食品中黃曲霉毒素的檢測(cè)與控制

郭倩（東勝區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，內(nèi)蒙古東勝　017000）

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食品中黃曲霉毒素的檢測(cè)與控制

郭倩
（東勝區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，內(nèi)蒙古東勝017000）

【摘 要】黃曲霉毒素（AFT）是由某些真菌產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有極強(qiáng)的毒性、致癌性，在自然界中普遍存在。隨著技術(shù)的發(fā)展和各國(guó)的重視，其檢測(cè)方法也不斷發(fā)展。本文就高效液相色譜法、薄層色譜法、免疫分析法等幾種AFT檢測(cè)技術(shù)作論述，簡(jiǎn)述了AFT的控制措施及對(duì)其檢測(cè)方法的發(fā)展作了展望。

【關(guān)鍵詞】黃曲霉毒素檢測(cè)控制

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是由黃曲霉（Aspergillus flavus，Aspergillus nomius）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等多種真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)相似且毒性極強(qiáng)的物質(zhì)，目前已分離鑒定的約有20種，其中以B1、B2、G1、G2和M1、M2為主。在天然污染的食品中以B1最為多見，其毒性和致癌性也最強(qiáng)［1］。黃曲霉毒素對(duì)人類和家畜的健康危害很大［2］。據(jù)世界糧農(nóng)組織（FAO）報(bào)告，全球每年約有2%的農(nóng)作物因受其污染而失去營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值［3］。近年來，進(jìn)出口商品中均有黃曲霉毒素超標(biāo)現(xiàn)象，因此黃曲霉毒素已經(jīng)成為出入境食品安全檢測(cè)的重要項(xiàng)目。

1　黃曲霉毒素的檢測(cè)方法

1.1高效液相色譜法（HPLC）

HPLC因其高效、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，成為黃曲霉毒素定量測(cè)定應(yīng)用最廣的方法。MycoSep系列多功能凈化柱（MFC）是專用于霉菌毒素分離純化的固相萃取柱，其最大優(yōu)點(diǎn)是可一步完成凈化過程，且凈化效果理想［4］。

反相HPLC（RP-PLC）采用填充硅膠顆粒的流動(dòng)池的熒光檢測(cè)，靈敏度可以達(dá)到1ng水平以下。為了加強(qiáng)熒光，一般通過強(qiáng)氧化劑（TFA等）或鹵族元素及衍生物在柱前或者柱后進(jìn)行衍生處理［5］。

林裕［6］用高效液相色譜法檢測(cè)黃曲霉毒素Bl、B2、Gl、G2，認(rèn)為該方法操作安全、快速、準(zhǔn)確度高、精密度好。

免疫親和層析凈化高效液相色譜法是HPLC的一種，被我國(guó)定為國(guó)標(biāo)方法［7］。該方法基本操作是先將試樣中的黃曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取，提取液經(jīng)過濾、稀釋后，用免疫親和柱凈化，以甲醇將親和柱上的黃曲霉毒素淋洗下來，將甲醇-黃曲霉毒素淋洗液的一部分注入HPLC中，對(duì)黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2分別進(jìn)行定量分析［8］。

然而一直困擾人們的問題是熒光檢測(cè)器對(duì)四種AFT分子具有選擇性，即對(duì)B2、G2的靈敏度高，而對(duì)B1、G1的靈敏度很低。因此，通常用兩種方法來提高B1和G1的熒光性：一是通過改變流動(dòng)相或改進(jìn)檢測(cè)器來降低物質(zhì)熒光性的損失，二是對(duì)熒光性弱的物質(zhì)進(jìn)行柱前或柱后衍生以增強(qiáng)其熒光性。

1.2薄層色譜法（TLC）

薄層色譜法（TLC）的原理是利用樣品中的黃曲霉毒素與其他物質(zhì)在固定相硅膠和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同，達(dá)到分離的目的，再用365 nm波長(zhǎng)的紫外線激發(fā)黃曲霉毒素產(chǎn)生熒光，根據(jù)熒光的強(qiáng)弱與標(biāo)準(zhǔn)品比較測(cè)定其含量。1990年該方法被列為AOAC標(biāo)準(zhǔn)方法。本法既可用于定性分析，也可用于定量測(cè)定；既可目測(cè)，也可用紫外分光光度計(jì)、熒光光度計(jì)定量［9］。TLC法是檢測(cè)AFB1的經(jīng)典方法，仍為普通實(shí)驗(yàn)室的常用方法［10］。

目前，在TLC法基礎(chǔ)上又發(fā)展了高壓薄層色譜法（overpressured Thin Layer Chromatograp，OPTLC）［11］。OPTLC是Tyihak在1979年提出的，它結(jié)合了經(jīng)典薄層色譜法、高效薄層色譜法與高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)而發(fā)展起來的一種能提高薄層分離效率的平面液相色譜技術(shù)。

1.3免疫學(xué)方法

1.3.1酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法是免疫酶技術(shù)的一種，1966年建立了ELISA法，1971年又提出了用可溶性抗原或抗體與固相載體結(jié)合，而保留免疫成分的反應(yīng)性的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）［5］。其原理是：樣品中的黃曲霉毒素B1與定量特異性抗體反應(yīng)，多余的游離抗體與酶標(biāo)板內(nèi)的包被抗原結(jié)合，加入酶標(biāo)記物和底物后顯色，與標(biāo)準(zhǔn)比較來測(cè)定含量。該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)， 檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)操作污染少，一次實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)多個(gè)樣品。我國(guó)應(yīng)用酶聯(lián)免疫方法測(cè)定食品中黃曲霉毒素的方法原理是：試樣中的AFB1經(jīng)提取、脫脂、濃縮后與定量特異性抗體反應(yīng)，多余的游離抗體則與酶標(biāo)板內(nèi)的包被抗原結(jié)合，加入酶標(biāo)記物和底物后顯色，與標(biāo)準(zhǔn)比較測(cè)定含量［11］。

目前，研究人員將酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和高效液相色譜法（HPLC）兩種方法結(jié)合使用。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是既可以快速篩檢大量陰性樣品，同時(shí)又能準(zhǔn)確檢測(cè)陽(yáng)性樣品中每種AFT的含量。2005年，柳潔等［12］將樣品首先用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法初篩測(cè)定，陽(yáng)性樣品再用免疫親和柱凈化、熒光檢測(cè)器測(cè)定的HPLC方法驗(yàn)證和準(zhǔn)確定量AFT。將兩種方法結(jié)合使用，可利用檢測(cè)方法各自的優(yōu)點(diǎn)，既可以快速篩檢大量陰性樣品，節(jié)省時(shí)間，同時(shí)又能準(zhǔn)確檢測(cè)陽(yáng)性樣品中每種AFT的含量，在經(jīng)濟(jì)上也更節(jié)省。

1.3.2免疫親和柱-熒光光度計(jì)法

該法以單克隆免疫親和柱為分離手段，用熒光計(jì)、紫外燈作為檢測(cè)工具的快速分析方法，克服了TLC和HPLC法在操作過程中使用劇毒的真菌毒素作為標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)物和在樣品預(yù)處理過程中使用多種有毒、有異味的有機(jī)溶劑對(duì)操作人員造成身體傷害和污染環(huán)境的缺點(diǎn)。同時(shí)黃曲霉毒素免疫親和柱-熒光光度計(jì)法分析速度快，一個(gè)樣品只需要10-15min，比傳統(tǒng)方法快幾個(gè)小時(shí)甚至幾天時(shí)間，儀器設(shè)備輕便、容易攜帶，自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)單，能直接讀出測(cè)試結(jié)果［11］。

1.4其他檢測(cè)方法

1.4.1AFT快速檢測(cè)卡

拜發(fā)公司提供AFB1和AFT Total速測(cè)卡。前者基于免疫膠體金技術(shù)，即氯金酸在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠體溶液，由于靜電作用而呈穩(wěn)定的膠態(tài)，故稱膠體金。膠體金標(biāo)記實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附劑膠體金顆粒表面的包被過程。球形顆粒對(duì)蛋白有很強(qiáng)吸附性，可與各種蛋白、多肽成綴合物，利用金顆粒高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，顯微鏡下可見黑褐色，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)配體出處大量聚集時(shí)，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而可用于AFB1和B2定性或半定量檢測(cè)。后者基于通常的酶聯(lián)免疫方法，將單克隆抗體連接在卡的膜上，檢測(cè)黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的總量，檢測(cè)限可調(diào)為4-30 ng.g-1［13］。

1.4.2激光誘導(dǎo)熒光（LIF）-高效毛細(xì)管電泳（HPCE）

馬良等［14］采用自行設(shè)計(jì)搭建的激光誘導(dǎo)熒光（laser induced fluorescence，LIF）-高效毛細(xì)管電泳（（high per-formance capillary electrophoresis，HPCE）檢測(cè)平臺(tái)，建立LIF-HPCE法對(duì)食品中的黃曲霉毒素B1進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)。本研究擬首次采用自行搭建的LIF-HPCE檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)AFB1進(jìn)行激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)，采用膠束電動(dòng)高效毛細(xì)管電泳模式檢測(cè)分離AFB1，建立高靈敏度AFB1的LIF-HPLC檢測(cè)技術(shù)，為糧油等農(nóng)產(chǎn)品、食品中AFB1的高靈敏度檢測(cè)提供技術(shù)手段。

1.4.3微柱篩選法

微柱篩選法是將樣品提取液通過由氧化鋁與硅鎂吸附劑組成的微柱層析管，雜質(zhì)被氧化鋁吸附，AFT被硅鎂吸附劑吸附，在365 nm紫外線下呈藍(lán)紫色熒光，其熒光強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與AFT的含量成正比，由于微柱不能分離AFB1、B2、G1、G2，故檢測(cè)結(jié)果為AFT的總量［13］。

1.4.4水平衰減全反射比傅立葉變換紅外光譜法

采用水平衰減全反射比技術(shù)獲得傅立葉變換紅外光譜，可用來檢測(cè)AFT的含量，這是一種較新的檢測(cè)分析方法［5］。Mirghani等采用此方法測(cè)定了花生及花生餅中AFT（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）的含量。檢測(cè)時(shí)用AFT標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)，無(wú)需對(duì)基質(zhì)進(jìn)行預(yù)分析。

2　黃曲霉毒素的控制

目前，對(duì)于黃曲霉毒素的控制方法方面的報(bào)道還不是很多，但是可以通過改變食物的貯存條件來達(dá)到控制黃曲霉毒素產(chǎn)生的目的。黃曲霉毒素普遍存在于酶變的大米、花生食品中。有實(shí)驗(yàn)證明，在溫度28℃-30℃，相對(duì)濕度80%以上的條件下最適合黃曲霉的生長(zhǎng)［6］。因此，在制定黃曲霉毒素的控制措施方面應(yīng)從食物的儲(chǔ)存條件及方法方面入手。首先，糧食及食品的儲(chǔ)存應(yīng)保持在低溫狀態(tài)下。其次，較高的相對(duì)濕度下，黃曲霉毒素容易產(chǎn)生。所以，控制環(huán)境的相對(duì)濕度也是控制黃曲霉毒素產(chǎn)生的方法之一。另外，及時(shí)清理霉變粒也是一個(gè)行之有效的方法。

3　展望

鑒于AFT的毒性及在食品中的廣泛污染，世界各國(guó)相繼建立或正在改進(jìn)檢測(cè)該毒素的方法。縱觀其發(fā)展趨勢(shì)，主要有兩個(gè)發(fā)展方向，即對(duì)現(xiàn)有方法的改進(jìn)和新方法的開發(fā)。在現(xiàn)有方法的改進(jìn)方面，利用免疫學(xué)原理建立的檢測(cè)方法及速測(cè)技術(shù)，如酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián)免疫試劑盒等，將會(huì)是以后發(fā)展的主流，并將在黃曲霉毒素的檢測(cè)中占主要地位；在新方法的發(fā)方面，對(duì)可能產(chǎn)生黃曲霉毒素的原材料，如谷物中的霉變粒，進(jìn)行監(jiān)控方法的研發(fā)將會(huì)是一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)。

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【Abstract】Aflatoxins，a group of toxins structurally related to secondary metabolites are produced by some fungal strains and to have extremely toxic，potent carcinogenic and ubiquitous in the environment.Along with technological development and national attention，its detection methods have also developed continuously.The methods and application of HPLC、TCL、Immunoassay and other detecting methods were discussed in the paper，and the control measures were introduced briefly.The prospect of detecting methods of AFT was also explained for the future.

【Key words】AFTDetectionControl