基于Ussing Chamber技術的紅景天苷大鼠腸黏膜透過性研究*

顧星，姚少姿，皮佳鑫，劉博纓，韓煦，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術教育部工程研究中心，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室－省部共建國家重點實驗室培育基地，天津300193）

·中藥研究·

基于Ussing Chamber技術的紅景天苷大鼠腸黏膜透過性研究*

顧星1，2，姚少姿1，2，皮佳鑫1，2，劉博纓1，2，韓煦1，2，劉志東1，2

（1.天津中醫(yī)藥大學，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術教育部工程研究中心，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室－省部共建國家重點實驗室培育基地，天津300193）

[目的]研究紅景天苷在大鼠離體腸黏膜中的透過情況。[方法]采用Ussing Chamber技術，考察不同濃度紅景天苷于大鼠腸黏膜透過情況，并考察維拉帕米（Ver）和十二烷基硫酸鈉（SDS）對紅景天苷大鼠腸黏膜透過的影響。[結果]不同濃度紅景天苷在大鼠不同腸段的單位時間轉(zhuǎn)運速率（Flux）隨濃度升高而增大，不同腸段表觀滲透系數(shù)（Papp）無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。Ver加入一定量的SDS后，紅景天苷在回腸和結腸的Papp顯著增加（P＜0.01或P＜0.05），當SDS濃度為2 g/L時，回腸Papp增加為對照組的2.76倍。[結論]紅景天苷在大鼠全腸段均有吸收，且吸收具有濃度依賴性，以被動吸收為主，Ver對紅景天苷大鼠各腸吸收無影響，SDS促進了紅景天苷回腸和結腸吸收。

紅景天苷；Ussing Chamber技術；P－糖蛋白；緊密連接；維拉帕米；十二烷基硫酸鈉

紅景天苷（Salidroside）是景天科紅景天屬（Rhodiola rosea L.）紅景天的主要藥效成分之一，具有耐缺氧、抗衰老，治療糖尿病、冠心病、肺源心臟病及老年癡呆癥，降血脂、降血糖，增強免疫功能，抗肝纖維化等作用[1]。紅景天苷屬于酚類物質(zhì)，極性大，親水性強，油水分配系數(shù)較小[2]，胃腸道黏膜透過性差，口服生物利用度低，從而影響了紅景天苷的療效充分發(fā)揮，限制了其廣泛應用。對于紅景天苷的口服吸收的機制還尚不明確，可能原因有腸黏膜緊密連接的阻礙[3]、主動外排作用[4]等。Ussing Chamber技術早期用于研究上皮組織的離子轉(zhuǎn)運，目前，其應用主要集中在藥學領域，具有快捷、簡便等特點，能在離體情況下模擬胃腸道生理環(huán)境，通過監(jiān)測組織的電生理變化，比較真實地反映上皮細胞在體內(nèi)的實時狀態(tài)，常用于藥物的滲透性和轉(zhuǎn)運機制的研究[5]。本實驗采用Ussing Chamber技術，以紅景天苷為模型藥物，初步研究紅景天苷在大鼠腸黏膜中的透過情況，為紅景天苷的進一步開發(fā)利用提供一定理論依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1實驗儀器Ussing Chamber儀器（美國生理儀器公司，信號采集系統(tǒng)為ADInstruments Pty Ltd，數(shù)據(jù)處理軟件為LabChart7.2）；超高效液相－質(zhì)譜/質(zhì)譜（UPLC－MS/MS，Agilent 1690型UPLC色譜儀，Agilent 6460 Triple Quad LC/MS型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀）；DKB－501A型水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；臺式通用冷凍離心機（美國Thermo Fisher公司）；XP205電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；ALC－110.4電子天平（德國ACCULAB公司）；Milli－Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2實驗材料紅景天苷（Salidroside/Sal，中新藥業(yè)，批號：W16－1－3，純度≥98.0%）；維拉帕米（Verapamil/Ver，Sigma，MDL No.：MFCD00055208，純度≥99.0%）；十二烷基硫酸鈉（SDS）、二水磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、無水氯化鈣（CaCl2）、氯化鈉（NaCl分析純）、氯化鉀（KCl）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、六水氯化鎂（MgCl2·6H2O）和葡萄糖（D－glucose）均為分析純。

1.3實驗動物健康SD大鼠，雄性，大鼠體質(zhì)量250～300 g，購買自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生環(huán)境醫(yī)學研究所，動物合格證號：SCXK－（軍）2014－0001。相關研究遵照動物實驗原則進行。

2　方法與結果

2.1溶液配制

2.1.1Krebs－Ringe（rK－R）溶液及K－R腸液的配制

稱取CaCl2：2.78 g，KCl：3.51 g，MgCl·26H2O：2.44 g，NaH2PO4·2H2O：1.44 g置于燒杯中，加去離子水500 mL充分溶解，即得儲備液；稱取NaCl：6.84 g，NaHCO3：2.10 g，D-glucose：1.98 g置于1 000 mL容量瓶中，加入適量去離子水充分溶解，加入儲備液50 mL，以去離子水定容搖勻，再通入混合氣體（95% O2-5%CO2）15 min，待pH值變?yōu)?.2-7.4時，即得K-R溶液。截取適宜長度的大鼠腸段，用冰浴過的生理鹽水沖洗干凈后，置于K-R溶液中，于37.5℃下共孵育一段時間，即得K-R腸溶液。

2.1.2對照品溶液配制取Sal對照品，精密稱量，以K-R溶液為溶劑制備成每1 mL含2.5 mg Sal的母液。

2.1.3供試品溶液配制分別精密吸取“2.1.2”項下的Sal對照品母液，用K-R溶液稀釋為50、100、200、400 mg/L Sal溶液。

分別精密吸取已配制的2.5 g/L Ver溶液和“2.1.2”項下的Sal對照品母液，用K-R溶液稀釋為100 mg/L Sal-100 mg/L Ver、100 mg/L Sal-200 mg/L Ver溶液[6]。

分別取SDS，精密稱量，加入K-R溶液溶解，再分別精密吸取“2.1.2”項下的Sal對照品母液，用KR溶液稀釋為100 mg/L Sal-0.5 g/L SDS、100 mg/L Sal-1g/LSDS、100mg/LSal-2g/L SDS溶液。

2.2Ussing Chamber實驗

2.2.1系統(tǒng)裝置準備Ussing Chamber系統(tǒng)主要由以下部分組成：尤斯室、電壓電流鉗、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)與數(shù)據(jù)分析軟件，另外有配有恒溫水浴箱、混合氣體（95%O2-5%CO2）循環(huán)系統(tǒng)等。將電極頭（由瓊脂糖、3 mol/mL KCl等組成）接入裝置，尤斯室兩邊各加入5 mL K-R溶液，將系統(tǒng)電壓和電流調(diào)零，以消除溶液和系統(tǒng)電阻對腸黏膜的影響。

2.2.2大鼠腸黏膜制備將大鼠禁食16-18 h后，斷頸處死，即刻開腹取出不同腸段。選擇十二指腸、空腸、回腸、結腸為考察腸段，每個腸段分別截取10-15 cm，用生理鹽水沖洗干凈，置入冰浴的K-R溶液中培養(yǎng)10 min。每個腸段剪取2-3 cm，于冰浴板上小心剝離漿膜層，將分離好的腸黏膜固定于樣本夾中即可。

2.2.3接收液收集與處理將制備好的樣本固定于尤斯室中，即刻于裝置的黏膜側(cè)和漿膜側(cè)分別加入5 mL K-R溶液，并開始采集各項電生理指標（鉗制電壓為5 mV，每1 min給1次電刺激，持續(xù)時間為0.2 s）。實驗中持續(xù)通入混合氣體（95%O2-5% CO2）、并于37.5℃水浴維持腸黏膜的生物活性，平衡15-20min待大鼠腸黏膜各項電生理指標穩(wěn)定后[7]，取出裝置中的K-R溶液，于黏膜側(cè)和漿膜側(cè)分別添加37.5℃水浴保溫的5 mL藥液和新鮮K-R溶液，并分別在加藥后15、30、60、90、120、150、180 min，從漿膜側(cè)取0.5 mL接收液并立即補加新鮮K-R溶液，將所取的接收液離心（12 000 r/min、4℃）10 min，取上清液于UPLC-MS/MS進樣分析。

2.3分析方法建立

2.3.1液相色譜-質(zhì)譜條件液相色譜條件：色譜柱為AgilentEclipsePlusC18柱（2．1mm×50mm，1．8μm），柱溫為30℃，進樣量3 μL，流速：0.3 mL/min。流動相為：乙腈（A）－水（B），0-1．5 min：9%-10%A，1．5- 3 min：10%－60%A，3-4 min：60%-9%A，4-6 min：9%A。

質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源（ESI），負離子模式，多級反應監(jiān)測（MRM），碰撞電壓為120 V，碰撞能0 eV，霧化氣流速為13.0 L/min，霧化氣溫度為350℃，檢測離子對為299.11→299.11 m/z。

2.3.2線性關系將Sal母液以空白K-R腸溶液依次稀釋濃度梯度為23.4、45.8、93.5、187.0、374.0、748.0、1 496.0、3 740.0 μg/L，于“2.4.1”項下的方法進樣分析，以濃度對峰面積做線性回歸得= 14.243X+30.318（r2＝0．999 1），表明Sal在23.4～3 740.0 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.3精密度將濃度分別為46.8、187.0、1496.0μg/L的Sal溶液測定日內(nèi)精密度RSD值分別為2.86%、1.70%、0.99%，日間精密度RSD值分別為6.18%、4.74%、3.91%。表明日內(nèi)、日間精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性將接收液分別于0、2、4、6、8、10、12 h于“2.4.1”項下的方法進樣分析。以峰面積計算RSD值為1.94%，說明樣品在12 h之內(nèi)測定穩(wěn)定性良好。

2.4數(shù)據(jù)處理

2.4.1單位面積累積透過量（Qtn）、單位面積轉(zhuǎn)運速率（Flux）[8]和表觀滲透系數(shù)（Papp）計算公式如下：

其中，ρtn為設計時間點擴散池接收側(cè)的藥物質(zhì)量濃度；0.5和5分別表示取樣體積和加入供試液的體積（mL）；

2.4.2腸黏膜跨膜電阻統(tǒng)計從開始記錄組織電生理參數(shù)起，各通道每1 min采集得到一個電阻值，再將每一個取樣時間點與上一個取樣時間點的該段時間內(nèi)所有電阻值取平均值，作為該取樣時間點的電阻值（給藥前平衡時間內(nèi)平均電阻值作為取樣時間點零時刻的電阻值）。

2.4.3統(tǒng)計學方法采用SPSS18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結果以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.5實驗結果

2.5.1大鼠腸黏膜活性研究在Ussing Chamber實驗過程中，通常以腸黏膜跨膜電阻來檢測或者評價組織完整性并反應其活性[5]。本實驗監(jiān)測了大鼠各離體腸段（Sal給藥濃度為100 mg/L）在180 min內(nèi)的跨膜電阻。由圖1結果可知，各腸段跨膜電阻值在一正常范圍值內(nèi)波動；十二指腸、空腸、回腸和結腸的平均跨膜電阻值分別為（77.45±40.78）Ω/0.5 cm2、（82.95±48.02）Ω/0.5 cm2、（75.65±33.00）Ω/0.5 cm2、（86.67±52.26）Ω/0.5 cm2。結果表明實驗時間內(nèi)腸黏膜的生物活性較好。

圖1　十二指腸、空腸、回腸和結腸的電阻值（n=11）Fig.1　Resistanceofduodenum,jejunum,ileumandcolon（n=11）

2.5.2不同濃度Sal腸黏膜的透過情況本實驗以Ussing Chamber技術，研究不同濃度的Sal溶液在大鼠腸黏膜的透過情況。Sal給藥濃度分別為50、100、200、400mg/L時，隨著濃度的增加，大鼠各個腸段（十二指腸、空腸、回腸和結腸）對Sal Flux顯著增加（P＜0.01）。而隨著Sal的濃度增加時，各腸段組內(nèi)的Papp差異無顯著性（P＞0.05）。不同濃度下十二指腸、空腸、回腸和結腸總的Papp（Total）分別為（6.30±1.86）×10－6cm/s、（7.26±2.09）×10－6cm/s、（6.17±2.11）×10－6cm/s和（6.67±1.46）×10－6cm/s，組間差異無顯著性（P＞0.05）。結果表明，Sal在大鼠全腸段均有吸收，無明顯的吸收窗，且Sal的腸吸收具有濃度依賴性，以被動吸收為主。結果見表1、表2。

表1　不同濃度Sal于大鼠各腸段的Flux（±s）Tab.1　Flux of Sal for different concentration in isolated different mesentery segments（±s）

表1　不同濃度Sal于大鼠各腸段的Flux（±s）Tab.1　Flux of Sal for different concentration in isolated different mesentery segments（±s）

注：與Sal給藥50 mg/L組比較，**P＜0.01。

Sal給藥濃度（mg/L）050 100 200 400動物數(shù)4 4 4 4 Flux[ng/(min·cm)]十二指腸空腸回腸結腸15.88±7.8723.52±9.4218.84±6.8022.07±5.34 38.46±11.85**39.52±7.76**35.63±8.52**38.54±8.74** 78.97±19.98**74.81±15.03**70.77±21.35**81.88±22.80** 170.30±28.87**205.70±49.98**171.09±81.09**151.66±26.82**

表2　不同濃度Sal在大鼠各腸段的Papp（±s）Tab.2　Pappof Sal for different concentration in isolated different mesentery segments（±s）

表2　不同濃度Sal在大鼠各腸段的Papp（±s）Tab.2　Pappof Sal for different concentration in isolated different mesentery segments（±s）

注：不同濃度下，不同腸段之間相互比較，P＞0.05。

Sal給藥濃度（mg/L）050 100 200動物數(shù)4 4 4 Papp（×10－6cm/s）十二指腸空腸回腸結腸5.29±2.627.80±3.126.19±2.237.37±1.78 6.27±1.936.52±1.265.58±1.196.42±1.46 6.56±1.716.21±1.235.89±1.806.57±1.77 4004 Total46.30±1.867.26±2.096.17±2.116.67±1.46 7.10±1.208.52±2.077.03±3.336.33±1.12

2.5.3Ver對Sal腸黏膜的透過影響Ver常被用作P－糖蛋白抑制劑來研究口服藥物的轉(zhuǎn)運機制[6，9－10]。本實驗分別以100、200 mg/L Sal給藥50 mg/L兩個給藥濃度作為對照，考察Ver對Sal大鼠腸黏膜吸收的影響[4]。由表3結果可知，100 mg/L Ver對100、200 mg/L Sal在大鼠各腸段吸收并無顯著促進作用（P＞0.05）。本實驗研究結果表明，大鼠離體腸黏膜對Sal的吸收可能沒有P－糖蛋白的參與。

表3　Ver對Sal大鼠腸黏膜Papp的影響（±s）Tab.3　Effects of Ver on Pappof Sal in isolated different mesentery segments（±s）

表3　Ver對Sal大鼠腸黏膜Papp的影響（±s）Tab.3　Effects of Ver on Pappof Sal in isolated different mesentery segments（±s）

組別對照(100 mg/L Sal) 100 mg/L Sal－100 mg/L Ver對照(200 mg/L Sal)動物數(shù)4 4 4 Papp（×10－6cm/s）十二指腸空腸回腸結腸6.27±1.936.52±1.265.58±1.196.42±1.46 8.08±2.195.81±0.866.78±2.397.80±3.04 6.56±1.716.21±1.235.89±1.806.57±1.77 200 mg/L Sal－100 mg/L Ver 46.96±4.154.47±1.157.73±2.518.46±1.88

2.5.4SDS對Sal腸黏膜的透過影響SDS是一種陰離子表面活性劑，屬于比較安全的口服吸收促進劑，打開緊密連接而促進藥物的吸收是其促滲的作用機制之一[11]。本實驗以100 mg/L Sal作為對照，考察不同濃度的SDS（濃度分別為0.5、1、2 g/L）對Sal的大鼠腸黏膜透過性影響。在十二指腸和空腸中，加入一定濃度的SDS，其Papp無顯著增加。在回腸中，隨著加入SDS濃度的升高，Papp顯著增加，當SDS濃度為2 g/L時，其Papp增加至15.42×10－6cm/s（P＜0.01），為對照組的2.76倍。在結腸中加入一定濃度的SDS，Papp也顯著增加（P＜0.05）。結果表明，一定濃度的SDS能夠顯著促進Sal在回腸和結腸的吸收。見表4。

表4　SDS對Sal大鼠腸黏膜Papp的影響（±s）Tab.4　Effects of SDS on Pappof Sal in isolated different mesentery segments（±s）

表4　SDS對Sal大鼠腸黏膜Papp的影響（±s）Tab.4　Effects of SDS on Pappof Sal in isolated different mesentery segments（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別動物對照(100 mg/L Sal) 100 mg/L Sal－0.5 g/L SDS 100 mg/L Sal－1 g/L SDS數(shù)4 4 4 Papp（×10－6cm/s）十二指腸空腸回腸結腸6.27±1.936.52±1.265.58±1.196.42±1.46 5.01±0.47 5.03±1.607.44±1.4110.00±0.72* 5.13±1.06 5.29±4.139.47±1.43*11.70±2.10* 100 mg/L Sal－2 g/L SDS45.10±1.02 7.95±2.71 15.42±4.82**10.00±2.27*

3　討論

3.1腸黏膜電生理及活性研究Ussing Chamber技術被國外學者譽為腸道屏障功能研究的金標準，常用于腸通透性、轉(zhuǎn)運機制及保護腸道屏障功能機制等方面的研究[12]，在實驗過程中，通過監(jiān)測腸黏膜跨膜電阻來檢測或者評價組織完整性以及反映其活性[13－14]。在Ungell等[15]利用Ussing Chamber技術的研究中，要求大鼠小腸組織的跨膜電阻不得小于70 Ω/cm2。本實驗在180 min內(nèi)監(jiān)測到各腸段黏膜跨膜電阻始終在一定范圍內(nèi)波動，表明腸黏膜完整且活性狀態(tài)良好[5]。而其他濃度的Sal（50、200、400 mg/L）以及加入Ver、SDS后，對腸黏膜的電阻值并無影響，各腸段的電阻值（數(shù)據(jù)未列出）均在正常范圍內(nèi)波動。在數(shù)據(jù)處理過程中，以跨膜電阻作為參考指標，將電阻值超出范圍的腸黏膜對應的相關參數(shù)不納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計，保證了實驗結果更為真實可靠。

3.2不同濃度Sal腸黏膜透過情況本實驗結果可知，各腸段對Sal均有吸收且吸收程度相當，Sal在大鼠腸黏膜中轉(zhuǎn)運具有濃度依賴性，主要以被動轉(zhuǎn)運為主。Watanabe等[16]以Ussing Chamber技術研究發(fā)現(xiàn)，當Papp＞2.5×10－5cm/s時，可以認為藥物容易被人體吸收。Sal極性較大，親水性強，屬于溶解性好的藥物，在本實驗中發(fā)現(xiàn)Sal于大鼠腸黏膜的累積百分透過率不足1%（數(shù)據(jù)未列出），按照口服藥物的生物藥劑學分類系統(tǒng)分類，Sal屬于高溶解性、低滲透性的Ⅲ類藥物，而按照定量生物藥劑學分類系統(tǒng)（QBCS）分類，由表2結果中各腸段的Papp(Total)可知，紅景天苷屬于邊界藥物（0.5＜q＜1，2×10－6＜Papp＜10－5，其中q為劑量數(shù)的倒數(shù)），對于該范圍內(nèi)的藥物，對其吸收程度與劑量數(shù)和滲透性的相關性難以作出肯定的預測[17]，仍需要廣泛而深入的研究和探討。

3.3Sal腸黏膜轉(zhuǎn)運機制研究口服藥物穿透小腸細胞的途徑主要是細胞內(nèi)途徑和細胞間途徑，藥物經(jīng)細胞內(nèi)途徑轉(zhuǎn)運的機制包括被動擴散、外排泵參與的被動擴散和載體參與的主動轉(zhuǎn)運3種；大多數(shù)難以通過細胞間途徑穿過生物膜的藥物主要通過細胞間途徑（與緊密連接相關）并以被動擴散的方式透過細胞膜，膜滲透性差的親水性或水溶性藥物的吸收及促進主要與細胞間的緊密連接相關[17]。Ver是經(jīng)典的P－糖蛋白抑制劑，而本實驗發(fā)現(xiàn)100 mg/L Ver對100、200 mg/L Sal在大鼠各腸段吸收并無促進作用，表明Sal的大鼠腸吸收并沒有P－糖蛋的參與，這與李科宇[4]以Caco－2模型研究Sal透過機制的結果并不一致，這可能與選擇不同的評價模型有關，相關問題還需深入研究。

SDS作為一種較安全的口服吸收促進劑，有學者以Caco－2模型證明了SDS可以打開緊密連接[11]從而促進藥物的吸收。根據(jù)本實驗結果，在十二指腸和空腸中，0.5、1、2 g/L SDS對Sal的吸收并無促進作用；而0.5、1、2 g/L SDS能夠顯著增加大鼠回腸和結腸對Sal的吸收，這可能與SDS打開了回腸和結腸上皮細胞間的緊密連接有關。當然，對于口服藥物在胃腸道中的轉(zhuǎn)運是一個相當復雜的過程，并不僅僅受單方面因素的影響，而是多方因素共同作用的結果。

總的來說，以Ussing Chamber技術在口服藥物腸通透性和轉(zhuǎn)運機制研究中，應用于難溶解性、低滲透性模型藥物較多[15－16，18]，并且適用性較強，但是對于易溶解性、低滲透性模型藥物的研究、尤其是對于轉(zhuǎn)運機制方面研究相對較少，其適用性還需深入研究。

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（本文編輯：高杉，滕曉東）

Study on permeabilities of Salidroside via rat mesentery mucosa by using Ussing Chamber

GU Xing1,2,YAO Shao-zi1,2,PI Jia-xin1,2,LIU Bo-ying1,2,HAN Xu1,2,LIU Zhi-dong1,2
（1.Engineering Research Center of Modern Chinese Medicine Discovery and Preparation Technique,Ministry of Education,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine-Province and Ministry Co-established State Key Laboratory Cultivation Base,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To investigate the permeability of salidroside in mesentery mucosa of rat ex vivo.[Methods]The Ussing Chamber was employed to investigate the ex vivo permeability in rat mesentery mucosa of salidroside with different concentrations or with the addition of verapamil and SDS.[Results]It was found that the Flux of salidroside was increased with the increasing concentration,and there was no difference(P＜0.05)in the apparent permeability coefficient(Papp)in different mesentery segments of rat.The Pappof salidroside got significantly increased in ileum and colon(P＜0.01 or P＜0.05),and reached to 2.76-fold compared with the control in ileum,when a certain amount of SDS was added in the donator side.[Conclusion]Salidroside could be slightly absorbed in all mesentery segments of rat with a passive concentration-dependent transportation.There were no effects of verapamil on permeation of salidroside,and SDS could significantly increase salidroside permeation in ileum and colon of rat.

salidroside;Ussing Chamber;P-gp;tight junction;verapamil;SDS

R285.5

A

1672-1519（2016）11－0689－05

新世紀優(yōu)秀人才支持計劃（NCET－12－1068）。

顧星（1988－），男，碩士研究生，主要從事中藥制劑研究。

劉志東，E－mail:lonerliuzd@163.com。

（2016-04-25）

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.11.15