特征；取典型菌落進行革蘭氏染色，油鏡下觀察菌體形態(tài)。

生理生化特性鑒定：對分離得到的菌株進行過氧化氫酶、明膠水解、吲哚、硫化氫、淀粉水解、石蕊牛乳、碳水化合物發(fā)酵試驗及15℃和45℃生長試驗。

3 結(jié)果與分析

3.1 乳酸菌的篩選

3.1.1 初篩對分離得到的乳酸菌進行初篩發(fā)現(xiàn)，能使指示劑變黃，初步確定其具有降低膽固醇的能力，繼而可進行下一步研究。

3.1.2 復(fù)篩由圖1可看出，4株菌都具有降膽固醇的能力，其中3號降膽固醇能力最強。在0～12 h所有的菌株都表現(xiàn)出了較高的降膽固醇能力，3號在12 h時膽固醇降低率達到了29.8%。因此選取3號菌株進行下一步研究。

圖1 降膽固醇曲線

3.2 乳酸菌對pH值為3環(huán)境的耐受力食物在胃中停留時間為1～5 h，胃環(huán)境呈酸性，這就要求菌株具備一定的耐酸性。從圖2可看出，在1～5 h內(nèi)活菌數(shù)呈下降趨勢，在2 h時活菌數(shù)最少，但其相對存活率仍然很高，由此可見，該菌株表現(xiàn)出了較強的耐酸性。

3.3 乳酸菌對0.3%膽鹽環(huán)境的耐受力人體小腸內(nèi)膽鹽含量在0.03%～0.3%，益生菌在膽鹽存在條件下才能吸收膽固醇，這就要求該乳酸菌還得具備一定的耐膽鹽能力。經(jīng)測定，四株菌的膽鹽耐受力依次分別為29.3%、27.7%、30.7%、28.4%。3號菌株的膽鹽耐受力為30.7%。

圖2 耐受pH值為3酸性環(huán)境曲線

3.4 乳酸菌的生長曲線與產(chǎn)酸特性由圖3可見，該菌株潛伏期較短，能迅速進入對數(shù)生長期。2～10 h繁殖速度非?？欤琌D值不斷上升；10 h之后吸光度趨于穩(wěn)定，菌株進入穩(wěn)定期。結(jié)合圖1可以看出該乳酸菌降膽固醇能力的大小與菌體的生長情況基本一致，潛伏期較低，對數(shù)期達到最高。

圖3 生長曲線

由圖4可見，0～10 h該菌株代謝速度加快，產(chǎn)酸量明顯增加，pH值下降較快；10 h之后產(chǎn)酸量明顯減少，幾乎不再增加，pH值也趨于穩(wěn)定，維持在4.6左右。

圖4 pH變化曲線

對圖1、圖3和圖4比較發(fā)現(xiàn)，該菌株降膽固醇能力與菌體生長情況及發(fā)酵產(chǎn)酸情況基本一致。潛伏期菌株降膽固醇能力低，生長緩慢，產(chǎn)酸不明顯；對數(shù)生長期菌株降膽固醇能力最強，菌體生長最快，數(shù)量最多，產(chǎn)酸能力最強；穩(wěn)定期降膽固醇能力和產(chǎn)酸能力也趨于恒定。這在一定程度上說明，該菌株的降膽固醇能力與菌體數(shù)量及環(huán)境pH值之間有著直接的關(guān)系。

3.5 細菌學(xué)鑒定

3.5.1 形態(tài)鑒定該乳酸菌在MRS平板上呈分散排列，表面較光滑、邊緣整齊、中央微隆起、易于刮起，直徑約0.5～1 mm的乳白色菌落，菌落周圍形成明顯透明圈。進行革蘭氏染色后于油鏡下觀察，菌體形狀為桿狀，無芽孢，呈單個、成對或短鏈狀排列，菌體長1.2～4 μm、寬0.5～1 μm，革蘭氏染色陽性。

3.5.2 生理生化特性鑒定對該乳酸菌進行一系列生理生化鑒定，結(jié)果見表1。

表1 生理生化鑒定

通過以上細菌學(xué)鑒定結(jié)果可知，該乳酸菌為乳桿菌屬嗜酸乳酸菌。

4 討論與結(jié)論

本試驗中乳酸菌對膽固醇的降解率達到了29.8%，遠遠高出吳慧昊等（2011）對腸球菌屬乳酸菌的測定結(jié)果（25.3%）。該菌株具有高效降膽固醇能力以及生長快、耐受pH值為3酸性環(huán)境和腸道高濃度膽鹽的特點，因此可應(yīng)用于益生菌體外降膽固醇的研究，也可用于保健食品的開發(fā)。

在測試菌株的降膽固醇能力時，空白對照組自身也有一定程度的降解，具體原因尚不清楚，可能是因為膽固醇受到溫度、氧氣等環(huán)境因素的影響。

大熊貓獨特的腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)為嗜酸乳酸菌的定植提供了基礎(chǔ)，而該菌也影響著宿主的消化生理，參與宿主體內(nèi)的微生態(tài)平衡，為宿主的健康保駕護航。這也為開發(fā)利用安全性高、腸道黏附性好的益生菌提供了菌源。

[1]葛紅蓮，郭翠紅，張軍令.兩株乳酸菌的分離鑒定及產(chǎn)酸性能的研究[J].周口師范學(xué)院學(xué)報.2009，26（2）：90～91.

[2]管立軍，李艷芳，程永強，等.產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及分離鑒定[J].食品科技.2009，1：2～5.

[3]居華，劉書亮，敖靈，等.降膽固醇乳酸菌的篩選、鑒定及生長特性[J].中國乳品工業(yè).2007，35（8）：7～9.

[4]劉文華，任慧英，鄒玲，等.一株優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定與特性研究[J].中國畜牧獸醫(yī).2008，35（2）：152～154.

[5]吳慧昊，段龍飛，張園園，等.熊貓糞便中乳酸菌的分離鑒定與降膽固醇作用研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī).2011，11：14～17.

[6]徐晶雪，鄒積宏，袁杰利.降膽固醇乳酸菌的篩選及應(yīng)用的研究進展[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志.2009，21（6）：570～571.

[7]張麗娜，于長青.乳酸菌的降膽固醇作用及其在發(fā)酵制品中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技.2007，28（7）：228～230.

To screen out certain Lactic acid bacteria（LAB）that can lower the levels of cholesterol，LAB was obtained from the excrement of gaint panda with MRS medium.Cholesterol removal activity of LAB was tested by the colorimetric method with ferric chloride/sulfuric acid/phosphoric acid and identified bacteriologically by the classic classification method.The results showed that it belonged to genus lactobacillus acidophilus LAB，which was tolerant to pH 3 and 0.3% bile salts.The LAB presented a comparatively high ability of cholesterol reducing in the logarithmic growing period and its reducing rate was 29.8%.

Lactic acid bacteria；giant panda；cholesterol reducing

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161706

S816.3

A

1004-3314（2016）17-0020-03

*通訊作者