22種中藥多糖對(duì)豬源金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性

陳希文+賴守勛+尹苗+周艷美+李蓮+汪謙+葉兆美+王雄清

摘要：采用超聲波輔助法對(duì)22種中藥多糖進(jìn)行提取，用牛津杯法和試管二倍稀釋法測(cè)定中藥多糖的抗菌活性。結(jié)果表明，川牛膝、黃芩、茯苓、地榆、虎杖等5種中藥多糖對(duì)豬源金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌效果，抑菌圈在20 mm以上，最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）在3.9～7.8 mg/mL；9個(gè)復(fù)方提取物的體外抑菌結(jié)果表明，以黃芩、地榆、大黃、虎杖等中藥為主的復(fù)方對(duì)豬源金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌活性，其最大抑菌圈直徑可達(dá)27.6 mm，MIC和MBC為3.9 mg/mL，表明它們?cè)诳咕追矫婢哂休^高的藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值，在中藥組方時(shí)可優(yōu)先考慮。

關(guān)鍵詞：中藥多糖；金黃色葡萄球菌；抑菌活性；MIC；MBC；中藥復(fù)方

中圖分類號(hào)： S853.7；S855.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0264-03

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）簡(jiǎn)稱金葡菌，是一種常見(jiàn)的人畜共患病原菌，其在人醫(yī)臨床上常引起皮膚、口腔以及鼻腔黏膜等組織局部化膿感染，也可引起肺炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、腸炎以及尿路感染等；在獸醫(yī)臨床常引起仔豬滲出性皮炎、牛羊乳房炎和子宮內(nèi)膜炎、犬貓鼻炎以及雞水腫病等多種動(dòng)物疾病，若不及時(shí)治療常引起敗血癥、膿毒癥等全身感染導(dǎo)致動(dòng)物死亡[1-3]。此外，由于金黃色葡萄球菌可以通過(guò)各種方式污染食品，因此該菌也是食品安全領(lǐng)域引起食物中毒的重要致病菌之一[4-6]。

近年來(lái)，隨著養(yǎng)豬規(guī)模的不斷擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的不斷增加，豬細(xì)菌性疾病的發(fā)生更加復(fù)雜嚴(yán)重，其中由金黃色葡萄球菌引起的仔豬滲出性皮炎在規(guī)?；i場(chǎng)也日趨嚴(yán)重。然而，由于抗菌素在獸醫(yī)臨床的濫用，細(xì)菌耐藥問(wèn)題越來(lái)越突出[7-8]，臨床很難篩選得到對(duì)金葡菌敏感的藥物，一旦發(fā)病，死淘率可高達(dá)90%，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。中藥因其具有營(yíng)養(yǎng)、保健、促生長(zhǎng)以及藥用低毒、低殘留和不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，已逐漸被國(guó)內(nèi)外研究者重視[9-11]，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)很多致病菌具有較強(qiáng)的抑制作用，有望成為抗菌素的替代藥物或輔助藥物。同時(shí)，隨著社會(huì)對(duì)食品安全及無(wú)抗養(yǎng)殖的重視和關(guān)注，篩選對(duì)致病菌敏感、高效、低毒、低殘留的中藥來(lái)防控動(dòng)物疾病已經(jīng)成為當(dāng)前獸醫(yī)工作者研究的熱點(diǎn)和趨勢(shì)，也是發(fā)展健康無(wú)抗養(yǎng)殖急需解決的1個(gè)重要課題。本研究選擇多糖含量較高的22種中藥，采用超聲波輔助法提取其多糖化合物，研究其對(duì)豬源金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性，以期為獸醫(yī)臨床合理用藥、有效防控豬金黃色葡萄球菌病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 中藥材

22種常用中藥材 地榆（陜西）、大黃（四川）、虎杖（四川）、丹參（四川）、甘草（甘肅）、石榴皮（河南）、黃芪（陜西）、黃芩（甘肅）、茯苓（湖南）、苦參（內(nèi)蒙古）、黃連（四川）、魚(yú)腥草（四川）、柴胡（四川）、枸杞（寧夏）、白術(shù)（浙江）、升麻（陜西）、大棗（新疆）、何首烏（四川）、黨參（四川）、山茱萸（陜西）、大葉茜草（四川）、川牛膝（四川）和蒲公英（貴州），購(gòu)自綿陽(yáng)天源堂大藥房。根據(jù)中藥復(fù)方的組方原則[12]，選擇單味抑菌活性較好的中藥輔以補(bǔ)益理氣等藥物，組成9個(gè)復(fù)方，具體情況見(jiàn)表1。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、SS 培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基等，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；微量生化發(fā)酵管，購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、正丁醇、無(wú)水乙醇、丙酮等常規(guī)藥品為化學(xué)純，購(gòu)自綿陽(yáng)市信捷商貿(mào)有限責(zé)任公司。

1.3 供試菌種

豬源金黃色葡萄球菌，分離自綿陽(yáng)市某規(guī)?；i場(chǎng)仔豬滲出性皮炎病豬，由綿陽(yáng)師范學(xué)院動(dòng)物應(yīng)用技術(shù)研究所鑒定保存。

1.4 中藥多糖的提取

稱取干燥、粉碎后的中藥10 g，放入250 mL燒杯中，加入20倍的蒸餾水，65 ℃下超聲波提取15 min，2層醫(yī)用紗布過(guò)濾得提取液，濾渣重復(fù)上述操作，共得到3次提取液，合并3次提取液，低速離心10 min取上清液；濃縮至25 mL，以1 ∶3比例加入 95%乙醇，靜置1夜，次日于離心機(jī)以 3 000 r/min 離心 20 min，去除上清液得到多糖沉淀，加蒸餾水定容至10 mL；加入 Sevage 試劑（正丁醇 ∶三氯甲烷=4 ∶1，Sevage ∶濾液=1 ∶5），3 000 r/min離心10 min，取上清液，重復(fù)2次可有效除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，定容10 mL，具體方法參考文獻(xiàn)[13-15]。全部藥液用立式壓力蒸汽滅菌器，121 ℃滅菌15 min，取出后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 菌懸液的制備

將保存的豬源金黃色葡萄球菌活化后，接種于普通瓊脂斜面培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng) 18～24 h，每支斜面加入 1.5 mL滅菌蒸餾水，洗下菌液，調(diào)整細(xì)菌濃度為150萬(wàn)CFU/mL備用，具體方法參考文獻(xiàn)[16]。

1.6 體外抑菌活性的測(cè)定

采用牛津杯法，將滅菌后的液體培養(yǎng)基倒入平板內(nèi)，待其凝固后，用微量移液器吸取 0.1 mL稀釋到一定濃度的菌懸液，滴入平板，用涂布器涂勻，用鑷子輕輕在每個(gè)培養(yǎng)皿中等距離放入4個(gè)牛津杯，用微量加樣器吸入含生藥1 g/mL 的中藥多糖溶液0.2 mL于對(duì)應(yīng)牛津杯中，置于37 ℃條件下，恒溫培養(yǎng)18～24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，具體參照文獻(xiàn)[17]。

1.7 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

采用試管二倍稀釋法，每11支為1組，在1～11號(hào)試管中各加入2 mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯，在1號(hào)試管中加入2 mL含生藥1 g/mL 的中藥多糖溶液混勻，取出 2.0 mL放入第 2管中，依次類推，直到第 9管取出2.0 mL棄去，則1～9號(hào)試管混合液中藥提取物濃度依次為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、0.9 mg/mL，10號(hào)試管不含中藥作對(duì)照，11號(hào)試管不加菌懸液觀察是否染菌。將稀釋成一定濃度的菌懸液用微量移液器吸取0.1 mL于1～10號(hào)試管中，37 ℃振蕩培養(yǎng)18～24 h。觀察透明無(wú)渾濁試管，選出濃度最低的試管藥液，即為這種藥物對(duì)該細(xì)菌的最小抑菌濃度（ MIC），具體方法參照文獻(xiàn)[18]。

1.8 最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

將上述選出的透明無(wú)渾濁試管，吸取菌藥液0.1 mL加入培養(yǎng)基中，用涂布器涂布均勻，置于37 ℃恒溫養(yǎng) 24 h。以99.9%殺死試驗(yàn)菌菌體的藥物最高稀釋度為最低殺菌濃度（MBC），具體方法參照文獻(xiàn)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單味中藥多糖的抑菌活性

由表2可知，22種中藥多糖的初提物對(duì)豬源金黃色葡萄球菌的抑菌效果存在較大差異，其中川牛膝的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑25.3 mm，MIC和MBC均為3.9 mg/mL，其次是黃芩、茯苓、地榆、虎杖等中藥，其抑菌圈直徑均在20 mm以上，具有極強(qiáng)的抑菌活性；而大棗、黨參和大葉茜草3種中藥對(duì)豬源金黃色葡萄球菌沒(méi)有明顯的抑菌效果。

2.2 復(fù)方中藥多糖的抑菌活性

由表3可知，復(fù)方3和復(fù)方7明顯比各單味藥的抑菌效果都明顯增強(qiáng)，對(duì)豬源金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為26.3、27.6 mm，MIC和MBC均為3.9 mg/mL；而復(fù)方5和復(fù)方9均出現(xiàn)抗菌能力降低的現(xiàn)象。

3 結(jié)論與討論

中藥多糖的提取方法較多，不同的提取方法可影響其抑菌效果。其中，浸提法和醇沉法是傳統(tǒng)常用的提取方法，其利用多糖不溶于乙醇的性質(zhì)，在濃縮液中加乙醇，使多糖從提取液中沉淀出來(lái)。但因水的極性大，容易把蛋白質(zhì)、苷類等水溶性成分浸提出來(lái)，使提取液存放時(shí)易腐敗變質(zhì)，為后續(xù)的分離帶來(lái)困難，同時(shí)該法提取比較耗時(shí)，提取率也不高[21]，因此其使用受到限制。近年來(lái)，隨著超聲波技術(shù)的蓬勃發(fā)展，超聲波提取技術(shù)（ultrasound extraction，UE）已成為提取中藥有效成分的一種新方法，其具有低溫、常壓、安全、效率高、雜質(zhì)少、能耗低等優(yōu)點(diǎn)[22]。該法影響提取率的主要因素有時(shí)間、溫度、提取次數(shù)和料液比等[23]，本研究通過(guò)條件優(yōu)化，確定了提取時(shí)間20 min、提取溫度65 ℃、料液比1 g ∶20 mL、提取次數(shù)3次的最佳提取條件，結(jié)果表明，該法操作簡(jiǎn)單、高效、方便，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ奶崛》椒?，值得在中藥提取?shí)踐中推薦使用。

在抑菌試驗(yàn)中，采用牛津杯法測(cè)定抑菌圈大小、試管二倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），是測(cè)定藥物效價(jià)和活性的通用方法，也是各國(guó)藥典規(guī)定的方法[24]。從本研究結(jié)果看，22種中藥抑菌圈大小、MIC和MBC三者之間的數(shù)據(jù)相關(guān)性基本相符合，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果可靠。單味中藥的抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，22種中藥多糖的提取物對(duì)豬源金黃色葡萄球菌的抑菌效果存在較大差異，其中川牛膝的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑25.3 mm，MIC和MBC均為3.9 mg/mL；其次是黃芩、茯苓、地榆、虎杖等中藥，其抑菌圈直徑均在20 mm以上，也具有較強(qiáng)的抑菌活性；而大葉茜草、大棗和黨參3種中藥對(duì)豬源金黃色葡萄球菌沒(méi)有明顯的抑菌效果。綜合比較分析發(fā)現(xiàn)，22種中藥的整體抑菌強(qiáng)弱順序?yàn)榇ㄅＯ?gt;黃芩>茯苓>地榆>虎杖>大黃>石榴皮>丹參>何首烏>柴胡>黃芪>蒲公英>升麻>甘草>山茱萸>枸杞>苦參>魚(yú)腥草>黃連>大葉茜草=大棗=黨參。川牛膝因具有祛風(fēng)利濕、通經(jīng)活血等功效，常用于產(chǎn)后跌打損傷、胞衣不下、尿血血淋、風(fēng)濕痹痛等病癥[25]，未見(jiàn)其有抗菌抑菌作用的報(bào)道，而本研究結(jié)果表明川牛膝在22種中藥中抑菌活性最強(qiáng)，提示川牛膝可能在抗菌消炎藥方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值，這為川牛膝的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了參考。楊海燕等研究結(jié)果表明，黃芩、茯苓、地榆、虎杖等中藥對(duì)金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑制作用，與本研究結(jié)果相符，說(shuō)明這些中藥在抗菌中藥的開(kāi)發(fā)中具有良好的應(yīng)用前景[26-28]。但在具體的抑菌圈大小和MIC或MBC數(shù)值上，本研究結(jié)果與相關(guān)報(bào)道又存在一定差異，其原因可能與中藥的產(chǎn)地、提取方法、以及抑菌試驗(yàn)測(cè)定方法的不同等有關(guān)，說(shuō)明在應(yīng)用中藥時(shí)要充分考慮這些因素的影響。值得注意的是，在黨參多糖提取物的抑菌試驗(yàn)中，不僅沒(méi)有出現(xiàn)抑菌圈，并且在裝有黨參多糖提取物的牛津杯周圍，金黃色葡萄球菌的菌落反而更加密集，說(shuō)明黨參多糖可能具有促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，其具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

基于單味中藥的抑菌試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合中藥的配伍原則，筆者對(duì)9個(gè)中藥復(fù)方多糖提取物進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，以黃芩、地榆、大黃、虎杖等中藥為主的復(fù)方多糖提取物對(duì)豬源金葡菌具有良好的抑菌活性，其最好的組方抑菌圈直徑可達(dá)27.6 mm，MIC和MBC為3.9 mg/mL，表明它們?cè)诳咕椎确矫婢哂休^高的藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值，在中藥組方時(shí)可優(yōu)先考慮。MIC和MBC值是獸醫(yī)臨床選藥用藥的主要依據(jù)[29]。從本研究的MIC或MBC數(shù)值上看，某些復(fù)方中藥的MIC或MBC值低于單方，表明此復(fù)方效果優(yōu)于單方。而有些復(fù)方的MIC或MBC值高于單方，說(shuō)明可能是此類組方中含有無(wú)抑菌效果或抑菌效果差藥物，從而使得復(fù)方制劑總質(zhì)量增加而有效活性物質(zhì)降低的結(jié)果，如本研究中的黨參、黃連、白術(shù)等中藥組方。但是，由于復(fù)方藥物是基于動(dòng)物機(jī)體整體出發(fā)，兼顧了各種藥物成分的藥理、藥性以及之間的相互作用，發(fā)揮的是不同藥物的復(fù)合作用和對(duì)機(jī)體的整體效應(yīng)。因此，在抑菌活性相差不大的情況下，中藥復(fù)方在動(dòng)物疾病的防控方面可能較單方更合理、更有效、更科學(xué)，而對(duì)于不同復(fù)方究竟在臨床生產(chǎn)中的運(yùn)用效果如何仍需要進(jìn)一步研究。

金黃色葡萄球菌是一種分布廣泛且對(duì)人類和動(dòng)物危害嚴(yán)重的病原菌，篩選有效藥物控制該病不僅可降低畜禽養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)對(duì)人類健康和食品安全具有重要意義。中藥作為我國(guó)的優(yōu)勢(shì)國(guó)藥，其資源豐富，來(lái)源廣泛，具有作用廣泛、毒副作用小和不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，是抗生素替代藥物研究的新方向，對(duì)疾病的預(yù)防和治療具有廣闊的應(yīng)用前景，本研究結(jié)果可為獸醫(yī)臨床合理用藥、有效防控豬葡萄球菌病提供科學(xué)參考。

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