和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮形態(tài)及細胞凋亡的影響*

2016-11-28 13:11:48黃春麗張德芹張青霞文靜

天津中醫(yī)藥 2016年11期

關鍵詞：去勢卵巢膠囊

黃春麗，張德芹，張青霞，文靜

（天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津300193）

·實驗研究·

和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮形態(tài)及細胞凋亡的影響*

黃春麗，張德芹，張青霞，文靜

（天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津300193）

[目的]研究和顏坤泰膠囊對卵巢去勢模型大鼠子宮形態(tài)及細胞凋亡的影響。[方法]以雌性去勢大鼠為動物模型，分為空白對照組，假手術組，模型組，補佳樂組，莉芙敏組，和顏坤泰膠囊8、4、2 g生藥/kg劑量組。給藥8周后，觀察藥物對子宮病理學的影響，檢測子宮細胞凋亡率及Bcl－2 mRNA、Bax mRNA和蛋白的表達。[結果]和顏坤泰膠囊可增加去勢大鼠子宮橫截面及壁厚，肌層面積及厚度，內(nèi)膜面積及厚度，上皮厚度和腺體數(shù)（P＜0.01，P＜0.05）；能降低去勢大鼠子宮細胞的凋亡率（P＜0.01，P＜0.05），升高子宮Bcl－2 mRNA和蛋白的表達（P＜0.01，P＜0.05），降低Bax mRNA和蛋白的表達（P＜0.01，P＜0.05）。[結論]和顏坤泰膠囊有一定的子宮營養(yǎng)作用，可通過調(diào)控Bcl－2和Bax基因與蛋白的表達來抑制子宮細胞的凋亡。

和顏坤泰膠囊；子宮形態(tài)學；細胞凋亡；Bcl－2 mRNA和蛋白；Bax mRNA和蛋白

更年期綜合征（CLS）是指婦女在絕經(jīng)前后由于卵巢功能衰退的內(nèi)分泌變化所引起的各器官系統(tǒng)的綜合證候群[1]，是女性特定階段的常見病和多發(fā)病，嚴重影響了更年期婦女的生活質量[2]。中醫(yī)藥治療更年期綜合征在臨床已開展多年[3－5]，除能顯著地改善臨床癥狀外，還有不良反應小的優(yōu)勢。目前用于研究更年期綜合征動物模型較多，卵巢去勢模型是其中一種較為經(jīng)典的動物模型，通過摘除卵巢切斷雌激素的來源造成雌激素低下的環(huán)境模擬更年期[6]，在圍絕經(jīng)期病癥模型的研究中用途較廣[7]。和顏坤泰膠囊由熟地黃、黃連、白芍、黃芩、阿膠、茯苓6味藥物組成，功能滋陰清熱、安神除煩，臨床用于治療更年期綜合征取得了良好的效果[8－9]。張紹芬、段燕康等[10－11]已做了和顏坤泰膠囊對更年期大鼠的部分基礎藥效學研究，實驗結果顯示和顏坤泰膠囊可調(diào)節(jié)雌激素水平明顯改善更年期各種癥狀，但其作用機制尚不明確。本課題組前期實驗表明和顏坤泰膠囊可較明顯的提高卵巢去勢大鼠的子宮系數(shù)，本實驗以卵巢去勢大鼠為更年期模型，通過對去卵巢大鼠子宮形態(tài)及細胞凋亡的檢測，從子宮細胞凋亡方面探討和顏坤泰膠囊治療更年期綜合征的作用機制，以期為其臨床應用提供更多實驗依據(jù)。

1　材料與儀器

1.1動物雌性SD大鼠，體質量（200±20）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物合格證編號：SCXK（京）2002－0003。實驗前1周飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學實驗動物中心，自由飲食，溫度18～22℃。

1.2藥物和顏泰膠囊：貴陽新天藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號130107；莉芙敏：德國夏普天然藥物制藥公司產(chǎn)品，批號200801；補佳樂：DELPHARM LilleS.A.A生產(chǎn)，由拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司分包裝，批號074A。

1.3試劑與儀器Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號66008）；anscriptorFirststrandcDNASynthesisKit（美國Applied Biosystems公司，批號10274023）；BR Green PCR Master Mix（美國Applied Biosystems公司，批號11226200）；引物合成（上海生工生物工程股份有限公司合成）；Tunel試劑盒（Roche in situ cell death detection kit cat，批號11684817910）；Bcl－2抗體（ABCAM公司，批號AB7973）；Bax抗體（ABCAM公司，批號AB7977）；二抗（DAKO公司，批號K5007）；DBA顯色試劑盒（DAKO公司，批號K5007）。

ALLEGRA－64R高速離心機（美國Molecular Devices公司），PC－1000 PCR逆轉錄儀（美國PERKIN ELMER公司），CFX96型Real－Time PCR儀（美國Bio－Red公司），BMJ－1生物組織包埋機（天津航空機電公司），ASP300S全自動封閉脫水機（LEICA公司），RM2135病理切片機（LEICA公司）。見表1。

表1　PCR引物序列Tab.1　Sequences primers of PCR

2　方法

2.1模型的建立參照文獻[12]卵巢去勢大鼠造模方法，選擇健康雌性SD大鼠64只，體質量（200±20）g，禁食12 h，以3.5%的水合氯醛腹腔注射麻醉，將大鼠俯臥置于固定臺上，從背部最末肋骨下，在腋中線和距脊柱外側約2 cm交叉處，剪除長毛，用安爾碘消毒后切開皮膚和背肌約1.5 cm，切口視野中可見一乳白色發(fā)亮的脂肪團，卵巢即包埋其中，用小鑷子輕輕夾住脂肪團拉出切口外，分離脂肪團，可見一團細線狀不規(guī)則呈黃紅色的卵巢，剪取時先將卵巢下輸卵管（包括脂肪）用細線結扎，再摘除卵巢，術后順勢將子宮角送回腹腔中，用青霉素清洗創(chuàng)口，縫合肌肉及皮膚，同法摘除另側卵巢。留取其中8只大鼠做假手術，方法同上，找出卵巢不摘除。大鼠術后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素以防感染。術后第5天開始陰道涂片觀察持續(xù)5 d，每日1次，呈現(xiàn)不規(guī)則動情周期的即為造模成功。

2.2分組及給藥選擇符合模型標準的大鼠48只，按隨機數(shù)字表法分為6組，模型組，補佳樂組，莉芙敏組，和顏坤泰膠囊高、中、低劑量組，以及假手術組和正常組，每組8只。補佳樂組按0.2 mg/kg灌胃給予；莉芙敏組劑量為60 mg生藥/kg；和顏坤泰膠囊高、中、低劑量組分別為：8、4、2g生藥/kg；各組每日灌胃1次，連續(xù)8周，每次用藥體積按每100g體質量灌胃1mL。模型組，假手術組及正常組灌胃等體積的蒸餾水。計算用藥治療期間各組大鼠每日均飼以普通飼料，自由進食、飲水，每周稱質量1次。

2.3標本采集給藥8周后，末次給藥前禁食12 h，給藥1 h后，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，3 500 r/min，離心15 min，分離血清，分裝凍存?zhèn)溆?；迅速摘除子宮剝離周圍脂肪組織，一半浸入10%福爾馬林溶液，用于病理及免疫組化檢測。一半凍存，用于RT-PCR檢測。

2.4指標檢測

2.4.1子宮病理的檢測取出浸于福爾馬林溶液中的固定好的子宮組織，通過改刀成所需大小，放入包埋盒內(nèi)并做標記，放入全自動封閉脫水機脫水，二甲苯透明，在全自動包埋機上對組織進行石蠟包埋。包埋后的蠟塊進行切片，石蠟切片厚度為4 μm，水浴鍋中伸展，裱于干凈載玻片上，62℃烤片3 h，二甲苯脫蠟10 min，蘇木精-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片。利用高倍倒置顯微鏡對所得病理片進行觀察，拍照，用Image-Pru Plus 6.0軟件進行統(tǒng)計。

2.4.2子宮細胞凋亡檢測同上將固定好的子宮組織脫水，包埋，切片后脫蠟至水，用Tunel試劑盒測子宮細胞凋亡率，操作按說明進行，將子宮切片常規(guī)脫蠟至水，滴加末端標記酶及熒光抗體，DAB顯色，蘇木素復染，顯微鏡下檢測細胞凋亡情況（細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即為凋亡細胞），采用Image-Pro Plus 6.0顯微圖像分析系統(tǒng)掃描后并分析結果，每張切片隨機挑選3個視野，以陽性染色細胞百分比代表細胞凋亡率。

2.4.3子宮Bcl-2和Bax蛋白的檢測切片脫蠟后置入乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修復緩沖液（pH8.0）的修復盒中進行抗原修復，放入3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，加一抗，4℃孵育過夜。加二抗，室溫孵育50 min。DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。蘇木素復染細胞核，鹽酸酒精分化，脫水，中性樹膠封片。每個組織隨機挑選3個高倍鏡下視野進行拍照。應用Image-Pro Plus 6.0軟件對每張照片進行分析得出每張照片陽性面積的比率（陽性面積/總面積）即為陽性面積百分比。

2.4.4子宮Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的檢測采用RT-PCR法檢測，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成序列見表1。取子宮組織，加入1 mL Trizol按說明提取RNA并檢測其濃度與純度，A260/ A280在1.8-2.0即可。按照Transcriptor First strand cDNASynthesis試劑盒說明書進行反轉錄，反應條件：25℃10 min，48℃30 min，95℃5min。聚合酶反應，其中逆轉錄產(chǎn)物0.5 μL，PCR主反應液12.5 μL，上下游引物1 μL，加無酶雙蒸水至總反應體系25 μL，反應條件：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，40 cycles。以β-actin作為參照基因，用2-△△CT方法計算各基因的相對表達量。

2.5統(tǒng)計學方法實驗結果用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析，結果以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3　結果

3.1和顏坤泰膠囊對去勢大鼠子宮橫截面積和厚度的影響給藥8周后，與正常組相比，模型組大鼠子宮橫截面積和子宮壁厚顯著減?。≒＜0.01）；與模型組相比，和顏坤泰膠囊低劑量組（2g/kg）子宮橫截面積顯著增加（P＜0.05），和顏泰膠囊中、低（4、2 g/kg）劑量組子宮壁厚顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；補佳樂組子宮橫截面積及子宮壁厚顯著增加（P＜0.01）。結果見表2。

表2　和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮橫截面和厚度的影響（±s）Tab.2　Effects of Heyan Kuntai capsules on cross-sectional area and thickness in uterus of ovariectomized rats（±s）