光葉蕨孢子繁殖技術(shù)研究

陳洪連，余凌帆*，文智猷，王達(dá)兵，吳世磊

（1.四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川成都 610081；2.天全縣林業(yè)局，四川天全 625500）

光葉蕨孢子繁殖技術(shù)研究

陳洪連1，余凌帆1*，文智猷1，王達(dá)兵2，吳世磊1

（1.四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川成都 610081；2.天全縣林業(yè)局，四川天全 625500）

為保護(hù)僅有的野生光葉蕨資源，探索光葉蕨孢子繁殖技術(shù)，采用混合基質(zhì)、無菌水、消毒原生境土、未消毒原生境土4種基質(zhì)，10℃、15℃、20℃、25℃4種溫度，通過人工控制光照、水分等生態(tài)因子，試驗(yàn)觀測光葉蕨原葉體出現(xiàn)時(shí)間、原葉體出現(xiàn)總數(shù)、幼孢子體出現(xiàn)時(shí)間、幼孢子體總數(shù)量。結(jié)果表明：光葉蕨孢子萌發(fā)對基質(zhì)的要求非常嚴(yán)格，最適宜在未消毒的原生境土壤中萌發(fā)。其余3種培養(yǎng)基質(zhì)中生長的原葉體數(shù)量極少，且萌發(fā)時(shí)間較長。這可能與土壤中的微生物和酶類系統(tǒng)有關(guān)。光葉蕨孢子萌發(fā)的最適溫度為15℃～20℃，過高或過低的溫度都抑制孢子的萌發(fā)，其中在20℃條件下孢子萌發(fā)最快，可能是由于不同種類孢子的結(jié)構(gòu)特征和對光照的要求不同所致。

光葉蕨；孢子繁殖；人工種群

光葉蕨（Cystoathyrium chinense Ching）為蹄蓋蕨科（Athyriaceae）光葉蕨屬（Cystoathyrium）植物。光葉蕨對生存和繁衍條件要求苛刻，目前僅分布于四川天全二郎山團(tuán)牛坪一帶，野生種群數(shù)量極少，隨時(shí)面臨著滅絕的危險(xiǎn)［1］，為國家一級重點(diǎn)保護(hù)植物。目前對光葉蕨的研究僅限于形態(tài)學(xué)、植物資源調(diào)查及生境保護(hù)等方面［2～4］，尚未見光葉蕨孢子繁殖的報(bào)道。筆者對光葉蕨孢子繁殖技術(shù)進(jìn)行了研究，以探討光葉蕨孢子繁殖的最佳環(huán)境條件，為光葉蕨擴(kuò)繁提供理論基礎(chǔ)，對光葉蕨種群保護(hù)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 孢子采集與儲藏

于2015年8月赴光葉蕨原生境地采集孢子。將具有成熟孢子的葉片從植株上剪下，平鋪在報(bào)紙上陰干，一般在3 d～7 d孢子自然散落。將混合的雜質(zhì)輕輕抖落后，收集孢子于硫酸紙袋中，置于4℃冰箱保存。

1.2 孢子的滅菌消毒

用濾紙將孢子包成約2 cm2的小包，并用細(xì)線扎緊，將濾紙小包先在70%的酒精中浸20 s左右，同時(shí)用鑷子將濾紙包中的氣泡趕凈，使孢子表面完全被酒精浸潤，然后將濾紙包放入5%的次氯酸鈉溶液中浸泡5 min～10 min，再用無菌水沖洗4～5次。在無菌培養(yǎng)皿中小心打開紙包，用少量無菌水將濾紙上的孢子沖入已消毒培養(yǎng)皿中備用［5］。

1.3 孢子的播種

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)4種培養(yǎng)基質(zhì)，分別為消毒的混合基質(zhì)（沙∶珍珠巖∶泥炭土＝1∶1∶1）、無菌水、消毒的原生境土、未消毒的原生境土。將各處理的基質(zhì)放入培養(yǎng)皿中整平、壓實(shí)（基質(zhì)厚1.2 cm左右），并加入適量無菌水。用經(jīng)過滅菌的膠頭滴管吸取孢子懸浮液均勻地滴入基質(zhì)中。播種后蓋上培養(yǎng)皿蓋，并分別貼上標(biāo)簽，記錄播種時(shí)間。

1.4 孢子的培養(yǎng)

將播種后的培養(yǎng)皿分別放入10℃、15℃、20℃、25℃的培養(yǎng)箱中，濕度通過適時(shí)加水保證培養(yǎng)箱濕度在90%以上，光照強(qiáng)度2 000 lx～2 300 lx，光源：熒光燈，每天持續(xù)時(shí)間6 h以上［6］。

播種后每天上午10點(diǎn)、下午2點(diǎn)各觀察一次，控制培養(yǎng)箱內(nèi)溫度、濕度和光照，觀察并記錄孢子萌發(fā)、發(fā)育情況。及時(shí)清除基質(zhì)中萌發(fā)的雜草和霉菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基質(zhì)對孢子萌發(fā)及配子體發(fā)育的影響

從孢子繁殖結(jié)果來看，光葉蕨孢子萌發(fā)對基質(zhì)的要求非常嚴(yán)格（表1），最適宜在未消毒的原生境土壤中萌發(fā)。孢子在未消毒原生境土壤中萌發(fā)時(shí)間最短，僅22 d就萌發(fā)形成原葉體，數(shù)量也最多。其余3種培養(yǎng)基質(zhì)中生長的原葉體數(shù)量較少，且萌發(fā)時(shí)間較長。

在4種培養(yǎng)基質(zhì)中只有未消毒原生境土壤培養(yǎng)出幼孢子體，其余3中基質(zhì)均未培育出幼孢子體，說明在4種基質(zhì)中只有原生境土壤適合光葉蕨配子體發(fā)育。

表1 不同培養(yǎng)基質(zhì)中光葉蕨孢子繁殖結(jié)果

2.2 不同培養(yǎng)溫度對孢子萌發(fā)及配子體發(fā)育的影響

根據(jù)孢子繁殖結(jié)果來看，光葉蕨孢子萌發(fā)的最適溫度為15℃～20℃（表2），過高或過低的溫度都抑制孢子的萌發(fā)。其中在20℃條件下孢子萌發(fā)最快，播種后22 d就能萌發(fā)。光葉蕨孢子在10℃條件下雖能萌發(fā)形成原葉體，但未能培養(yǎng)出幼孢子體。

表2 不同培養(yǎng)溫度條件下光葉蕨孢子繁殖結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)的4種培養(yǎng)基質(zhì)中，光葉蕨孢子萌發(fā)最適宜的基質(zhì)為未消毒的原生境土壤（表1）。這一結(jié)果與何圣米等的研究之間存在矛盾［7］，但與一些研究者的試驗(yàn)結(jié)果一致［6，8］，張祖榮等對華南黑桫欏（Gymnosphaera mettenian）、齒葉黑桫欏（Gymnosphaera denticulata）、金毛狗［Cibotium barometz（Linn.）J.Sm.］、荷葉鐵線蕨（Adiataum reniforme var. sinense）的研究也指出在未消毒的原生境土壤中孢子繁殖效果最好［9～11］。試驗(yàn)結(jié)果說明光葉蕨孢子繁殖對其原生境土壤有較強(qiáng)的依賴性，并且對土壤條件要求比較嚴(yán)格，這也可能是其自然種群難以擴(kuò)大的因素之一。光葉蕨孢子在未消毒原生境土壤中繁殖結(jié)果好于消毒的原生境土壤和混合基質(zhì)的原因可能為以下兩個(gè)方面：一是在土壤消毒的過程中，土壤中的微生物被高溫滅殺，同時(shí)土壤里的酶類系統(tǒng)也被破壞，導(dǎo)致土壤中養(yǎng)分的有效性降低，這嚴(yán)重影響了原葉體對養(yǎng)分的吸收和利用；二是雖然高溫殺滅了所有菌類，但是培養(yǎng)時(shí)溫暖而潮濕的土壤中各種霉菌在所難免，從而嚴(yán)重影響光葉蕨孢子的繁殖過程，相反，未消毒的原生境土壤中由于長期的相互適應(yīng)，土壤內(nèi)的各微生物間處于相對平衡的狀態(tài)，這避免了霉菌的出現(xiàn)，因此反而比經(jīng)過消毒處理的培養(yǎng)基質(zhì)更有利于光葉蕨孢子的繁殖［9］。由于無菌水中沒有添加任何養(yǎng)分，不能為配子體的生長發(fā)育提供充足的營養(yǎng)［12］，故無菌水基質(zhì)中光葉蕨的孢子繁殖結(jié)果不理想。

光葉蕨孢子萌發(fā)的適宜溫度范圍為15℃～20℃（表2），其中最適溫度為20℃左右。這與Culcita macrocarpa孢子及鐵皇冠（Microsorium pteropus）孢子的研究結(jié)果一致［13～14］，但與革葉蕨（R．a(chǎn)diantiformis）25℃時(shí)為最適萌發(fā)溫度的研究結(jié)果不一致［15］。張正修等指出［16］，不同種類孢子的最適萌發(fā)溫度存在差異，很可能是由于不同種類孢子的結(jié)構(gòu)特征和對光照的要求不同所致。溫度不僅可以影響孢子萌發(fā)過程中細(xì)胞膜透性與各種酶的活性，而且影響光敏色素的構(gòu)型和活性。低溫會限制膜透性和酶活性，從而導(dǎo)致孢子萌芽、配子體生長發(fā)育、孢子體的形成和生長緩慢；而高溫會抑制光敏色素的活性，從而影響孢子的萌發(fā)率，導(dǎo)致原葉體生長不良，甚至死亡［17］。

本試驗(yàn)僅選擇了4種基質(zhì)，有一定的局限性，還有其他可能適合光葉蕨孢子繁殖的基質(zhì)配方有待驗(yàn)證。

［1］ 朱大海，李永安，顧學(xué)清.時(shí)隔30年再現(xiàn)的絕滅植物——光葉蕨［J］.生命世界，2013（10）：46～47.

［2］ 余凌帆，高健，何讓等.天全縣光葉蕨資源現(xiàn)狀調(diào)查與保護(hù)對策研討［J］.四川林業(yè)科技，2015，36（3）：120～124.

［3］ 余凌帆，何讓，楊梅等.天全縣光葉蕨人工種群適宜生境地選擇［J］.四川林業(yè)科技，2015，36（6）：17～22.

［4］ 嚴(yán)岳鴻，張憲春，馬克平等.中國珍稀瀕危蕨類植物的現(xiàn)狀及保護(hù)［C］.第七屆全國生物多樣性保護(hù)與持續(xù)利用研討會論文集.2006：77～87.

［5］ 幾種觀賞蕨類植物的繁殖技術(shù)研究，吳芹，南京林業(yè)大學(xué)，2007.

［6］ 趙秀芳.蕨類植物的孢子繁殖技術(shù)［J］.中國種業(yè)，2005（02）：42～43.

［7］ 何圣米，楊悅儉，徐明飛，等.紫萁孢子繁殖快速成苗技術(shù)研究［J］.Chinese Agriculturalence Bulletin，2006，22（2）：233～235.

［8］ 林證明，陳曄，韋麗娜等.二叉鹿角蕨商品化育苗技術(shù)研究［J］.江蘇林業(yè)科技，1998（S1）：181～184.

［9］ 張祖榮，張紹彬.珍稀瀕危黑桫欏的孢子繁殖技術(shù)初探［J］.北方園藝，2010（7）：187－190.

［10］ 張祖榮，張紹彬.國家二級保護(hù)藥用與觀賞植物金毛狗的孢子繁殖技術(shù)初探［J］.北方園藝，2010（13）：203～206.

［11］ 張祖榮，張紹彬.桫欏與荷葉鐵線蕨的孢子繁殖技術(shù)研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（19）：10007～10009.

［12］ Momose S.Prothallia of the Japanese ferns（Filicales）［J］.University of Tokyo Press，Tokyo，1967.

［13］ Quintanilla L G，Pajarón S，Pangua E，et al.Effect of temperature on germination in northernmost populations of Culcitamacrocarpa and Woodwardia radicans［J］.Plant Biology，2000，2（6）：612～617.

［14］ 薛春麗，王衛(wèi)江，高永紅.鐵皇冠孢子人工培養(yǎng)研究［J］.云南農(nóng)業(yè)科技，2008（5）：16～17.

［15］ Brum F R，RandiáM.High irradiance and temperature inhibit the germination of spores of the fern Rumohra adiantiformis（Forst.）Ching（Dryopteridaceae）［J］.Revista Brasileira De Botanica，2002，25（4）.

［16］ 張正修，戴紹軍.環(huán)境因子對蕨類植物孢子萌發(fā)的影響［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，30（7）：1882～1893.

［17］ 黃超群.南京市幾種蕨類植物孢子繁殖及抗旱性研究［D］.南京林業(yè)大學(xué)，2006.

Propagation Technique of Cystoathyrium chinese Spores

CHEN Hong-lian1YU Lin-fan1WEN Zhi-you1WANG Da-bing2WU Shi-lei1
（1.Sichuan Academy of Forostry，Chengdu 610081；2.Forestry Bureau of Tianquan County，Tianquan 625500）

In order to protect the resources ofwild Cystoathyrium chinense，and explore the spore propagation technique，the experimentwas conducted to observe the occurrence time and quantity of prothallium and sporophyte in 4 kinds medium（mixed media，sterile water，sterile habitat soil，and non－sterilized habitat soil）and 4 temperatures（10℃，15℃，20℃and 25℃）by artificial controlling of light，water and other ecological factors.The result indicated that Cystoathyrium chinense spore germination was very strict to the requirement of the medium.The optimalmedium for spore germination was non-sterilized habitat soil，while the quantity of prothallium was very few，and had longer germination time in othersmedium. Thismight be related to soilmicroorganisms and enzyme system.Themost suitable temperature range was 15℃～20℃，especially at20℃.The too high or too low temperaturewould inhibit the spore germination. Itmight be due to different structural characteristics of spores which had different requirements of light. Key words：Cystoathyrium chinense Ching，Spore propagation，Artificial population

10.16779／j.cnki.1003－5508.2016.04.021

S723.1

A

1003－5508（2016）04－0097－03

2016-06-18

天全縣光葉蕨極小種群拯救保護(hù)生境營造及技術(shù)培訓(xùn)部分項(xiàng)目（天政采招［2014］27號）。

陳洪連（1989-），女，四川內(nèi)江人，碩士生，主要從事孢子繁殖等方面的研究，E-mail：chenhonglianmcl@163.com。

余凌帆（1977-），男，四川渠縣人，副研究員，現(xiàn)從事小種群研究與保護(hù)方面工作。