西達本胺對結(jié)腸癌細胞能量代謝的調(diào)節(jié)作用

何 牧，喬志新，任素萍，李常蘭，王艷冰，鄶啟源，王 鈺，羅云敬，于 群

（1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所，北京100850；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院中心實驗室，北京100730）

西達本胺對結(jié)腸癌細胞能量代謝的調(diào)節(jié)作用

何 牧1，2，喬志新2，3，任素萍2，李常蘭2，王艷冰2，鄶啟源2，王 鈺2，羅云敬1，于 群2

（1.北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所，北京100850；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院中心實驗室，北京100730）

目的考察西達本胺對結(jié)腸癌細胞HCT-8和HT-29能量代謝調(diào)節(jié)的作用。方法西達本胺5，10和20μmol·L-1分別處理HCT-8和HT-29細胞，普通光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，MTT法檢測細胞存活，熒光細胞活性試劑盒檢測ATP含量，糖酵解壓力試劑盒檢測代謝變化，熒光定量PCR和Western蛋白印跡法分別檢測糖酵解關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶A（LDH-A）在mRNA水平和蛋白水平的表達。結(jié)果與對照組相比，西達本胺處理組HCT-8和HT-29細胞形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)變形、皺縮和細胞碎片，增殖抑制率顯著升高（P＜0.05）；西達本胺5和10μmol·L-1處理16 h，HCT-8和HT-29細胞內(nèi)ATP總含量均無差異，而20μmol·L-1處理組ATP總含量顯著降低（P＜0.05）。西達本胺20μmol·L-1處理HCT-8和HT-29細胞16 h，有氧呼吸水平均無差異，而糖酵解ATP產(chǎn)生速率分別降低30.7%和37.9%（P＜0.05）；LDH-A mRNA水平無差異，蛋白水平顯著下調(diào)（P＜0.01）。結(jié)論西達本胺具有抑制結(jié)腸癌細胞糖酵解能力的作用，可能與下調(diào)LDH-A有關(guān)。

結(jié)腸癌細胞；西達本胺；乳酸脫氫酶A；Warburg效應(yīng)

結(jié)腸癌是一種常見的消化道腫瘤，據(jù)美國發(fā)布的《癌癥統(tǒng)計2015》資料顯示，2015年美國結(jié)腸癌預(yù)計新發(fā)病例為9萬，居惡性腫瘤第4位；死亡約5萬例，位于肺癌之后，居惡性腫瘤第2位［1］。我國結(jié)腸癌的發(fā)病率也呈上升趨勢。臨床上多采用以手術(shù)為主，化療和放療為輔的綜合治療方法，然而效果并不理想［2］。

研究表明，表觀遺傳學(xué)的改變對于惡性腫瘤的形成有非常重要的作用［3］。蛋白質(zhì)的乙酰化是一種重要的翻譯后修飾。乙?；接山M蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）共同調(diào)節(jié)。通常情況下，HDAC在腫瘤細胞里是過表達的。HDAC參與惡性腫瘤的細胞分化、細胞轉(zhuǎn)移、細胞黏附、血管形成、腫瘤抑癌基因沉默、細胞周期異常和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程［4］。HDAC抑制劑（HDAC inhibitor，HDACi）可靶向作用于HDAC，恢復(fù)乙?；?，使得無法轉(zhuǎn)錄的抑癌基因等恢復(fù)轉(zhuǎn)錄，進而抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。所以，HDACi正成為一類有廣泛應(yīng)用前景的抗癌新藥。

西達本胺（chidamide，CS055）為我國自主合成的苯甲酰胺類HDACi。近年來，國內(nèi)外多篇文獻報道，西達本胺對胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和B細胞淋巴瘤等多種腫瘤細胞都有抗腫瘤作用。西達本胺是我國第一個被國家食品藥品監(jiān)督管理局（China Food and Drug Administration，CFDA）批準進入臨床試驗的HDACi類藥物［5］。2014年12月23日被CFDA批準上市治療外周T細胞淋巴瘤（peripheral T-cell lymphoma，PTCL），成為全球第3個獲批用于PTCL治療的全新作用機制的藥物。

Warburg效應(yīng)指出，腫瘤細胞有別于正常細胞，在于能量代謝方式發(fā)生了改變。腫瘤細胞往往通過提高葡萄糖的利用率，采用有氧糖酵解途徑快速獲取能量以及合成代謝所需的各種前提物質(zhì)［6-8］。腫瘤細胞相比正常細胞增加了乳酸的生成［9］。而乳酸作為有氧糖酵解的產(chǎn)物，增加了細胞生存環(huán)境的酸性［10］，有利于腫瘤的侵襲［11］，抑制了抗腫瘤免疫效應(yīng)因子發(fā)揮作用［12］。乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDH-A）是有氧糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，催化糖酵解反應(yīng)的最后一步，完成丙酮酸到乳酸的轉(zhuǎn)化，并伴隨NAD+的生成，對腫瘤的生長維持有關(guān)鍵作用。LDH-A在腫瘤細胞通常是過表達的，LDH-A不但在腫瘤的發(fā)生有重要作用，而且對于腫瘤生存維持和發(fā)展也有重要作用［13-14］。因此，腫瘤細胞特有的能量代謝方式可作為藥物選擇性殺傷腫瘤細胞的作用靶點，從而達到選擇性抑制腫瘤增殖的目的。

本研究以結(jié)腸癌細胞HCT-8和HT-29為模型，觀察西達本胺對于體外結(jié)腸癌細胞生長的影響，以及對結(jié)腸癌細胞能量代謝的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器

人結(jié)腸癌細胞HCT-8和HT-29由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所惠贈，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)細胞，細胞貼壁生長，待鋪滿90%培養(yǎng)瓶后用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗；西達本胺（深圳微芯生物科技責(zé)任有限公司），溶于DMSO中，存于-70℃；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；FSP500胎牛血清（中國ExCell公司）；0733MTT（美國Amresco公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Scientific公司）；LDH-A抗體和β肌動蛋白抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；CellTiter-Glo?熒光細胞活性檢測試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒和實時PCR試劑盒（美國Promega公司）；糖酵解壓力試劑盒、XF基礎(chǔ)培養(yǎng)基、XF96細胞培養(yǎng)板和XF96細胞代謝呼吸動態(tài)分析儀（美國海馬Bioscience公司）；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）；LC96實時定量PCR儀（瑞士Roche公司）。

1.2 顯微鏡觀察細胞形態(tài)的改變

取對數(shù)生長期HCT-8和HT-29細胞，每孔接種1 mL（1×108L-1）細胞于12孔板，將西達本胺儲液（20 mmol·L-1的DMSO溶液）用DMEM培養(yǎng)基稀釋至終濃度為10和20μmol·L-1，并加入到細胞培養(yǎng)液中。同時設(shè)置細胞對照組。細胞經(jīng)西達本胺處理72 h后，普通光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。

1.3 MTT法檢測細胞存活

取對數(shù)生長期HCT-8和HT-29細胞，按每孔3000細胞接種96孔板，待細胞貼壁后，棄原培養(yǎng)液，西達本胺5，10和20μmol·L-1分別處理HCT-8和HT-29細胞72 h，同時設(shè)置細胞對照組。72 h后每孔加入MTT 5 mg·mL-1溶液10μl，培養(yǎng)箱中孵育4 h后，每孔加入SDS 100 mg·mL-1100μL溶解結(jié)晶，再放入培養(yǎng)箱中37℃孵育4 h，酶標儀測A570值，計算細胞存活抑制率：存活抑制率（%）=（1-實驗組A570nm值）/（對照組A570nm值）×100%。

1.4 生物發(fā)光儀檢測ATP生成

取對數(shù)生長期HCT-8和HT-29細胞，按每孔4000細胞接種96孔板，待8 h細胞貼壁后，棄原培養(yǎng)液，正常對照和本底孔加入完全培養(yǎng)基，給藥孔分別加入含5，10和20μmol·L-1西達本胺的完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中孵育16 h。細胞培養(yǎng)結(jié)束后，每孔中加入100μL CellTiter-Glo?試劑，準備只含培養(yǎng)基不含細胞的對照孔，以得到背景發(fā)光值；在一個定軌振蕩器上混合內(nèi)容物4×g，2 min，誘導(dǎo)細胞裂解；將平板室溫孵育10 min，使熒光信號值穩(wěn)定，生物發(fā)光儀記錄發(fā)光信號。

1.5 細胞外流量分析儀檢測細胞能量代謝

取對數(shù)生長期HCT-8和HT-29細胞，按每孔9000細胞接種海馬XF 96孔培養(yǎng)板，待8 h細胞貼壁后，棄原培養(yǎng)液，細胞對照和本底孔加入完全培養(yǎng)基，給藥孔加入含20μmol·L-1西達本胺的完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中孵育16 h。細胞培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)基更換為海馬XF檢測培養(yǎng)基，海馬XF細胞外流量分析儀檢測氧氣消耗率（oxygen consumption rate，OCR）、細胞外酸化率（extracellularacidification rate，ECAR）和質(zhì)子生成速率（proton production rate，PPR）。

1.6 實時PCR檢測LDH-A mRNA的表達

用西達本胺20μmol·L-1處理HCT-8和HT-29細胞72 h，Trizol法提取總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，得到的cDNA用于實時PCR反應(yīng)，以β肌動蛋白為內(nèi)參，檢測LDH-A mRNA的表達，mRNA相對表達水平采用比較Ct值法（2-△△Ct法）計算得出。

1.7 Western蛋白印跡檢測LDH-A蛋白的表達

西達本胺5，10和20μmol·L-1分別處理HCT-8和HT-29細胞72 h，刮取細胞于15 mL離心管，再用PBS洗滌2次后，200×g離心5 min，去上清，向各組中加入細胞裂解液混勻，置于冰上30 min，13 200×g離心20 min，將上清液移入新的EP管中，BCA蛋白定量后加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃沸水煮5 min變性處理，經(jīng)過SDS-PAGE，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜1 h，用5%脫脂奶粉封閉1 h，PBST洗膜4次，每次5 min，一抗孵育3 h，PBST洗膜4次，二抗避光孵育1 h，PBST洗膜4次后，Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)檢測PVDF膜，以β肌動蛋白作為內(nèi)參照。蛋白相對表達水平以目標蛋白和內(nèi)參蛋白的積分吸光度比值表示。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 西達本胺處理后結(jié)腸癌細胞的形態(tài)變化

光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)（圖1），72 h后，對照組細胞形態(tài)飽滿完整，貼壁生長良好；而經(jīng)西達本胺處理后，細胞形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)變形和皺縮，且有從壁上脫落的現(xiàn)象，出現(xiàn)細胞碎片。提示西達本胺有阻滯細胞生長并誘導(dǎo)細胞死亡的作用。

Fig.1 Effect of chidamide on morphology of HCT-8 and HT-29 cells after 72 h treatment（×100）.HCT-8 and HT-29 cells were treated with chidamide 10 and 20μmol·L-1for 72 h，respectively.

2.2 西達本胺對HCT-8和HT-29細胞存活的影響

MTT結(jié)果（圖2）表明，西達本胺5，10和20μmol·L-1組處理HCT-8和HT-29細胞72 h后，細胞存活抑制作用具有濃度效應(yīng)依賴性（r2分別為0.951和0.726）。其中西達本胺20μmol·L-1組HCT-8和HT-29的存活抑制率分別為（51.4± 6.6）%和（57.4±6.7）%，與細胞對照組相比明顯升高（P＜0.01）。

Fig.2 Effect of chidamide on proliferation of HCT-8（A）and HT-29（B）cells.HCT-8 and HT-29 cells were treated with chidamide 5，10 and 20μmol·L-1for 72 h.0.05，**P＜0.01，compared with cellcontrolgroup.

2.3 西達本胺對HCT-8和HT-29細胞ATP生成的影響

熒光檢測結(jié)果表明，西達本胺5和10μmol·L-1組處理HCT-8和HT-29細胞16 h后，細胞內(nèi)ATP總含量并無顯著性差異。而西達本胺20μmol·L-1處理ATP總含量分別由細胞對照組的（118±13）nmol·L-1和（332±33）nmol·L-1下降為（85±10）nmol·L-1和（222±17）nmol·L-1（P＜0.05）（圖3A）。鑒于低濃度組對于ATP總含量無影響，所以在后續(xù)檢測中，僅選用西達本胺20μmol·L-1組進行實驗。海馬XF細胞外流量分析儀監(jiān)測結(jié)果表明，與細胞對照組相比，西達本胺20μmol·L-1組耗氧率均無顯著性差異（圖3B），而糖酵解能力分別下降31.5%和35.2%（P＜0.01）（圖3C）。糖酵解產(chǎn)生ATP的速率分別降低30.7%和37.9%（P＜0.05）（圖3D）。

2.4 西達本胺對結(jié)腸癌細胞糖酵解關(guān)鍵酶LDH-A的影響

西達本胺20μmol·L-1處理72 h后，實時定量PCR結(jié)果（圖4A）表明，HCT-8和HT-29細胞內(nèi)LDH-A mRNA水平與對照組相比無顯著性差異。Western印跡法結(jié)果（圖4B和4C）表明，LDH-A蛋白表達顯著下降（P＜0.01）。提示西達本胺可能通過LDH-A翻譯后修飾途徑抑制LDH-A蛋白表達。

Fig.3 Effect of chidamide on total content of ATP（A），oxygen consumption rate（OCR，B），extracellular acidifi?cation rate（ECAR，C）and glycolysis ATP production were rate（D）in HCT-8 and HT-29 cells.A：HCT-8（A1）and HT-29 cells（A2）were treated with chidamide 5，10 and 20μmol·L-1for 16 h.B，C and D：HCT-8 and HT-29 cells treated with chidamide 20μmol·L-1for 16 h.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with cellcontrolgroup.

Fig.4 Effect of chidamide on key glycolytic enzyme LDH-A in HCT-8 and HT-29 cells by real-time PCR（A）and Western blotting（B and C）. HCT- 8 and HT- 29 cells were treated with chidamide 20 μmol·L-1for 72 h. C：semi-quanti?tative result of B. B1：HCT- 8 cells；B2：HT- 29 cells.n=3. **P＜0.01，compared with cell control group.

3 討論

本研究結(jié)果表明，西達本胺處理72 h顯著抑制HCT-8和HT-29細胞的生長，其作用機制可能涉及其對LDH-A的靶向調(diào)節(jié)作用。由于藥物作用時間越長，細胞狀態(tài)、數(shù)目及細胞間隙差異越大，所以在細胞能量代謝活力的監(jiān)測進行過程中，本研究選擇16 h取代72 h作為檢測時間點，研究發(fā)現(xiàn)，西達本胺處理16 h后，結(jié)腸癌細胞的有氧呼吸水平無顯著變化，而糖酵解能力減弱，無氧呼吸產(chǎn)生的ATP生成速率降低，以致結(jié)腸癌細胞總ATP生成量減少。

本研究發(fā)現(xiàn)，西達本胺可下調(diào)糖酵解途徑關(guān)鍵酶LDH-A的蛋白水平，控制腫瘤細胞內(nèi)ATP的合成。但它對LDH-A基因轉(zhuǎn)錄水平無明顯影響，推測西達本胺是通過對LDH-A翻譯后修飾的方法抑制LDH-A蛋白表達。目前已有報道，LDH-A蛋白存在磷酸化和乙?；男揎棧擫DH-A在K5發(fā)生乙?；瘯r可促使其發(fā)生降解［15］。因此推測，西達本胺在結(jié)腸癌細胞中發(fā)揮HDACi活性，抑制LDH-A蛋白的去乙?；^程，使其維持較高的乙?；?，進而促進其降解途徑，下調(diào)LDH-A蛋白表達，抑制無氧呼吸供能。有研究表明，F(xiàn)X11處理或小干擾RNA（siRNA）抑制LDH-A表達后，ATP生成降低，顯著增加了氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細胞死亡，并且FX11與FK866（一種NAD+合成抑制劑）的聯(lián)合用藥處理后，可觀察到在移植瘤模型中誘導(dǎo)淋巴瘤退化［13］。2009年，Xie等［16］發(fā)現(xiàn)在延胡索酸水化酶和LDH-A同時降低表達的情況下，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生，增加細胞凋亡，抑制腫瘤增殖生長。表明LDH-A有潛力成為腫瘤治療靶點。在乳腺癌治療中，降低LDH-A的表達可恢復(fù)紫杉醇耐藥性細胞對于紫杉醇的敏感性，而紫杉醇耐藥細胞對于草氨酸鹽敏感，草氨酸鹽是一種丙酮酸類似物，通過抑制丙酮酸到乳酸的轉(zhuǎn)化從而抑制糖酵解。表明LDH-A和乳酸代謝對于產(chǎn)生紫杉醇耐藥性細胞的治療改善有重要作用。此外，紫杉醇和草氨酸鹽的聯(lián)合使用對紫杉醇耐藥腫瘤細胞表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用，誘導(dǎo)腫瘤凋亡［17］。

本研究結(jié)果提示，西達本胺可通過下調(diào)LDH-A蛋白的表達水平，抑制結(jié)腸癌細胞無氧糖酵解途徑，整體水平上降低細胞內(nèi)ATP生成，從而減少蛋白質(zhì)、核酸及脂類等合成代謝所需的前體物質(zhì)，最終達到選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡并抑制腫瘤細胞快速增殖的目的。

綜上所述，本研究提示西達本胺通過減弱糖酵解途徑供能抑制結(jié)腸癌HCT-8和HT-29細胞增殖，其作用機制涉及LDH-A蛋白表達的調(diào)控，為揭示西達本胺等HDACi藥物抗癌機制提供了實驗依據(jù)。

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Regulation ofenergy metabolism in colon cancer cells by chidamide

HE Mu1，2，QIAO Zhi-xin2，3，REN Su-ping2，LIChang-lan2，WANG Yan-bing2，GUIQi-yuan2，WANG Yu2，LUO Yun-jing1，YU Qun2
（1.College of Life Science and Bioengineering，Beijing University of Technology，Beijing 100124，China；2.Institute of Transfusion Medicine，Academy of Military MedicalSciences，Beijing 100850，China；3.MedicalResearch Center，Beijing Tongren Hospital，CapitalMedical University，Beijing 100730，China）

OBJECTIVE To observe the regulation effect of chidamide on energy metabolism in HCT-8 and HT-29 cells.METHODS HCT-8 and HT-29 cells were treated with chidamide 5，10 and 20μmol·L-1.Morphologicalchanges of these cells were observed under an ordinary opticalmicroscope. Cell proliferation was detected by MTT.ATP production was determined by CellTiter-Glo?assay kit. Metabolic changes were tested by glycolytic stress kit.The mRNA levelof lactate dehydrogenase A（LDH-A）was analyzed by real-time quantitative PCR，whereas the protein level of LDH-A was analyzed by Western blotting.RESULTS Compared with controlgroup，cellmorphology of HCT-8 and HT-29 cells in chidamide treated group was irregular，accompanied by deformation，shrinkage and cell debris，and the inhibitory rate of proliferation increased（P＜0.05）.There was no significant difference in ATP totalcontent between chidamide 5 and 10μmol·L-116 h treatment groups，but in chidamide 20μmol·L-1treatment group itwas decreased（P＜0.05）.Chidamide 20μmol·L-1had no effecton oxygen consumption rate，but glycolysis ATP generation rate was reduced by 30.7%and 37.9%（P＜0.05），respectively. Chidamide 20μmol·L-1had no effect on LDH-A mRNA level，but it decreased the protein level of LDH-A（P＜0.01）.CONCLUSION Chidamide can abate the respiratory metabolic ability of HCT-8 and HT-29 cells.The mechanism may be related to the down-regulation of LDH-A.

colon cancercells；chidamide；lactate dehydrogenase A；Warburg effect

The projectsupported by Projectof Science and Technology of Beijing City（Z141100000214003）

YU Qun，E-mail：yuqun1970@outlook.com，Tel：13693377365；LUO Yun-jing，E-mail：luoyj@bjut.edu.cn，Tel：13521339608

R979.1

A

1000-3002-（2016）05-0539-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.009

2015-12-18接受日期：2016-05-09）

（本文編輯：賀云霞）

北京市科技計劃課題（Z141100000214003）

何牧，男，碩士研究生，主要從事生物化學(xué)研究。

于群，E-mail：yuqun1970@outlook.com，Tel：13693377365；羅云敬，E-mail：luoyj@bjut.edu.cn，Tel：13521339608