淡黃花百合珠芽誘導(dǎo)脫分化的研究

張翔宇+陳杰+吉云+嚴(yán)顯進(jìn)+王彩云+阮培均+王永

摘要：以淡黃花百合珠芽為試驗(yàn)材料，采用完全試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，研究不同濃度的6-BA、NAA組合對(duì)淡黃花百合珠芽愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：淡黃花百合珠芽誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/LNAA+1.0 mg/L6-BA，其誘導(dǎo)萌發(fā)時(shí)間為11 d，萌發(fā)率為100%，愈傷組織月平均直徑增長量3 cm以上。

關(guān)鍵詞：淡黃花百合；珠芽；脫分化

中圖分類號(hào)： S567.23+9.043 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0058-03

淡黃花百合（Lilium sulphureum.Baker）為百合科百合屬多年生草本植物，集藥食兩用及觀賞于一身[1]。其花、梗、鱗莖均可入藥，花和梗可用作止血藥，鱗莖可預(yù)防和治療肺結(jié)核、慢性氣管炎、咳嗽、肺氣腫、肺嗽咯血、體虛腫弱、瘡癰腫瘤等癥，若服食清蒸百合，還可治胃病、肝病、貧血等，是多種滋補(bǔ)藥的主藥[2]。百合的傳統(tǒng)繁殖方式主要有珠芽繁殖、子球繁殖、鱗片繁殖3種[3]。采用現(xiàn)代組織培養(yǎng)方式進(jìn)行百合種苗擴(kuò)繁，因其繁殖系數(shù)高而成為重要的繁殖方式之一，通過組織培養(yǎng)可快速得到大量百合種苗，是百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大趨勢。而要使百合組織培養(yǎng)與生產(chǎn)銜接，關(guān)鍵是要針對(duì)不同品種制定與之相匹配的組培快繁方案[4]。組織培養(yǎng)方法可促進(jìn)百合商品種球的生產(chǎn)和百合新品種的培育[5]。

目前對(duì)百合誘導(dǎo)脫分化的報(bào)道較多。劉芬等用花絲誘導(dǎo)蘭州百合愈傷組織時(shí)發(fā)現(xiàn)，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA是誘導(dǎo)蘭州百合花絲愈傷組織形成的理想培養(yǎng)基[6]；申玉華等以西伯利亞百合花托為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基[7]；李黛等以淡黃花百合鱗莖為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)愈傷組織增殖的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L6-BA+1 mg/L NAA+3%蔗糖[8]；郭海濱等以卷丹百合鱗片及珠芽為外植體進(jìn)行研究認(rèn)為，MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA誘導(dǎo)不定芽和愈傷組織數(shù)量較多，生長勢強(qiáng)，愈傷組織顆粒出現(xiàn)時(shí)間為20 d[9]。以上研究表明，對(duì)百合愈傷組織誘導(dǎo)大部分以MS為基本培養(yǎng)基附加不同濃度的6-BA和NAA，但不同種類百合愈傷組織誘導(dǎo)所用的6-BA與NAA的比例有較大差異。同時(shí)，沒有針對(duì)愈傷組織不同時(shí)期的增長量及生長情況的研究報(bào)道。由于愈傷組織不同時(shí)期的增長量及生長情況對(duì)于后期大規(guī)模誘導(dǎo)再分化出不定芽直至生產(chǎn)組培苗具有至關(guān)重要的影響。因此，本研究以淡黃花百合珠芽為外植體，研究不同濃度的6-BA和NAA組合對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)和愈傷組織直徑月平均生長量的影響，以期為淡黃花百合大規(guī)模組培育苗提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 外植體 野生淡黃花百合珠芽采自貴州省畢節(jié)市大方縣羊場鎮(zhèn)2年生淡黃花百合植株。

1.1.2 培養(yǎng)基 以MS為基本培養(yǎng)基，其中每個(gè)配方添加25 g/L 蔗糖，pH值為5.8～6.0，瓊脂添加量6.5 g/L。

1.2 方法

1.2.1 外植體滅菌 將采集的淡黃花百合珠芽帶回實(shí)驗(yàn)室，用自來水沖洗3 h，用鑷子將外層小鱗片剝下，放入燒杯中，加入1～2滴吐溫20，用玻棒攪拌2～3 min，放置30 min，將水倒掉，用紗布將外植體包好，用自來水沖洗1～2 h后，于超凈工作臺(tái)上用75%乙醇浸泡30 s左右，用無菌水沖洗3～4次，然后用0.1%氯化汞消毒8 min，無菌水沖洗6次以上，最后將滅菌后的外植體放入事先準(zhǔn)備好的無菌不銹鋼盤中，用濾紙吸干表面水分，即可得到接種用外植體。

1.2.2 外植體接種 用鑷子將準(zhǔn)備好的無菌外植體接種于不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基上（表1），每組接種5瓶，每瓶接種5個(gè)，每組3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 培養(yǎng) 接種后放在培養(yǎng)架上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：白天（25±3）℃，晚上（20±3）℃，濕度（85±5）%，光照度為1 000～1 200 lx，光照時(shí)間12 h /d。

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用2因素5水平完全設(shè)計(jì)方案（表1）。

1.3 項(xiàng)目測定

誘導(dǎo)時(shí)間t：外植體開始萌動(dòng)時(shí)的時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均采用 IBM SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間的影響

不同濃度的6-BA與NAA組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間的影響較大。通過對(duì)表2中誘導(dǎo)時(shí)間的直觀分析表明，處理7、處理9、處理10均可在10 d誘導(dǎo)珠芽愈傷組織萌動(dòng)，而其他處理的誘導(dǎo)時(shí)間相對(duì)延遲，其中處理22、處理23、處理25均需要17 d才可以誘導(dǎo)愈傷組織萌動(dòng)。由表3中誘導(dǎo)時(shí)間的Ⅲ型平方和可以看出，NAA的Ⅲ型平方和為334.080，大于6-BA 的7.680，這表明對(duì)淡黃花百合珠芽愈傷組織萌發(fā)時(shí)間的影響中，NAA起主要作用，6-BA起次要作用。從表2可看出，不同濃度NAA和6-BA對(duì)萌發(fā)時(shí)間的影響不同，低濃度的NAA誘導(dǎo)萌發(fā)的時(shí)間較短，高濃度NAA誘導(dǎo)萌發(fā)的時(shí)間較長，0.3 mg/L NAA與1.0 mg/L 6-BA組合能夠最快誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。

2.2 不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

不同濃度的6-BA與NAA組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率具有顯著性差異。從表2可以看出，處理15、處理20、處理21、處理25的誘導(dǎo)率較差，誘導(dǎo)率不到50%；而處理7、處理16、處理17的誘導(dǎo)率較好，均超過90%，其中處理7的誘導(dǎo)率可達(dá)100%。由表3中誘導(dǎo)率的Ⅲ型平方和可以看出，NAA的Ⅲ型平方和為7 055.290，小于6-BA的9 888.965，這表明對(duì)淡黃花百合珠芽愈傷組織誘導(dǎo)率的影響中，6-BA起主要作用， NAA起次要作用。0.3 mg/LNAA與1.0 mg/L 6-BA組合對(duì)珠芽愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，可達(dá)100%。

2.3 不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)愈傷組織月平均增長量的影響

不同濃度的6-BA與NAA組合對(duì)愈傷組織月平均增長量的影響具有顯著性差異。由表2可以看出，在第1個(gè)月，處理25的增長量最小，只有（0.92±0.01）cm，而處理7的增長量最大，可達(dá)（3.07±0.01）cm；在第2個(gè)月，處理25的增長量仍然最小，只有（1.06±0.06）cm，而處理7的增長量仍然最大，為（3.19±0.01）cm；在第3個(gè)月，處理21的增長量最小，為（1.03±0.01）cm，而處理7的增長量仍然最大，為（3.25±0.01）cm。不管是第1個(gè)月、第2個(gè)月還是第3個(gè)月，0.3 mg/L NAA與1.0 mg/L 6-BA組合的月平均直徑增長量均最大，其增長量均達(dá)3 cm以上。從表3中愈傷組織月平均增長量的Ⅲ型平方和可以看出，6-BA的影響均大于NAA，說明對(duì)于淡黃花百合珠芽愈傷組織的生長，6-BA起主要作用。從表4中愈傷組織生長情況來看，30 d時(shí)，愈傷組織顏色均為黃綠色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，誘導(dǎo)率高于70%的組合顏色能夠保持較好的生長色，愈傷組織比較疏松，利于增殖和分化（圖1-A）。而誘導(dǎo)率低于70%的組合顏色不能保持好的生長色，逐漸開始褐化，愈傷組織的生長狀態(tài)開始變得緊密，不利于增殖和分化（圖1-B）。結(jié)合表2和表4可以看出，雖然誘導(dǎo)率高于70%的組合顏色能夠保持再好的生長色，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，愈傷組織的月增長量出現(xiàn)規(guī)律性，即前60 d呈現(xiàn)生長加快的趨勢，60 d之后生長開始變緩。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用珠芽為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，采用2因素5水平完全試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案考察不同濃度NAA和6-BA組合對(duì)淡黃花百合珠芽誘導(dǎo)愈傷組織的影響。結(jié)果表明，MS+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA為淡黃花百合珠芽誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基不管是在誘導(dǎo)率、誘導(dǎo)時(shí)間，還是誘導(dǎo)愈傷組織月增長量方面均達(dá)到了最佳。研究還發(fā)現(xiàn)，低濃度的NAA誘導(dǎo)時(shí)間較快，高濃度NAA誘導(dǎo)時(shí)間較慢，NAA在誘導(dǎo)時(shí)間方面起主要作用，但在愈傷組織誘導(dǎo)率及愈傷組織的生長過程中6-BA卻起主要作用，這種現(xiàn)象在現(xiàn)有文獻(xiàn)中未提及。

劉芬等研究表明，誘導(dǎo)蘭州百合花絲愈傷組織形成的理想培養(yǎng)基是 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA[6]； 申玉華等研究表明，誘導(dǎo)西伯利亞百合花托產(chǎn)生愈傷組織的最佳培養(yǎng)基是MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA[7]；郭海濱等研究表明，誘導(dǎo)卷丹百合鱗片及珠芽產(chǎn)生愈傷組織的理想培養(yǎng)基為 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA[9]；周曉波等采用卷丹百合珠芽進(jìn)行脫毒快繁研究發(fā)現(xiàn)，MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA為誘導(dǎo)愈傷組織最佳培養(yǎng)基，而只使用6-BA與NAA組合的培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織少甚至沒有[10]。張文娥等的研究表明，MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA的誘導(dǎo)率為90.6%，而本試驗(yàn)中，MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA組合的誘導(dǎo)率為80%左右，誘導(dǎo)率相差10%左右[11]。李黛等的研究表明，誘導(dǎo)愈傷組織增殖的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L6-BA+1 mg/L NAA+3%蔗糖[8]，這與本研究在NAA和6-BA 的使用量方面有較大差異，這可能是由所用外植體不同所致。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果及上述分析認(rèn)為， 不同種類百合誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)添加的植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度差異較大，在進(jìn)行百合工廠化大規(guī)模育苗時(shí)，須根據(jù)所使用百合的種類，篩選出適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度組合。研究結(jié)果還表明，愈傷組織在不同時(shí)期的增長量及生長情況對(duì)于后期大規(guī)模誘導(dǎo)再分化出不定芽直至生產(chǎn)組培苗具有至關(guān)重要的影響。

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