柳桉組培快繁技術(shù)體系研究

劉均利，劉海鷹，龍漢利，吳宗興，武華衛(wèi)，楊曉蓉

（四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川成都 610081）

柳桉組培快繁技術(shù)體系研究

劉均利，劉海鷹，龍漢利，吳宗興，武華衛(wèi)，楊曉蓉

（四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川成都 610081）

以柳桉（Eucalyptus saligna）成年優(yōu)株萌條的帶芽莖段為外植體進(jìn)行了組培快繁技術(shù)體系研究。研究結(jié)果表明：利用截干的方式，可獲得最佳的促萌效果，萌芽率100%，平均萌芽數(shù)38。3月下旬為柳桉組培的最佳外植體獲取時(shí)間。半木質(zhì)化枝條為最佳外植體選擇。MS＋6－BA0.5 mg·L－1＋NAA0.05 mg·L－1為柳桉初代誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，萌芽率66.67%。改良MS＋6－BA1.0 mg·L－1＋I(xiàn)BA0.02 mg·L－1＋NAA0.05 mg·L－1為柳桉增殖培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基，增殖系數(shù)5.44。改良MS＋6－BA0.01 mg·L－1＋I(xiàn)BA0.5 mg·L－1＋NAA0.2 mg·L－1為柳桉生根的最佳培養(yǎng)基，生根率95%以上，平均根數(shù)9條以上。

柳桉；優(yōu)樹促萌；組織培養(yǎng)；快速繁殖

柳桉（Eucalyptus saligna），桃金娘科桉樹屬高大喬木，原產(chǎn)澳洲，是適生于受近海洋影響的亞熱帶以及夏季多雨氣候環(huán)境的一個(gè)典型樹種［1］。桉樹是短周期工業(yè)原料林的首選造林樹種之一，但其不同種、種源和家系之間在生產(chǎn)量、適應(yīng)性與抗逆性上相差較大［2，3］。為了選擇適宜四川地區(qū)栽培的速生抗逆耐寒桉樹品種，四川省林業(yè)科學(xué)研究院于2010年從澳大利亞引進(jìn)20個(gè)桉樹品種71個(gè)種批號種子，育苗后在四川綿陽、合江、茂縣等地營建了區(qū)域引種試驗(yàn)林［4］。結(jié)果表明柳桉在多地的生長均表現(xiàn)出快速、抗逆、耐寒等特點(diǎn)，發(fā)展前景廣闊。為解決其優(yōu)良種苗問題，林科院組培中心自2013年起從引種試驗(yàn)林中篩選優(yōu)良單株為材料，開展了柳桉組培快繁技術(shù)研究，并取得成功。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

在綿陽梓潼柳桉3 a生人工林中選擇樹干通直、高大粗壯的優(yōu)良單株，經(jīng)促萌處理后，采集優(yōu)株萌條為外植體進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 研究方法

1.2.1 促萌技術(shù)研究

通過環(huán)割、砍口、截干等不同措施對選出的優(yōu)良單株進(jìn)行促萌處理（共36株）。研究不同處理方式對萌條萌發(fā)的影響，處理后觀察萌芽情況，統(tǒng)計(jì)萌芽率，找出適宜的促萌技術(shù)，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 不同處理方式對優(yōu)樹促萌的影響

萌芽率（%）＝萌發(fā)植株數(shù)／處理的總植株數(shù)× 100

平均萌芽數(shù)＝萌發(fā)的總枝條數(shù)／處理的總植株數(shù)

1.2.2 最佳取材時(shí)間篩選

在3月下旬、7月中旬、12月下旬分別采集了柳桉優(yōu)株萌條，進(jìn)行統(tǒng)一的試驗(yàn)處理，消毒時(shí)間為75%酒精20 s，0.1%HgCl25 min，接種于MS培養(yǎng)基上，每處理接種30管，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)萌芽率、污染率、褐化率，確定優(yōu)株采條的最佳取材時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

污染率（%）＝污染的外植體數(shù)／接種外植體總數(shù)×100

褐化率（%）＝褐化的外植體數(shù)／接種外植體總數(shù)×100

萌芽率（%）＝萌發(fā)的外植體數(shù)／接種外植體總數(shù)×100

圖1 不同取材季節(jié)對柳桉外植體初代誘導(dǎo)的影響

1.2.3 最佳生理狀態(tài)外植體篩選

取柳桉優(yōu)樹萌條莖段，分為幼嫩、半木質(zhì)化、木質(zhì)化3種外植體進(jìn)行統(tǒng)一的消毒處理培養(yǎng)，接種于MS培養(yǎng)基上，每處理接種30管，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)萌芽率、污染率、褐化率，確定優(yōu)株采條的最佳生理狀態(tài)。試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 不同生理狀態(tài)外植體對柳桉初代誘導(dǎo)的影響

1.2.4 初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

將柳桉帶芽莖段接種于表2所示初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，篩選出適合柳桉頂芽、腋芽萌發(fā)的最適培養(yǎng)基。每處理接種30管，重復(fù)3次。培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)萌芽率和生長狀況。試驗(yàn)結(jié)果以DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析、新復(fù)極差檢驗(yàn)和Duncan多重比較。

表2 初代培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

1.2.5 增殖培養(yǎng)基的篩選

將初代培養(yǎng)30 d后獲得的芽體，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中（以改良MS為基本培養(yǎng)基）培養(yǎng)，以獲得數(shù)量更多，生長更快速、健壯的無根苗。培養(yǎng)方案見表5，每個(gè)處理接種新芽莖段30個(gè)，重復(fù)3次，增殖培養(yǎng)3代后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)，繼代時(shí)間30 d。試驗(yàn)結(jié)果以DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析、新復(fù)極差檢驗(yàn)和Duncan多重比較。

增殖系數(shù)＝1 cm以上帶腋芽莖段切段數(shù)／每個(gè)莖段上原有腋芽數(shù)／繼代次數(shù)

1.2.6 生根培養(yǎng)基的篩選

增殖培養(yǎng)30 d后，將1.0 cm以上芽苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中（以改良MS為基本培養(yǎng)基）培養(yǎng)，考察激素對柳桉生根培養(yǎng)的影響。培養(yǎng)方案見表8，每個(gè)處理接種芽苗30株，重復(fù)3次，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)生根率和平均根數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果以DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析、新復(fù)極差檢驗(yàn)和Duncan多重比較。

生根率（%）＝發(fā)根的芽苗數(shù)／接種芽苗總數(shù)× 100

平均根數(shù)＝芽苗的發(fā)根數(shù)／接種芽苗總數(shù)

1.2.7 培養(yǎng)條件

所有培養(yǎng)基均附加0.7%～0.8%的瓊脂；蔗糖30 g·L－1；滅菌后pH5.8；培養(yǎng)溫度為（25±3）℃；濕度50%～70%；光照時(shí)間12 h·d－1～14 h·d－1，光照強(qiáng)度1 500 lx～2 000 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)樹促萌處理結(jié)果與分析

由表1可以看出，截干的方式，獲得的促萌效果最好，但是要以砍伐掉優(yōu)樹為代價(jià)；砍口的方式，樹體長勢無明顯影響，但無法獲得萌條；環(huán)割的方式，能夠促使優(yōu)樹產(chǎn)生萌條，效果略次于截干，但環(huán)割后對樹體主體長勢影響很大。如果不考慮樹體主體，單從獲得最多優(yōu)樹萌條的目的來講，利用截干的方式是最有效的。

2.2 不同取材時(shí)間篩選試驗(yàn)結(jié)果與分析

取材時(shí)間對柳桉莖段萌發(fā)有著顯著影響。

從圖1可以看出：從3月下旬開始到7月下旬止，污染率、褐化率隨著時(shí)間的推移呈上升趨勢，而萌芽率卻呈下降的趨勢。試驗(yàn)結(jié)果表明，3月下旬為柳桉萌條莖段培養(yǎng)的最佳取材時(shí)期，在這個(gè)時(shí)期，接種的污染率、褐化率最低，分別為25.56%和10%，而萌芽率最高，為56.67%。12月下旬最不適宜柳桉莖段培養(yǎng)取材，其萌芽率最低且褐化率偏高，分別為14.44%和35.56%，污染率為20%；7月中旬取材，污染率最高，為58.89%，褐化率和萌芽率分別為22%和32.22%，在該時(shí)期也不宜取材。

2.3 不同生理狀態(tài)外植體篩選試驗(yàn)結(jié)果與分析

外植體是建立快繁體系的原材料，外植體生理狀態(tài)的好壞是決定能否成功進(jìn)行初代誘導(dǎo)的關(guān)鍵。

從圖2可以看出，柳桉幼嫩的外植體在污染率（23.33%）和褐化率（8.89%）方面都較低，但萌芽率（42%）明顯低于半木質(zhì)化材料的萌芽率（71.44%），這是由于幼嫩的外植體在消毒處理時(shí)容易受到消毒劑的侵害，在后期培養(yǎng)過程中容易死亡，且由于材料幼嫩，形態(tài)建成能力不全，從而致使萌芽率較低；而半木質(zhì)化材料能更快地在培養(yǎng)過程形成無菌體系。而木質(zhì)化的外植體由于細(xì)胞活躍度下降，萌芽率偏低且褐化率較高。

2.4 初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)結(jié)果與分析

將柳桉莖段洗凈消毒后切成1 cm左右小段接種到初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。外植體接種15 d后出現(xiàn)萌動(dòng)，莖段葉腋處膨大鼓起，有綠色小芽冒出。經(jīng)過不斷生長，35 d后莖段葉腋處長出小苗。研究不同基本培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑對外植體基部愈傷組織和增殖的影響。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

從表2多重比較可知，基本培養(yǎng)基、6－BA和NAA各水平組合處理間，對于腋芽萌發(fā)，8號處理MS＋6－BA0.5 mg·L－1＋NAA0.1 mg·L－1呈極顯著差異，萌芽率達(dá)到66.67%，且腋芽長勢較好，腋芽萌發(fā)數(shù)較多，節(jié)間明顯，植株高生長也比較明顯；而6號處理與9號處理萌芽率均為56.67%，但比較其腋芽長勢，有玻璃化的趨勢，可能是由于培養(yǎng)基激素濃度較高，導(dǎo)致腋芽不正常生長。

將試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（表3），分析結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基和6－BA各水平間呈極顯著差異，說明基本培養(yǎng)基對柳桉莖段萌芽有較大影響，P值分別為0.001和0.0015。由于基本培養(yǎng)基各水平間和6－BA各水平間差異達(dá)到了極顯著，故有必要對各水平間進(jìn)行多重比較，其結(jié)果見于表4。而NAA對莖段腋芽萌發(fā)無明顯影響。

表3 初代培養(yǎng)試驗(yàn)方差分析

多重比較結(jié)果（表4）表明，培養(yǎng)基各水平間，以MS效果最佳，平均萌芽率達(dá)到56.67%，達(dá)到極顯著水平；6－BA各水平間，0.5 mg·L－1與1.0 mg· L－1間差異不顯著，以1.0 mg·L－1效果最佳，根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)表現(xiàn)來看，隨著6－BA濃度的增大，萌芽率雖然提高了，但是出現(xiàn)了植株玻璃化現(xiàn)象。綜合來看，6－BA為0.5 mg·L－1時(shí)，萌芽效果最佳?？偟膩砜?，MS＋6－BA0.5 mg·L－1＋NAA0.05 mg· L－1是柳桉莖段腋芽萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基配方。該配方與8號試驗(yàn)處理結(jié)果相符，在這個(gè)處理組合中，在植株基部有少量愈傷組織，但對芽的萌發(fā)和生長并未產(chǎn)生不利影響，且芽的分化數(shù)多、長勢好、植株生長健壯、莖葉生長正常。

表4 初代培養(yǎng)試驗(yàn)各水平間的多重比較

表5 增殖培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 增殖培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)多重比較結(jié)果來看，5號、8號、9號處理均呈極顯著差異，其中以9號處理最佳，但對比生長狀況發(fā)現(xiàn)，8號、9號處理雖然增殖系數(shù)高，但均有明顯玻璃化現(xiàn)象，因此可以看出5號處理改良MS＋6－BA1.0 mg·L－1＋I(xiàn)BA0.02 mg·L－1＋NAA0.05 mg ·L－1組合最優(yōu)。為找出影響柳桉增殖效果的影響因素，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（表6）。

表6 植物生長調(diào)節(jié)劑對柳桉增殖影響的方差分析

方差分析結(jié)果表明，對于柳桉的增殖來講，6－BA和NAA的P值均為0.0001，影響達(dá)到極顯著水平；IBA達(dá)到顯著水平，P＝0.0278。有必要對植物生長調(diào)節(jié)劑各水平間進(jìn)行多重比較，比較結(jié)果見表7。

由表7可知，對于柳桉的增殖，6－BA各水平間呈極顯著差異，其中以1.5 mg·L－1最佳，但此濃度下發(fā)現(xiàn)柳桉長勢趨于玻璃化，因此需要降低其濃度，而1.0 mg·L－1下植株長勢正常，1.0 mg·L－1應(yīng)是更適宜柳桉增殖的6－BA濃度；對于IBA而言，3個(gè)濃度水平間差異均未達(dá)到極顯著水平，但以0.02 mg·L－1平均增殖系數(shù)最高，因此IBA最適宜濃度為0.02 mg·L－1；NAA 3濃度水平間有極顯著差異，其中以0.05 mg·L－1最優(yōu)。綜合得知，改良MS＋6－BA1.0 mg·L－1＋I(xiàn)BA0.02 mg·L－1＋NAA0.05 mg·L－1組合為最佳柳桉增殖培養(yǎng)基配方。此結(jié)果也與5號實(shí)驗(yàn)處理的結(jié)果一致。

表7 植物生長調(diào)節(jié)劑各水平間的多重比較

2.6 生根培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)多重比較結(jié)果來看，6號處理改良MS＋6－BA0.01 mg·L－1＋I(xiàn)BA1.0 mg·L－1生根率與平均根數(shù)最高，分別為95.56%、9.35條。且柳桉生長勢旺盛，雖然有少量側(cè)芽生長，但不影響其生根與莖的增粗，且根系韌性好，側(cè)根多并有根毛，利于移栽。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（表9）。

表8 生長調(diào)節(jié)劑對柳桉組培苗生根的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表9 植物生長調(diào)節(jié)劑對柳桉生根影響的方差分析

由表9可見，對柳桉的生根率影響較大的是IBA，其次為6－BA，影響最小的是NAA。IBA與6－BA對柳桉生根率影響極顯著，而NAA對生根率影響顯著。對柳桉生根數(shù)影響極顯著的是NAA，而6－BA、IBA對其影響顯著。為分析出對柳桉生根率和生根數(shù)的關(guān)鍵影響因素有必要對植物生長調(diào)節(jié)劑各水平間進(jìn)行多重比較（表10）。

表10 植物生長調(diào)節(jié)劑各水平間的多重比較

由多重比較結(jié)果得知，對生根率而言，6－BA最優(yōu)濃度為0.01 mg·L－1，IBA和NAA的最優(yōu)濃度均為0.5 mg·L－1；對平均根數(shù)而言，6－BA依然是濃度為0.01 mg·L－1時(shí)最佳，IBA濃度為1.0 mg· L－1時(shí)最佳，NAA最佳濃度為0.0 mg·L－1，綜合看來，柳桉生根的最佳培養(yǎng)基在改良MS＋6－BA0.01 mg·L－1＋I(xiàn)BA0.5 mg·L－1～1.0 mg·L－1＋ NAA0.0 mg·L－1～0.5 mg·L－1的范圍。我們結(jié)合后期生產(chǎn)，擴(kuò)大接種株數(shù)，通過以改良MS＋6－BA0.01 mg·L－1為基本培養(yǎng)基，在IBA0.5 mg·L－1～1.0 mg·L－1＋NAA0.0 mg·L－1～0.5 mg·L－1的范圍內(nèi)進(jìn)行單因素篩選，綜合考慮生根率與平均根數(shù)，確定出改良MS＋6－BA0.01 mg·L－1＋I(xiàn)BA0.5 mg·L－1＋NAA0.2 mg·L－1為柳桉生根的最佳培養(yǎng)基，生根率可穩(wěn)定維持在95%以上，平均根數(shù)9條以上。

3 討論

從成年植株上采條作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，受位置效應(yīng)與成熟效應(yīng)的影響，外植體的成活率一般都較低，有時(shí)甚至完全無法培養(yǎng)成功。因此，一般來說，萌條的采集是組培外植體的最佳選擇。促萌技術(shù)的研究可為試驗(yàn)帶來大量優(yōu)質(zhì)的萌條，保障組培體系能得以盡快建立。這一經(jīng)驗(yàn)對于大多數(shù)木本植物的組培來說都是有效的。

組培體系建立的目的除保存優(yōu)良種資質(zhì)源外，主要是將其應(yīng)用于生產(chǎn)，從而快速穩(wěn)定的獲得大量優(yōu)質(zhì)種苗。目前的試驗(yàn)配方我們均結(jié)合生產(chǎn)進(jìn)行了摸索，可規(guī)模化推廣。但隨著培養(yǎng)次數(shù)的增多，苗木可能會(huì)出現(xiàn)一些退化的現(xiàn)象，應(yīng)注意配方調(diào)整，同時(shí)進(jìn)行復(fù)壯。

［1］ 祁述雄.中國桉樹［M］.北京：中國林業(yè)出版社，2002.

［2］ 白嘉雨.桉樹速生豐產(chǎn)培育技術(shù)［M］.北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，1993.

［3］ 黃德龍.柳桉優(yōu)良家系多性狀聯(lián)合選擇.河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，30（1）：69～74.

［4］ 陳炙，楊曉蓉，劉均利，等.不同降雨型桉樹種苗期特性研究［J］.桉樹科技，2012，29（1）：18～24.

A Study of Tissue Culture of Eucalyptus saligna

LIU Jun-li LIU Hai-ying LONG Han-li WU Zong-xing WU Hua-wei YANG Xiao-rong
（Sichuan Academy of Forestry，Chengdu 610081，China）

Studiesweremade of tissue culture and fast propagation system of Eucalyptus saligna by taking stem segmentswith auxiliary buds from superior plants'shooting as explants.The results showed that cutting the superior plants at the trunk base could get the best effect of promoting sprouting with germination rate of 100%and average number of38 shoots.Late March was the best time to obtain explants and semi－lignified shoots were the best choice.The optimalmedium for primary induction was MS＋6－BA0.5 mg·L－1＋NAA0.05 mg·L－1with a germination rate of 66.67%.The optimalmedium for subculture wasmodified MS＋6－BA1.0 mg·L－1＋I(xiàn)BA0.02 mg·L－1＋NAA0.05 mg·L－1with amultiplication coefficient of 5.44.The optimalmedium for rooting wasmodified MS＋6－BA0.01 mg·L－1＋I(xiàn)BA0.5 mg·L－1＋NAA0.2 mg·L－1with a rooting rate of 95%and the average root number of above 9.

Eucalyptus saligna，Promoting sprouting of superior plants，Tissue culture，Rapid propagation

10.16779／j.cnki.1003－5508.2016.04.016

S722.3

A

1003－5508（2016）04－0074－05

2016-04-10

四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目“林－板－家具一體化現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)鏈關(guān)鍵技術(shù)集成研究與產(chǎn)業(yè)化示范”專題“速生材良種熟化及工廠化育苗技術(shù)集成與產(chǎn)業(yè)化示范”（2014NZ0033－1）；四川省財(cái)政專項(xiàng)項(xiàng)目“柳桉、邊沁桉早期選擇與無性系開發(fā)研究”（ZL2014－03）。

劉均利（1982-），女，碩士，助理研究員，主要從事林木育種和組織培養(yǎng)研究。