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    鄰苯二甲酸單乙基己基酯對神經(jīng)干細胞增殖和遷移的作用

    2016-12-01 06:38:03黃意湘馬曉曉郝欣蕊廖雙菊梅虹霞鄭麗丹
    關(guān)鍵詞:研究

    黃意湘,馬曉曉,郝欣蕊,劉 勁,廖雙菊,梅虹霞,蘇 穎,鄭麗丹,林 函,

    (1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科,浙江溫州325000;2.浙江省麻醉學(xué)重點實驗室,浙江溫州325000)

    鄰苯二甲酸單乙基己基酯對神經(jīng)干細胞增殖和遷移的作用

    黃意湘1,馬曉曉1,郝欣蕊1,劉 勁1,廖雙菊1,梅虹霞2,蘇 穎2,鄭麗丹2,林 函1,2

    (1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科,浙江溫州325000;2.浙江省麻醉學(xué)重點實驗室,浙江溫州325000)

    目的探討鄰苯二甲酸單乙基己基酯(MEHP)對原代神經(jīng)干細胞(NSC)和NE-4C小鼠細胞增殖和遷移的影響。方法原代NSC來源于孕15 d(E15)遠交群SD胎大鼠腦皮質(zhì);NE-4C細胞為小鼠NSC。MEHP 0,1,10,100和1000μmol·L-1處理72 h后,CCK-8法檢測細胞活力;5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)法檢測細胞增殖能力;Transwell小室檢測細胞遷移;Western蛋白印跡法檢測糖皮質(zhì)激素受體(GR)、Y性別決定區(qū)框2(Sox2)、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(Stat3)等基因及蛋白的表達。結(jié)果CCK-8結(jié)果顯示,與正常對照組相比,MEHP1000μmol·L-1作用72 h后,NE-4C和NSC細胞活力明顯減弱,分別為正常對照組的70.3%和40.0%。EdU結(jié)果顯示,與正常對照組相比,MEHP 100μmol·L-1組細胞增殖率降低,分別為正常對照組的74.8%和12.0%(P<0.05)。Transwell實驗發(fā)現(xiàn),MEHP 100μmol·L-1處理72 h后,NE-4C細胞的遷移率降低至(63.4±2.0)%(P<0.05)。MEHP 100μmol·L-1組NE-4C中與增殖和遷移相關(guān)的基因GR,Stat3和Sox2的表達下調(diào),分別為正常對照組的49.8%,26.0%和14.0%(P<0.05);在NSC中的相應(yīng)基因也下調(diào),分別為正常對照組的10.0%,14.0%和15.3%;在NE-4C中與增殖及遷移相關(guān)的蛋白GR,GRβ,p-S tat3和Sox2的表達下調(diào),相對表達量分別為0.92±0.17,0.87±0.35,0.62±0.24和0.81±0.22(P<0.05);在NSC中相應(yīng)蛋白表達也下調(diào),相對表達量分別為0.82±0.20,0.56±0.12,0.53±0.20和0.84±0.36(P<0.05)。結(jié)論大劑量MEHP可抑制NSC的增殖和遷移能力,其機制可能是通過GR介導(dǎo)的Stat3及Sox2的作用實現(xiàn)。

    鄰苯二甲酸單乙基己基酯;神經(jīng)干細胞;NE-4C;細胞增殖;細胞遷移;糖皮質(zhì)激素受體

    塑化劑在20世紀30年代開始使用,主要用于提高產(chǎn)品的可塑性和增強產(chǎn)品的強度。鄰苯二甲酸酯類化合物是應(yīng)用較為廣泛的塑化劑,許多研究表明,在大氣、水體、土壤、生物體,乃至人體中普遍發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸酯類的存在,這類物質(zhì)可通過多種途徑進入人體,已成為一種全球性的重要環(huán)境有機污染物[1]。鄰苯二甲酸酯類對人類的危害主要表現(xiàn)在致癌、致畸性以及免疫抑制性[2],目前以致人體生殖功能損害的研究最多[3]。其中,鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(dethylhexylphthalate,DEHP)被認為是最廣泛應(yīng)用的塑化劑,鄰苯二甲酸單乙基己基酯(mono-2-ethylhexylphthalate,MEHP)則為DEHP在哺乳動物腸道內(nèi)的主要活性代謝產(chǎn)物[4],其毒性是DEHP的10倍。

    神經(jīng)干細胞(neuralstem cells,NSC)是一類具有分化潛能的祖細胞。在胚胎發(fā)育過程中,腦內(nèi)存在大量NSC;成年后主要分布在腦室下區(qū)和側(cè)腦室參與神經(jīng)的再生。NSC的增殖、分化及遷移是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的基礎(chǔ)。在NSC分化和神經(jīng)損傷后的修復(fù)中,細胞遷移起到基礎(chǔ)性的支持作用。

    目前已發(fā)現(xiàn),MEHP可抑制類神經(jīng)的PC12細胞G2/M細胞周期及DNA合成,從而抑制該細胞的增殖,促進分化[5]。動物實驗同樣發(fā)現(xiàn),出生后早期DEHP的暴露可對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育造成不利效應(yīng),從而影響仔小鼠成年后的運動協(xié)調(diào)功能[6]。當前大量研究證實,MEHP可與雄激素受體(androgen receptor,AR)相互作用以調(diào)節(jié)雄性生殖系統(tǒng)的功能[7]。糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)可促進NSC凋亡、抑制其增殖[8]。而研究已證實,GR與AR具有結(jié)構(gòu)上的相似性。因而本研究旨在探究MEHP是否可通過GR引起NSC的增殖和遷移改變,并擬從信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducerand activatoroftranscription 3,Stat3)和Y性別決定區(qū)框2〔sex determining region Y(SRY)-box 2,Sox2〕角度探討其機制。

    1 材料與方法

    1.1 細胞和試劑

    NE-4C細胞,中國科學(xué)院上海分院生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所,型號(ATCC,CRL-2925?)。

    原代NSC的制備:體質(zhì)量250~350 g雌雄SD大鼠(溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,動物許可證編號:SCXK浙20100044),置于定制的鐵籠里進行交配,室溫21.5~22.5℃,12 h晝夜交替飼養(yǎng),觀察到陰栓日計為孕第0天(E0)。取E15的SD大鼠,5%水合氯醛按照0.7 mg·kg-1腹腔注射,麻醉后無菌操作下取出胚胎置于預(yù)冷的D-Hanks平衡鹽液中。解剖分離取出胚胎大腦皮層,剝離腦膜,剪碎組織移到15 mL離心管中,室溫200×g離心5 min,去除培養(yǎng)液,加入1~2 mL Accutase消化酶于37℃消化5 min,反復(fù)吹打約30次,加入適量完全培養(yǎng)液后過濾。錐蟲藍(臺盼藍)染色以計數(shù)活細胞,細胞懸液以(1~2)×109L-1移至25 cm3培養(yǎng)瓶,置于5% CO237℃孵箱中培養(yǎng),48 h后換液傳代。細胞穩(wěn)定傳代至第2代時,進行MEHP暴露處理。

    1.2 試劑和儀器

    MEHP購于百靈威試劑公司,B27 supplement以及DMEM/F12購于美國Gibco公司,表皮生長因子(epidermalgrowth factor,EGF)及堿性成纖維細胞因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF)購于美國Cali-Bio公司,Click-iT?EdUAlexa Fluor高通道顯像試劑盒購于美國Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Promega公司,SoFastEvaGreen?Supermix購于美國Bio-Rad公司,GR抗體、Stat3抗體、p-Stat3抗體以及Sox2抗體均購于美國Abcam公司(ab3579,ab109085,ab30647,ab97959),GRβ抗體購于英國Biorbyt公司(Orb157177),山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。SZ61解剖顯微鏡購于日本Olympus,Olympus Cx21倒置相差顯微鏡購于日本Nikon公司,TS100熒光顯微鏡購于日本Nikon公司,PVDF膜購于美國Millipore公司(0.45μm),Multiskan MK3全自動酶標分析儀購于美國Fisher公司,CFX96熒光定量PCR儀購于美國Bio-Rad公司,LAS4000mini凝膠成像分析系統(tǒng)購于美國GE公司。

    1.3 細胞分組處理

    原代NSC和細胞株NE-4C隨機分為正常對照組、DMSO組、MEHP 1,10,100和1000μmol·L-1組,其中接種原代NSC的培養(yǎng)板預(yù)先用5%P-L-O溶液鋪板,然后加入相應(yīng)藥物處理。每組設(shè)6個復(fù)孔,于37℃5%CO2孵育箱培養(yǎng)72 h后檢測處理。

    1.4 CCK-8實驗檢測細胞存活

    NE-4C細胞株及原代NSC分別以每孔3×103和8×103的密度接種于96孔板內(nèi),體系為100μL。接種原代NSC的培養(yǎng)板預(yù)先用5%P-L-O溶液鋪板。按1.3進行分組處理,每組設(shè)6個復(fù)孔,于37℃5%CO2孵育箱培養(yǎng)72 h。暴露結(jié)束前4 h移除原培養(yǎng)液,PBS漂洗后每孔加入10μL CCK-8溶液。孵育4 h后用酶標儀檢測490 nm吸光度值(absor?bance,A)。細胞存活率(%)=(藥物組A值-調(diào)零孔A值)/(正常對照孔A值-調(diào)零孔A值)×100%。

    1.5 5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)法檢測細胞增殖

    取對數(shù)期生長的NE-4C細胞及原代NSC分別以每孔2×104和5×104接種于24孔板內(nèi),體系為0.5 mL。按1.3進行分組處理,每組設(shè)3個復(fù)孔,細胞置于37℃5%CO2孵育箱培養(yǎng)72 h。于終止培養(yǎng)前4 h,加入EdU 50μmol·L-1至培養(yǎng)液中。培養(yǎng)結(jié)束后去除上清,3.7%甲醛固定15 min后,用0.5% Triton X-100透膜,加入染色反應(yīng)液Click-iT?,室溫下避光于脫色搖床孵育30 min。最后采用Hoechst33342染核,熒光顯微鏡下拍照計數(shù),200倍顯微鏡下每孔計數(shù)5個視野取平均值。

    1.6 Transwell細胞遷移實驗

    將NE-4C細胞于無血清培養(yǎng)液中孵育12 h后,以每孔3×104密度加入Transwell上室,體系為500μL,并以1%的BSA維持滲透壓,按1.3進行分組處理,每組3個復(fù)孔,Transwell下室加入含10% FBS的完全培養(yǎng)液,體系為600μL,于孵育箱培養(yǎng)72 h。孵育結(jié)束后去除Transwell上下室的培養(yǎng)液,PBS漂洗1~2次,4%多聚甲醛固定10 min后結(jié)晶紫染色15 min,PBS漂洗2~3次后在倒置顯微鏡下觀察黏附在小室下層細胞的數(shù)量,200倍顯微鏡下計數(shù)10個視野取平均值。

    1.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測基因表達水平

    神經(jīng)干細胞NE-4C和原代細胞分別以每孔3×105和5×105的密度接種于6孔板,體系為1 mL。按1.3進行分組處理,每組設(shè)6個復(fù)孔,細胞于37℃,5%CO2孵育箱培養(yǎng)72 h。藥物作用終止后按Trizol試劑說明書提取各組NE-4C及NSC的總RNA,測定總RNA濃度與A260nm/A280nm比值,將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA,采用相對稀釋標準曲線法進行qRT-PCR測定目的基因GR,Stat3,Sox2 mRNA的相對表達水平,反應(yīng)程序為:95℃×30 s,95℃×5 s,60℃×5 s;循環(huán)39次。針對NE-4C的引物序列如下,內(nèi)參基因RS16:上游引物(F)CGTGCTTGTGCTCGGAGCTA;下游引物(R)GCTCCTTGCCCAGAAGCAAA;目的基因GR:(F)TACAGTCAAGGTTTCT?GCGTCT;(R)CCCCATCACTTTTGTTTCG;Stat3:(F)GCTCCTTGCCCAGAAGCAAA;(R)CGGT?GCTGCACGATAGG;Sox2:(F)CCCCATCACTTTTGTTTCG;(R)CTCGGTCTCGGACAAAA;針對NSC的引物序列如下,內(nèi)參基因RS16:上游引物(F)AAGTCTTCGGACGCAAGAAA;下游引物(R)TTGCCCAGAAGCAGAACAG;目的基因GR:(F)ATACAGCATCCCTTTCTCAGCA;(R)CTTGGCACTATTCCAGTTTTC;Stat3:(F)TACCACAAAAGTCAGGTTGCTG;(R)ACATCCCCAGTCAG?GTTGCTG;Sox2:(F)TACCTCTTCCTCCCACTCCAG;(R)AATCTCTCCCCTTCTCCAGTTC;根據(jù)標準曲線法從各自標準曲線上計算待測樣本初始表達量,將目的基因表達量歸一處理,按照公式基因相對表達量(%)=(待測樣本目的基因初始濃度/待測樣本內(nèi)參初始濃度)/(對照樣本目的基因初始濃度/對照樣本內(nèi)參基因初始濃度)×100%,得出樣本目的基因的表達。

    1.8 Western蛋白印跡法檢測蛋白表達

    取1.3分組處理的細胞,MEHP作用終止后收集各組細胞離心沉淀,依蛋白裂解試劑說明書加入適量的RIPA裂解液和PMSF磷酸酶抑制劑。置于冰上靜置30 min后移入EP管,超聲(300 W、5 s× 3次,間隔5 s)破碎細胞。低溫離心12 000 g× 10 min,收取上清液。用BCA工作試劑盒測定蛋白濃度,每條泳道蛋白上樣30μg后電泳,轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉2 h,加入內(nèi)參蛋白β肌動蛋白和目的蛋白GR,Stat3,p-Stat3和Sox2一抗,按1∶1000的滴度稀釋,4℃搖床孵育過夜后以TBST洗膜,加入稀釋比例為1∶5000的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗,室溫孵育2 h,TBST充分洗膜,通過曝光后顯示條帶。用Quantity One4.62軟件分析目標蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶的積分吸光度(integrated absorbance,IA),以兩者的IA比值表示目標蛋白的相對表達水平。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 MEHP對神經(jīng)干細胞細胞活力的影響

    CCK-8實驗結(jié)果顯示,NE-4C細胞(表1)和NSC(表2)在MEHP 1000μmol·L-1處理后,細胞存活率降低(P<0.05);分別降低了70.3%和40.0%(P<0.05)。其他濃度MEHP對細胞存活率無影響。

    2.2 MEHP對神經(jīng)干細胞增殖能力的影響

    如圖1和表3所示,MEHP 1和10μmol·L-1處理對2種細胞增殖能力的影響不明顯;當濃度增加到100μmol·L-1,細胞增殖能力則被抑制,MEHP 100μmol·L-1組NE-4C和NSC的增殖能力分別被抑制74.8%和12.0%(P<0.05)。該結(jié)果提示,MEHP對細胞增殖的效應(yīng)與濃度相關(guān),低濃度時對增殖無影響,高濃度時則對細胞增殖產(chǎn)生抑制效應(yīng)。

    Tab.1 Effect of mono-2-ethylhexyl phthalate(MEHP)on cell viability of NE-4C cells by CCK-8 assay

    Tab.2 Effect of MEHP on cell viability of neural stem cells(NSCs)by CCK-8 assay

    Fig.1 Effect of MEHP on NE-4C cells(A)and NSCs(B)proliferation detected by cell fluorescence images of EdU assay.See Tab.1 for the treatment.Green fluorescence refers to cells dyed by Hoechst33342,while blue fluorescence refers to cells dyed by EdU.

    Tab.3 Effect of MEHP on cell proliferation of NE-4C and NSCs by EdU assay

    2.3 MEHP對神經(jīng)干細胞遷移能力的影響

    圖2顯示了NE-4C細胞在MEHP作用下遷移能力的變化。如表4的結(jié)果,與正常對照組相比,MEHP 100μmol·L-1處理時,NE-4C的遷移能力顯著下降(P<0.05),表現(xiàn)為穿過Transwell的細胞數(shù)量減少。其他濃度組的MEHP則不影響NE-4C細胞的遷移能力。

    Fig.2 Effect of MEHP on migration of NE-4C detected by images of Transwell test.See Tab.1 for the treatment. Purple cells stained by crystalviolet refer to cells that migrate to the lower chamber ofthe transwell.

    Tab.4 Effect of MEHP on cell migration of NE-4C by Transwellmigration assay

    2.4 MEHP對與神經(jīng)干細胞增殖和遷移相關(guān)的基因表達的影響

    NE-4C和NSC的qRT-PCR結(jié)果(表5)顯示,MEHP 100μmol·L-1處理后,增殖相關(guān)的基因(GR,Stat3和Sox2)的表達均表現(xiàn)為下調(diào)。與正常對照組相比,MEHP 100μmol·L-1處理使NE-4C中3種基因分別減少了49.8%,26.0%和14.0%;NSC中則分別減少了10.0%,14.0%和15.3%。

    2.5 MEHP對與神經(jīng)干細胞增殖和遷移相關(guān)的蛋白表達的影響

    圖3A和表6結(jié)果顯示,與正常對照組比,MEHP 100μmol·L-1處理NE-4C細胞后,細胞的GR,p-Stat3,GRβ及Sox2蛋白表達顯著降低(P<0.05),而Stat3的表達水平變化不顯著。

    圖3B和表6結(jié)果顯示,與正常對照組比,MEHP 100μmol·L-1處理NSC細胞后,細胞中的Stat3,GRβ及Sox2蛋白表達顯著減少(P<0.05),而GR表達的改變無統(tǒng)計學(xué)差異。

    Tab.5 Effect of MEHP on mRNA expression of GR,Stat3 and Sox2 of NE-4C and NSCs by qRT-PCR

    Fig.3 Effect of MEHP on expression of GR,Sox2,Stat3 and p-stat3 in NE-4C cells(A)and NSCs(B)by Western blotting.See Tab.1 for the treatment.

    Tab.6 Effect of MEHP on protein expression of GR,GRβ,Stat3,p-Stat3 and Sox2 in NE-4C cells and NSCs

    3 討論

    本研究結(jié)果顯示EHP的耐受能力可能存在差異,低濃度MEHP對細胞活力無影響,但當濃度達到1000μmol·L-1持續(xù)作用72 h時,對NE-4C和NSC則可致細胞存活率降低。因此,本研究在后續(xù)實驗中取消1000μmol·L-1MEHP劑量組。

    MEHP 100μmol·L-1可抑制NE-4C和NSC的增殖,使細胞的遷移能力減弱,而MEHP 1和10μmol·L-1則對NE-4C增殖和遷移無影響。在高濃度MEHP作用下,與NSC增殖相關(guān)的GR,Stat3及Sox2的表達均表現(xiàn)為不同程度的降低;與細胞遷移相關(guān)的Stat3和Sox2表達也受到抑制。

    目前的研究認為,MEHP等鄰苯二甲酸類物質(zhì)是一類內(nèi)分泌干預(yù)劑,通過模擬雌激素效應(yīng)發(fā)揮類似拮抗雄激素的效應(yīng)。GR在胚胎中期大量表達[11];與此同時,腦內(nèi)也存在AR的表達[12],而GR與AR結(jié)構(gòu)上具有相似性[13]。因此,MEHP很可能通過GR通路影響NSC的增殖。而本研究結(jié)果表明,當MEHP的濃度達到100μmol·L-1時,NE-4C細胞及NSC的增殖都受到不同程度的抑制。目前多數(shù)研究認為GR與細胞增殖呈負相關(guān)[14],而本研究發(fā)現(xiàn)GR表達下調(diào)時,細胞增殖作用減弱,似乎與上述觀點不一致??赡艿脑驗镚R存在2種亞型:GRα及GRβ,前者發(fā)揮經(jīng)典的GR的作用,而GRβ的作用與GRα相反,隨著GRβ表達下調(diào),細胞增殖能力減弱。Heine等[14]研究GR功能時沒有區(qū)分GRα和GRβ亞型,而本研究檢測的是GRβ。因此,推測NSC增殖能力的減弱是通過抑制GRβ的表達實現(xiàn)的。而對于NE-4C細胞和原代NSC,MEHP 100μmol·L-1處理的NE-4C細胞GR表達下調(diào),而NSC的GR蛋白表達改變則沒有統(tǒng)計學(xué)意義,推測可能是NE-4C細胞和NSC的種類不同所致。本研究認為,NSC的結(jié)果更貼近真實的實驗研究背景。

    Stat3是Stat家族的成員之一,主要參與細胞因子和生長因子相關(guān)的信號通路介導(dǎo)的包括細胞增殖、分化、凋亡、遷移及自我更新等多種生理過程[15-16]。目前認為,在胚胎7.5 d,胎小鼠腦內(nèi)即可檢測到Stat3的存在[17],表明Stat3在胚胎早期發(fā)育中有重要作用。Li等[18]在Stat3與NSC的增殖與遷移的研究也證實了這兩者的相關(guān)性。Debidda等[19]發(fā)現(xiàn),應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染使Stat3失活時,細胞的增殖能力也被抑制。本研究中MEHP 100μmol·L-1處理可致NE-4C細胞和NSC的增殖能力受損,同時Stat3的表達降低。

    在不同的組織和細胞系,Stat家族成員與GR無論在生理上還是功能上都存在相互作用,已有研究報道了Stat3與GR之間的交互聯(lián)系,這種相互關(guān)系可表現(xiàn)為作用的一致性,或相反。通過對GR的激素應(yīng)答元件的計算機分析發(fā)現(xiàn),GR的應(yīng)答元件與Stat3有重疊,提示激活的GR可與Stat3直接相互作用從而共同調(diào)節(jié)下游的基因,即GR與Stat3的作用表現(xiàn)一致,這種作用的一致性在肝細胞及B細胞的相關(guān)研究中也被證實[20]。與之相反,一項乳腺癌細胞的研究則發(fā)現(xiàn),Stat3與GR的作用是相互拮抗的[21]。而本研究的結(jié)果,NE-4C細胞和NSC都表現(xiàn)為GR與Stat3作用的一致性。

    在成髓細胞瘤等腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn),Stat3可增強它們的遷移[22],本研究也證實了Stat3與細胞遷移的這一相關(guān)調(diào)節(jié)作用。

    Sox2是NSC的標志物之一。作為一種轉(zhuǎn)錄因子,Sox2可調(diào)節(jié)細胞的增殖、遷移、分化及細胞的自我更新。在Sox2與細胞的增殖的研究中,Chu等[23]發(fā)現(xiàn),MEHP處理下,Sox2的表達降低時,細胞增殖的能力也減弱。本研究可發(fā)現(xiàn),NE-4C的增殖能力在該濃度下受到抑制。

    低濃度MEHP不影響細胞的遷移,當濃度達到100μmol·L-1NE-4C細胞的遷移能力受到抑制,此時Sox2的表達降低。在某些腫瘤細胞的研究中,Sox2的表達與細胞遷移能力成負相關(guān)[24]。

    Stat3與Sox2之間同樣存在相互作用。在食管鱗狀細胞的研究中發(fā)現(xiàn),Stat3可通過slug與Sox2產(chǎn)生相互作用,即Stat3/低氧誘導(dǎo)因子-1α激活可促進Sox2上調(diào)slug的表達[25]。Zhao等[26]發(fā)現(xiàn),激活的Stat3可結(jié)合Myc和Sox2的啟動子從而誘導(dǎo)后者的表達。在這些研究中,Stat3可調(diào)節(jié)Sox2的表達,這種調(diào)節(jié)表現(xiàn)為正向的作用,這與本研究的結(jié)果一致。

    綜上所述,當MEHP的濃度達到100μmol·L-1時,細胞的增殖和遷移能力及與之相關(guān)的GR,Stat3及Sox2的表達都表現(xiàn)為下調(diào)。而MEHP 1000μmol·L-1對細胞具有毒性作用,致細胞活力降低。因此可推測,MEHP對NSC的增殖作用是通過GR介導(dǎo)的Stat3及Sox2的作用機制實現(xiàn)的,而MEHP對NSC遷移的影響則與Stat3及Sox2相關(guān)。

    [1]Valvi D,Monfort N,Ventura R,Casas M,Casas L,Sunyer J,et al.Variability and predictors of urinary phthalate metabolites in Spanish pregnant women[J].IntJ Hyg Environ Health,2015,218(2):220-231.

    [2]Shi C,Chen X,Cai XH,Yu WD,Liang R,Lu Q,et al.Cytotoxic effects of mono-(2-ethylhexyl)phthalate on human embryonic stem cells[J].Chin Med J(中華醫(yī)學(xué)雜志),2013,126(9):1714-1719.

    [3]Murphy CJ,Stermer AR,Richburg JH.Age-and species-dependent infiltration of macrophages into the testis of rats and mice exposed to mono-(2-e thylhexyl)phthalate(MEHP)[J].Biol Reprod,2014,91(1):18.

    [4]Ye T,Kang M,Huang Q,F(xiàn)ang C,Chen Y,Shen H,et al.Exposure to DEHP and MEHP from hatching to adulthood causes reproductive dysfunction and endocrine disruption in marine medaka(Oryzias melastigma)[J].Aquat Toxicol,2014,146(1):115-126.

    [5]Chen T,Yang W,Li Y,Chen X,Xu S.Mono-(2-ethylhexyl)phthalate impairs neurodevelopment:inhibition of proliferation and promotion of differenti?ation in PC12 cells[J].Toxicol Lett,2011,201(1):34-41.

    [6]Tanaka T.Reproductive and neurobehavioural toxicity study of Ponceau 4R administered to mice in the diet[J].Food Chem Toxicol,2006,44(10):1651-1658.

    [7]Lagu?E,Tremblay JJ.Antagonistic effects of testosterone and the endocrine disruptor mono-(2-ethylhexyl)phthalate on INSL3 transcription in Leydig cells[J].Endocrinology,2008,149(9):4688-4694.

    [8]Noguchi KK,Lau K,Smith DJ,Swiney BS,F(xiàn)arber NB.Glucocorticoid receptor stimulation and the regulation of neonatalcerebellar neuralprogenitor cell apoptosis[J].Neurobiol Dis,2011,43(2):356-363.

    [9]Lim CK,Kim SK,Ko DS,Cho JW,Jun JH,An SY,et al.Differentialcytotoxic effects of mono-(2-ethyl?hexyl)phthalate on blastomere-derived embryonic stem cells and differentiating neurons[J].Toxicology,2009,264(3):145-154.

    [10]Manz P,Cadeddu RP,Wilk M,F(xiàn)ritz B,Haas R,Wenzel F.Impact of di(2-ethylhexyl)phthalate on migration rate of human promyelocytic leukemia cells(HL-60)[J].Clin Hemorheol Microcirc,2014,58(1):241-246.

    [11]Yi SJ,Masters JN,Baram TZ.Glucocorticoid receptor mRNA ontogeny in the fetaland postnatal rat forebrain[J].Mol Cell Neurosci,1994,5(5):385-393.

    [12]Young WJ,Chang C.Ontogeny and autoregulation of androgen receptor mRNA expression in the nervous system[J].Endocrine,1998,9(1):79-88.

    [13]Xie N,Cheng H,Lin D,Liu L,Yang O,Jia L,et al.The expression of glucocorticoid receptor is negatively regulated by active androgen receptor signaling in prostate tumors[J].Int J Cancer,2015,136(4):E27-E38.

    [14]Heine VM,Rowitch DH.Hedgehog signaling has a protective effect in glucocorticoid-induced mouse neonatalbrain injury through an 11βHSD2-dependent mechanism[J].J Clin Invest,2009,119(2):267-277.

    [15]Arulanandam R,Geletu M,F(xiàn)eracci H,Raptis L. Activated Rac1 requires gp130 for Stat3 activation,cell proliferation and migration[J].Exp Cell Res,2010,316(5):875-886.

    [16]Cheng X,Jin G,Zhang X,Tian M,Zou L.Stagedependent STAT3 activation is involved in the differentiation of rat hippocampus neuralstem cells[J].NeurosciLett,2011,493(1-2):18-23.

    [17]Foshay KM,Gallicano GI.Regulation of Sox2 by STAT3 initiates commitment to the neural precursor cellfate[J].Stem Cells Dev,2008,17(2):269-278.

    [18]Li Y,Zhuang P,Shen B,Zhang Y,Shen J. Baicalin promotes neuronal differentiation of neural stem/progenitor cells through modulating p-stat3 and bHLH family protein expression[J].Brain Res,2012,1429(1):36-42.

    [19]Debidda M,Wang L,Zang H,Poli V,Zheng Y.A role of STAT3 in Rho GTPase-regulated cellmigration and proliferation[J].J Biol Chem,2005,280(17):17275-17285.

    [20]Arambasic′J,Poznanovic′G,Ivanovic′MS, Bogojevic′D,Mihailovic′M,Uskokovic′A,et al. Association of the glucocorticoid receptor with STAT3,C/EBPbeta,and the hormone-responsive element within the rat haptoglobin gene promoter during the acute phase response[J].IUBMB Life,2010,62(3):227-236.

    [21]Bertucci PY,Quaglino A,Pozzi AG,Kordon EC,Pecci A.Glucocorticoid-induced impairment of mammary gland involution is associated with STAT5 and STAT3 signaling modulation[J].Endocrinology,2010,151(12):5730-5740.

    [22]Xiao H,Bid HK,Jou D,Wu X,Yu W,Li C,et al. A novel small molecular STAT3 inhibitor,LY5,inhibits cell viability,cell migration,and angiogenesis in medulloblastoma cells[J].J Biol Chem,2015,290(6):3418-3429.

    [23]Chu DP,Tian S,Qi L,Hao CJ,Xia HF,Ma X. Abnormality of maternal-to-embryonic transition contributes to MEHP-induced mouse 2-cell block[J].J Cell Physiol,2013,228(4):753-763.

    [24]Bayo P,Jou A,Stenzinger A,Shao C,Gross M,Jensen A,et al.Loss of SOX2 expression induces cell motility via vimentin up-regulation and is an unfavorable risk factor for survival of head and neck squamous cellcarcinoma[J].Mol Oncol,2015,9(8):1704-1719.

    [25]Gao H,Teng C,Huang W,Peng J,Wang C.SOX2 Promotes the epithelial to mesenchymal transition ofesophagealsquamous cells by modu?lating slug expression through the activation of STAT3/HIF-αsignaling[J].Int J Mol Sci,2015,16(9):21643-21657.[26]Zhao D,Pan C,Sun J,Gilbert C,Drews-Elger K,Azzam DJ,et al.VEGF Drives cancer-initiating stem cells through VEGFR-2/Stat3 signaling to upregulate Myc and Sox2[J].Oncogene,2015,34(24):3107-3119.

    Effect of mono-2-ethylhexylphthalate on proliferation and migration ofneuralstem cells

    HUANG Yi-xiang1,MA Xiao-xiao1,HAO Xin-rui1,LIU Jin1,LIAO Shuang-ju1,MEIHong-xia2,SU Ying2,ZHENG Li-dan2,LIN Han2
    (1.Department of Anesthesiology,the Second Affiliated Hospitalof Wenzhou MedicalUniversity,Wenzhou 325000,China;2.Anesthesiology Key Laboratory of Zhejiang Province,Wenzhou 325000,China)

    OBJECTIVE To investigate the effect of mono-2-ethylhexyl phthalate(MEHP)on proliferation of primary neuralstem cells(NSCs)ofrats and NE-4C cells ofmice and on the migration of NE-4C cells and the mechanism.METHODS NE-4C or NSCs were treated with MEHP 1,10,100 and 1000μmol·L-1for 72 h,respectively.The cytotoxicity was estimated with the cell counting kit-8(CCK-8).Cellproliferation was analyzed by EdU assay.The mRNA expression levels of the glucocorticoid receptor(GR),signaltransducer and activator of transcription 3(Stat3)and sex determining region Y(SRY)-box 2(Sox2)were detected by qRT-PCR.The protein expression levels of total GR,GRβ,Sox2,Stat3 and p-S tat3 were measured by Western blotting.RESULTS Cellviability of NE-4C cells and NSCs at MEHP 1000μmol·L-1was significantly decreased,which was 70.3%and 40.0%ofthe control group,respectively.EdU assay showed that MEHP 100μmol·L-1decreased NE-4C cells and NSCs by 74.8%and 12.0%(P<0.05)compared with control.The effectof MEHP on the cellmigration of NE-4C was evidenced by the factthatthe migration was obviously reduced to(63.4±2.0)%(P<0.05)after treatment with MEHP 100μmol·L-1for 72 h.The mRNA expression levels associated with proliferation and migration in NE-4C of GR,Stat3 and Sox2 in MEHP 100μmol·L-1group were down-regulated to 49.8%,26.0%and 14.0%of control(P<0.05).At MEHP 100μmol·L-1,mRNA of GR,Stat3 and Sox2 in NSCs declined to 10.0%,14.0%and 15.3%of normalcontrol.Western blotting results revealed that protein expressions of GR,GRβ,Sox2 and p-S tat3 were remarkably inhibited by MEHP 100μmol·L-1in that the relative expression of NE-4C was 0.92±0.17,0.87±0.35,0.81±0.22 and 0.62±0.24(P<0.05).The corresponding protein expression in NSCs was 0.82±0.20,0.56±0.12,0.84±0.36 and 0.53±0.20(P<0.05)when the cells were treated with MEHP 100μmol·L-1for 72 h.CONCLUSION MEHP can inhibit the proliferation and migration of NE-4C cells and NSCs possibly by decreasing Stat3 and Sox2 thatare mediated by GRβ.

    mono-2-ethylhexylphthalate;neuralstem cells;NE-4C;cellproliferation;cellmigration;glucocorticoid receptor

    The project supported by National Natural Science Foundation of China(81471448);National Natural Science Foundation of China for the Youth(30800323);Natural Science Foundation of Zhejiang Province(LY14H090015);Technology Bureau of Wenzhou City(Y20150230);and Technology Bureau of Wenzhou City(Y20150061)

    LIN Han,E-mail:nanlinhannansh@qq.com

    R114

    A

    1000-3002-(2016)05-0545-08

    10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.010

    2016-01-29接受日期:2016-04-07)

    (本文編輯:喬 虹)

    國家自然科學(xué)基金(81471448);國家自然青年科學(xué)基金(30800323);浙江省自然科學(xué)基金(LY14H090015);溫州市科學(xué)技術(shù)局(Y20150230);溫州市科學(xué)技術(shù)局(Y20150061)

    黃意湘,女,碩士研究生,主要從事麻醉藥神經(jīng)發(fā)育毒性研究;林函,男,博士,副教授,主要從事麻醉藥神經(jīng)發(fā)育毒性研究。

    林函,E-mail:nanlinhannansh@qq.com

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