中藥治療對HIV感染者T細胞表面PD—1和Tim—3表達水平干預的研究

楊玉琪+王紅梅+宋娜麗+賀錚錚+孫俊+蔡怡

摘要：目的探討中藥對HIV感染者T細胞表面PD-1和Tim-3表達水平變化的影響。方法用流式細胞分析術分別檢測用中藥扶正抗毒丸或康愛保生丸治療和未治療的HIV感染者治療前后T細胞亞群計數和T細胞表面PD-1和Tim-3表達。結果經中藥扶正抗毒丸或康愛保生丸治療的HIV感染者外周血CD4+T細胞計數維持在一定水平，T細胞表面PD-1和Tim-3表達下降，PD-1CD4陽性細胞百分比從044%下降到034%；而未治療的HIV感染者的CD4+T細胞計數下降，平均下降幅度為55cell/μL，T細胞表面PD-1和Tim-3表達上升，PD-1CD4陽性細胞百分比從031%上升到039%，Tim-3CD8陽性細胞百分比從591%上升到673%。結論中藥扶正抗毒丸或康愛保生丸治療HIV感染，一定時間內可以穩(wěn)定HIV感染者的CD4+T細胞計數，調節(jié)CD4+T、CD8+T細胞表面PD-1和Tim-3表達，對延緩病程起到積極作用。

關鍵詞：艾滋病病毒感染；程序性死亡分子1；T細胞免疫球蛋白及黏蛋白結構域分子3；扶正抗毒丸；康愛保生丸

中圖分類號：R51291文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2016）09-0076-03

程序性死亡分子1（Programmed death-1 PD-1）和T細胞免疫球蛋白及黏蛋白結構域分子3（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain molecule-3 Tim-3）是近期發(fā)現的T細胞表面的共刺激分子，它們分別與各自的配體PD-L和Galectin-9結合并傳遞抑制性的第二信號[1-2]。研究表明[3-4]HIV感染者的T細胞表面增強表達PD-1和Tim-3，且其變化特征與疾病進展密切相關。中藥能調節(jié)免疫進而延緩艾滋病病程進展是否與T細胞表面PD-1和Tim-3水平表達有關？為此，筆者分析了中醫(yī)藥治療和未治療的HIV感染者治療前后外周血T細胞亞群計數和T細胞表面PD-1和Tim-3表達變化，現報道如下。

1資料和方法

11一般資料于2014年3月—2015年11月期間在云南省紅河州建水縣中醫(yī)醫(yī)院和建水縣疾控中心診治的HIV感染者44例。根據其自愿接受中醫(yī)藥治療是否，分為中藥治療組和自然病程對照組，其中中藥治療組24例，3例為II-B期患者，CD4+T細胞為200-349 cell/μL，21例為II-A期患者，CD4+T細胞為≥350 cell/μL；自然病程對照組20例，4例為II-B期患者，CD4+T細胞為200-349 cell/μL，16例為II-A期患者，CD4+T細胞為≥350 cell/μL；所有HIV感染者臨床表現均未出現艾滋病指征性疾病。所有HIV感染者均簽定知情同意書，經單位倫理委員會同意。

12診斷標準符合《中國艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標準》[5]中HIV感染者的相關診斷標準。

13納入標準符合HIV感染者相關診斷標準，經蛋白印跡法檢查確認HIV抗體為陽性，既往無抗HIV感染的藥物治療史。

14治療方案自然病程對照組：根據患者的意愿，未采取與HIV感染相關治療，只定期隨訪。中藥治療組：按照中國中醫(yī)科學院中醫(yī)藥防治艾滋病研究中心和中華中醫(yī)藥學會艾滋病分會主編的《艾滋病中醫(yī)藥治療手冊》有關規(guī)定[6]，對HIV感染者開展免費中醫(yī)藥關懷救治，根據患者病情、癥狀分別給予口服扶正抗毒丸、康愛保生丸，或兩種制劑交替使用治療，每次3g，每日4次，連續(xù)治療12個月。扶正抗毒丸：滇藥制字（Z）20090003A，處方由黃芪、黃精、白術、女貞子等組成，具有益氣養(yǎng)陰，滋腎健脾，清熱解毒，每1g丸劑相當原生藥44g，成人日用劑量為528g生藥?？祼郾Ｉ瑁旱崴幹谱郑╖）20090006A，處方由紫花地丁、黃芩、桑白皮、人參等組成，具有解毒清熱，活血祛濕，養(yǎng)陰益氣，每1g丸劑相當原生藥35g，成人日用劑量為420g生藥。扶正抗毒丸或康愛保生丸均為云南省中醫(yī)藥治療艾滋病試點項目用藥，由云南省中醫(yī)中藥研究院附屬醫(yī)院提供。

15觀察指標定期隨訪，觀察患者的病情及臨床癥狀體征變化，于治療前后分別檢測患者外周血CD4+T細胞計數、CD8+T細胞計數以及CD4+T、CD8+T細胞表面表達PD-1和Tim-3的陽性細胞百分率。

16實驗室檢查采集EDTA-K2抗凝靜脈血，常溫下保存和運輸，避免極端溫度（冷凍或過熱），24 h內用美國BD公司FACSCalibur全自動雙激光四色流式細胞儀進行檢測。采用微量全血法，分別用CD3/CD4/CD8三色熒光抗體、APC-PD-1和APC-Tim-3抗體標記，用CellQuest Pro軟件分析CD4+T細胞計數、CD8+T細胞計數以及CD4+T、CD8+T細胞表面表達PD-1和Tim-3的陽性細胞百分率?？贵w購自美國BD公司，CD4/CD8/CD3三色熒光克隆抗體，No：39913，APC anti-human Tim-3，No：B173546，APC anti-human CD279（即PD-1），No：B171333。

17統(tǒng)計學方法全部資料均采用SPSS 170統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料數據以表示，治療前后數據的比較運用配對樣本T檢驗分析。以P<005為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

21一般情況44例HIV感染者中，男24例，占5455%，女20例，占4545%，男女之比為120∶1；最大年齡64歲，最小年齡24歲，平均年齡42歲；可能感染途徑為性傳播30例，經靜脈吸毒感染7例，輸血感染1例，原因不明6例。

22HIV感染者治療前后CD4+、CD8+T淋巴細胞計數變化見表1。用中藥扶正抗毒丸或康愛保生丸治療12個月的HIV感染者CD4+T細胞計數、CD8+T細胞計數和CD4/CD8比值穩(wěn)定在一定范圍，治療前后比較無差異（P>005）。而未治療的HIV感染者CD4+T細胞計數下降，平均下降幅度達55 cell/μL，但與治療前比較，無明顯差異（P>005）。

3討論

近年共刺激分子在免疫調節(jié)中的作用越來越受到廣大研究者的重視，其中發(fā)揮負調節(jié)作用的共刺激分子PD-1和 Tim-3在 HIV 感染中的作用倍受關注。以往研究報道[7-9]，HIV感染者的T細胞表面增強表達PD-1和Tim-3，且其變化特征與疾病進展密切相關，PD-1和Tim-3在HIV特異CD8+和CD4+T細胞上的表達與血漿病毒載量成正相關，與CD4+T細胞計數成負相關。T細胞表面增強表達PD-1和Tim-3主要損傷了HIV特異性的CD8+T 細胞免疫反應。而在抗病毒免疫中，有效而強大的 T 細胞免疫應答是清除病毒的關鍵，病毒感染的持續(xù)和慢性化常常是由于效應和記憶性 T 細胞的功能缺陷所致。在抗HIV感染臨床治療中，如能針對T 細胞表面PD-1和Tim-3表達進行調節(jié)，使機體細胞免疫充分發(fā)揮抗HIV感染，可一定程度延緩HIV感染病程進展。

本研究結果：經過中藥扶正抗毒丸或康愛保生丸治療12個月的HIV感染者，CD4+T淋巴細胞計數維持在430個cell/μL以上，而未治療的HIV感染者CD4+T淋巴細胞計數從505個cell/μL下降到450個cell/μL，其下降速度與以往報道一致，提示中藥扶正抗毒丸或康愛保生丸對穩(wěn)定HIV感染者的CD4+T淋巴細胞計數有明顯作用。中藥治療的HIV感染者T細胞表面PD-1和Tim-3的表達與治療前比有所下降，而未治療的HIV感染者PD-1和Tim-3的表達升高，我們推測中藥扶正抗毒丸或康愛保生丸調節(jié)機體免疫功能可能與T細胞表面PD-1和Tim-3表達相關。

目前醫(yī)學界仍不能成功研究出徹底治愈艾滋病的方法，延緩病程進展、降低病死率、提高患者生存質量是當前臨床治療的主要目的。人體免疫系統(tǒng)是一個復雜的網絡，任何環(huán)節(jié)都是相關聯的，在HIV感染的情況下，其復雜性更加難以想象。中醫(yī)藥對機體的免疫調節(jié)作用可能涉及多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點，本研究結果提示中藥扶正抗毒丸或康愛保生丸治療后，HIV感染者CD8+和CD4+T細胞上PD-1和Tim-3表達水平下降，相應的PD-l/PD-L和Tim-3/Galectin-9這兩個信號通路就可能被阻斷或部分阻斷，HIV特異性CD4+和CD8+T 細胞功能可得到部分提高。這對于恢復HIV感染者免疫功能，控制 HIV 感染者病程進展起到積極作用，值得在臨床上進一步觀察研究。

參考文獻：

[1]史繼靜，劉朝奇PD-1及其配體PD-L在HIV感染中的作用[J]生命的化學，2010（30）：397-400

[2]趙慧，王亮，馬秀敏，等Tim-3及其配體Galectin-9與病毒感染的關系[J]基礎醫(yī)學與臨床，2012，32（9）：1095-1098

[3]Day CL，Kaufmann DE，Kiepiela P，etalPD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progressionNature，2006，443（7109）：350-354

[4]Jones RB，Ndhlovu LC，Barbour JD，et alTim-3 expression defines a novel population of dysfunctional T cells with highly elevated frequeneiesin progressive HIV-1 infeetionJ Exp Med，2008，205（12）：2763-2779

[5]中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準WS293-2008，艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標準

[6]中國中醫(yī)科學院中醫(yī)藥防治艾滋病研究中心和中華中醫(yī)藥學會艾滋病分會艾滋病中醫(yī)藥治療手冊[M]北京：中醫(yī)古籍出版社，2014：7-41