二去水衛(wèi)矛醇對肺癌NCI-H460細胞DNA拓撲異構酶Ⅱ的抑制作用

黃銀妹，劉華鋼，蘇桂玉，李英杰，王小潔，蔣 霞

(1. 廣西醫(yī)科大學藥學院，廣西 南寧 530021；2．廣西食品藥品監(jiān)督管理局，廣西 南寧 530022；3．廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西 南寧 530001；4．暨南大學藥學院中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632；5．廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床藥學部，廣西 南寧 530021)

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二去水衛(wèi)矛醇對肺癌NCI-H460細胞DNA拓撲異構酶Ⅱ的抑制作用

黃銀妹1，劉華鋼2，蘇桂玉3，李英杰4，王小潔1，蔣 霞5

(1. 廣西醫(yī)科大學藥學院，廣西 南寧 530021；2．廣西食品藥品監(jiān)督管理局，廣西 南寧 530022；3．廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西 南寧 530001；4．暨南大學藥學院中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632；5．廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床藥學部，廣西 南寧 530021)

目的 評價二去水衛(wèi)矛醇(dianhydrogalactitol, DAG)在肺癌NCI-H460細胞上的抗腫瘤作用，探討其抗腫瘤作用機制。方法 采用CCK-8法、細胞克隆形成實驗，評價DAG對NCI-H460細胞的增殖抑制作用。顯微拍照觀察細胞形態(tài)改變；Hoechst 33342檢測細胞核染色質(zhì)的變化。Real time PCR法檢測拓撲異構酶Ⅱ(Topo Ⅱ)mRNA的表達水平。Western blot法檢測Topo Ⅱ蛋白表達水平。另外，應用計算機模擬分子對接技術來預測DAG與Topo Ⅱ的相互作用。

二去水衛(wèi)矛醇；肺癌；NCI-H460細胞；拓撲異構酶Ⅱ；拓撲異構酶Ⅱ抑制劑；分子對接

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，嚴重影響著人類的生命健康。在我國的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)中，肺癌的發(fā)病率和死亡率均位居第一位，是癌癥死亡的主要原因。在新增癌癥患者中，肺癌的發(fā)病率逐年上升。據(jù)估計，2015年我國肺癌患者新增病例數(shù)將會達到73.33萬人，死亡人數(shù)達到61.02萬人[1]。Topo Ⅱ?qū)τ谡婧思毎拇婊钇鹬匾淖饔?，其在DNA的復制、轉(zhuǎn)錄、重組過程中，以及在形成正確的染色體結構、染色體分離和濃縮中發(fā)揮著重要的作用[2]，是抗腫瘤藥物的重要靶標。Topo Ⅱ抑制劑按抑制機制可以分為催化抑制劑和毒劑，Topo Ⅱ催化抑制劑作用于Topo Ⅱ催化反應的各個不同階段，抑制Topo Ⅱ的催化活性；而Topo Ⅱ毒劑能夠捕獲并穩(wěn)定Topo Ⅱ催化過程的中間產(chǎn)物——可切割復合物，造成DNA雙鏈斷裂[3]。例如，阿克拉霉素和依托泊苷作為Topo Ⅱ抑制劑應用于臨床，但阿克拉霉素心臟毒性大，依托泊苷骨髓抑制作用較明顯。因此，尋找新型高效低毒的Topo Ⅱ抑制劑是目前迫切需要解決的問題。

從天然植物中提取化合物進行篩選和發(fā)掘，是開發(fā)高效低毒抗癌藥物的重要途徑。如從羅漢果分離出的羅漢果醇被證明具有誘導肺癌細胞A549 凋亡的作用[4]。二去水衛(wèi)矛醇(1,2:5,6-dianhydrogaIactitol, DAG)也是一種新型的植物生物堿類抗腫瘤藥，屬己糖醇類化合物，其化學名稱為1,2,5,6-二脫水半乳糖醇。DAG是主產(chǎn)于廣西的衛(wèi)矛科植物蜜花美登木(Meytenusconfertiflotus)中分離出的衛(wèi)矛醇(dulcitol)為原料[5]，經(jīng)溴化、消除反應而制得的1,6-二溴衛(wèi)矛醇的雙環(huán)氧化產(chǎn)物。其具有易溶于水，抗腫瘤活性高等優(yōu)點[6]。DAG目前已應用于臨床，主要用于慢性粒細胞性白血病的治療[7]。DAG對惡性膠質(zhì)瘤也有療效，目前已進入Ⅱ期臨床研究[8]。此外，DAG還對復發(fā)性腦瘤、胃癌、肝癌、鼻咽癌等均有抑制作用[9-10]。值得注意的是，DAG在臨床上也應用于肺癌的治療，且療效明顯[11]。然而，DAG抗肺癌作用機制尚不清楚。據(jù)研究報道，DAG抗腫瘤的主要機制是直接結合到DNA或RNA上，從而影響DNA的復制和轉(zhuǎn)錄[12]。然而，國內(nèi)外關于DAG與Topo Ⅱ相互作用的機制尚未報道。為此，本研究將探討DAG對肺癌細胞DNA Topo Ⅱ表達的影響，為DAG的臨床應用提供新的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 DAG由廣西梧州制藥(集團)股份有限公司提供；依托泊苷(VP16)為齊魯制藥有限公司產(chǎn)品；RPMI 1640培養(yǎng)基為美國Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清為浙江天杭生物科技股份有限公司產(chǎn)品；青霉素-鏈霉素為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；0.25%胰蛋白酶為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；CCK-8為上海尚寶生物科技有限公司產(chǎn)品；Hoechst 33342為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；Topo Ⅱα和Topo Ⅱβ抗體為美國Abcam公司產(chǎn)品；β-actin抗體和二抗均為美國CST公司產(chǎn)品。

1.1.2 細胞培養(yǎng) 人肺癌細胞NCI-H460購自中科院上海細胞庫。細胞接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，所用培養(yǎng)基含有RPMI 1640培養(yǎng)基、10%(V/V)胎牛血清與1%(V/V)青霉素-鏈霉素，在37℃、5%(V/V)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)；酶標儀(香港分子儀器公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司) ；蛋白免疫印記系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8實驗方法 取處于對數(shù)生長期的細胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入5.0×103個細胞。設空白組、對照組和不同濃度的給藥組，待細胞貼壁，加入不同濃度的藥物。藥物作用48 h后吸出培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8 10 μL，在培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，使用酶標儀在450 nm處測定吸光度，計算細胞存活率。同時，以依托泊苷做為陽性對照。使用Graphpad軟件計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.2 集落形成實驗 取處于對數(shù)生長期的細胞，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加入300個細胞。設空白對照組和不同濃度的給藥組，待細胞貼壁，加入不同濃度的藥物。同時，以依托泊苷做為陽性對照。藥物作用24 h后吸出培養(yǎng)基，同時加入5 mL新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后吸出培養(yǎng)基，用甲醇在-20℃條件下固定細胞30 min，加入結晶紫染色15 min， PBS清洗2次后，記錄每孔細胞團的數(shù)目。

1.2.3 細胞形態(tài)學觀察 取處于對數(shù)生長期的細胞，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加入3.0×105個細胞。設空白對照組和不同濃度的給藥組，24 h后，加入不同濃度的藥物。藥物作用24 h后吸出培養(yǎng)液，PBS清洗2次。在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，并隨機拍照。

1.2.4 Hoechst 33342染色 取處于對數(shù)生長期的細胞，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加入3.0×105個細胞。設空白對照組和不同濃度的給藥組，細胞貼壁后，加入不同濃度的藥物。藥物作用48 h后吸出培養(yǎng)基，用PBS清洗1次，每孔加入PBS(含1 g·L-1Hoechst 33342)，在37℃培養(yǎng)箱中避光孵育10 min。用PBS清洗2次，在激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm的熒光顯微鏡下隨機拍照。

1.2.5 Western blot 取處于對數(shù)生長的細胞，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加入3.0×105個細胞。培養(yǎng)24 h后，設置空白對照組和不同濃度的給藥組，作用48 h。收集各組細胞，采用RIPA裂解液裂解細胞后，離心收集上清。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，按每孔30 μg蛋白電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%(W/W)牛奶封閉后敷上Topo Ⅱα和Topo Ⅱβ抗體，以β-actin作為內(nèi)參。孵完一抗后，室溫下孵育二抗1 h，接著用ECL顯影液曝光顯影。蛋白條帶應用Image J軟件進行光密度值定量分析。

1.2.6 Real time PCR檢測Topo Ⅱ在肺癌NCI-H460細胞的表達 取處于對數(shù)生長期的細胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，每瓶加入1.0×106個細胞。設空白對照組和不同濃度的給藥組，待細胞貼壁，加入不同濃度的藥物。藥物作用48 h后，按照TRIzol裂解液說明書提取細胞總RNA。取2 μg RNA做逆轉(zhuǎn)錄模板，按照說明書合成cDNA。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。Topo Ⅱα上游序列：5′-TTGCAGCCCATTGGTCAGTT-3′，下游序列：5′-AGGACCACCCAGTACCGATT-3′。Topo Ⅱβ上游序列：5′-GTGCTGAGGGCATTGGTACT-3′，下游序列：5′-AGCAGCTTCTGCTTGTGCTA-3′。β-actin上游序列：5′-ACAGAGCCTCGCCTTTGCC-3′,下游序列：5′-GCGTACAGGGATAGCACAGC-3′。 Real time PCR反應體系為20 μL。應用SYBR Green試劑盒，在ABI7300 Real time PCR 系統(tǒng)中進行。

1.2.7 模擬分子對接 為了研究DAG與TOP Ⅱ的分子對接方式，我們運用了Sybyl 8.0軟件(Tripos Inc.)中的Surflex-dock模塊。人Topo Ⅱα ATPase(PDB code: 1ZXM)的晶體結構和Topo Ⅱβ(PDB code:3QX3)的晶體結構是從蛋白數(shù)據(jù)Protein Data Bank(PDB)中獲得[13-14]。DAG、沙爾威辛和依托泊苷3D結構的確定是根據(jù)其平面化學結構和手性，并對其進行能量最小化。采用自動搜索模式，將沙爾威辛對接進入Topo Ⅱα，依托泊苷對接進入Topo Ⅱβ。利用分數(shù)最高的結合模式做為最優(yōu)結合。按上述對接方法，將DAG對接入Topo Ⅱ結構，以研究其與Topo Ⅱ的結合位點。

2 結果

2.1 DAG對NCI-H460細胞增殖活力的影響 CCK-8細胞活力檢測結果顯示，經(jīng)不同濃度DAG作用48 h后，NCI-H460細胞的OD值與對照組相比呈下降趨勢，且具有明顯濃度依賴性關系，其IC50為(9.68±1.02) mg·L-1，而陽性對照依托泊苷的IC50為(5.19±0.53) mg·L-1。提示DAG具有明顯的體外抗肺癌活性，但其活性稍弱于依托泊苷。見Fig 1。

Fig 1 Cell viability of NCI-H460 cells treated with DAG and VP16 respectively

2.2 DAG對NCI-H460細胞克隆形成的影響 細胞克隆形成實驗結果表明，DAG在處理24 h后撤除藥物繼續(xù)培養(yǎng)，依然能明顯地抑制NCI-H460細胞克隆團的形成，并呈劑量依賴性，與陽性藥依托泊苷效果類似。上述結果表明DAG能持續(xù)抑制NCI-H460細胞的增殖。見Fig 2。

2.3 DAG對NCI-H460細胞形態(tài)的影響 在倒置顯微鏡下觀察，各給藥組細胞均不同程度出現(xiàn)細胞變圓縮小、貼壁能力減弱、胞質(zhì)內(nèi)顆粒邊緣化，甚至細胞破碎等損傷現(xiàn)象，隨著濃度的增加，細胞數(shù)量明顯減少，而空白組細胞生長良好，細胞形態(tài)完整。見Fig 3。

Fig 2 The colony numbers of NCI-H460 cells treated with DAG and VP16 respectively

**P<0.01vscontrol

Fig 3 Morphological changes of NCI-H460 cells treated with DAG(×200)

A: Control group; B: DAG 2.5 mg·L-1; C: DAG 5.0 mg·L-1; D: DAG 10.0 mg·L-1. Scale bar: 50 μm

2.4 DAG 引起NCI-H460細胞核染色質(zhì)的變化 Hoechst 33342是一種可以穿過細胞膜與染色質(zhì)結合的藍色熒光染料。細胞染色后通過熒光顯微鏡觀察，結果顯示正常未給藥組細胞內(nèi)熒光較弱，細胞核形態(tài)正常，DAG作用48 h后細胞內(nèi)熒光強度隨DAG濃度的提高明顯增強，并出現(xiàn)胞核形態(tài)異常，凝縮現(xiàn)象，提示DAG對NCI-H460細胞的DNA具有損傷作用。見Fig 4。

Fig 4 Morphological changes of nucleus induced by DAG in NCI-H460 cells (×200，stained with Hoechst 33342)

A: Control group; B: DAG 2.5 mg·L-1; C: DAG 5.0 mg·L-1; D: DAG 10.0 mg·L-1. Scale bar: 50 μm

2.5 DAG對NCI-H460細胞Topo Ⅱ mRNA的影響 Topo Ⅱ在DNA的復制、轉(zhuǎn)錄、重組過程中具有重要作用，當Topo Ⅱ受到抑制時，可以導致DNA雙鏈斷裂。為此，我們檢測了DAG對Topo Ⅱ mRNA的影響。結果表明，與空白對照組相比，不同濃度的DAG能明顯抑制Topo Ⅱα mRNA的表達。同樣，DAG也能抑制Topo Ⅱβ mRNA的表達，與空白組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。以上研究結果表明DAG對Topo Ⅱ的不同亞型的表達均具有明顯的抑制作用。見Fig 5。

2.6 DAG對NCI-H460細胞TOPO Ⅱ蛋白的影響 Topo Ⅱ mRNA的表達水平直接與蛋白表達水平有關。為了驗證Topo Ⅱ mRNA受到抑制后蛋白表達水平是否也隨之降低，我們進一步檢測了Topo Ⅱα和Topo Ⅱβ蛋白表達水平。Fig 6結果表明，不同濃度的DAG均能明顯降低Topo Ⅱα的表達水平。另外，DAG在5 mg·L-1和10 mg·L-1兩個濃度下能明顯抑制Topo Ⅱβ的表達，與mRNA的表達水平具有一定的一致性。以上研究結果提示DAG可抑制TopoⅡα和TopoⅡβ的蛋白表達。

Fig 5 Effects of DAG on mRNA expression of TopoⅡα,TopoⅡβ in NCI-H460 cells

**P<0.01vscontrol

2.7 Docking分析 為了進一步研究DAG對Topo Ⅱ的影響，采用計算機分子模擬對接方法探討DAG與Topo Ⅱ是否具有相互作用，以及其作用方式和結合位點。對接模型結果顯示，DAG與Topo Ⅱα之間形成了3個氫鍵，DAG的三元環(huán)中的氧原子與Topo Ⅱα 在120和121 2個色氨酸的殘基形成具有相互作用的氫鍵，3-C上的羥基與140位上的賴氨酸殘基也形成1個氫鍵。與陽性藥沙爾威辛相比，140位上的賴氨酸殘基同樣被沙爾威辛占據(jù)，顯示DAG結合位點與沙爾威辛部分重合。DAG的1,2-環(huán)氧及3-C上的羥基與Topo Ⅱβ在52位上的精氨酸殘基形成2個氫鍵，此外，3-C上的羥基與1375位的氨基酸形成共軛與單原子相互作用，而這些位點同樣被依托泊苷占據(jù)，顯示DAG與Topo Ⅱβ 的結合占據(jù)依托泊苷與TopoⅡβ的結合位點。綜上所述，計算機分子模擬對接結果顯示，DAG與TopoⅡ的結合位點與沙爾威辛、依托泊苷部分重疊。如Fig 7所示。

Fig 6 Effects of DAG on protein expression of TopoⅡα,TopoⅡβ in NCI-H460 cells

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3 討論

TopoⅡ在生物界普遍存在，是細胞內(nèi)一種重要的核酶，為生長所必需。TopoⅡ分為α和β 2個亞型，可催化DNA 拓撲異構化即超螺旋狀態(tài)和解螺旋狀態(tài)相互的轉(zhuǎn)換反應，其功能由ATP提供能量，Mg2+也是必須的。TopoⅡ能識別特殊的DNA序列，并將雙鏈DNA選擇性切斷[15]。在許多腫瘤細胞中，TopoⅡ的含量及活性遠遠高于正常組織的細胞，因此，TopoⅡ已成為抗腫瘤藥物研究中的重要靶點。TopoⅡ抑制劑可分為TopoⅡα抑制劑和TopoⅡβ抑制劑，目前這2種抑制劑的作用區(qū)別尚未清楚。TopoⅡ抑制劑通過影響TopoⅡ作用過程的各個階段來影響雙鏈DNA的斷裂和再連接反應。它可以作用于DNA，也可以作用于拓撲異構酶，還可以作用于TopoⅡ-DNA可切割復合物，影響DNA復制過程，導致細胞凋亡[16]。

Fig 7 Molecular docking of DAG with TopoⅡα and TopoⅡβ

A: The docking prediction of DAG bound to the TopoⅡα; B: The docking prediction of salvicine bound to the TopoⅡα; C: The docking prediction of DAG bound to the TopoⅡβ; D: The docking prediction of etoposide bound to the TopoⅡβ.

DAG對肺癌NCI-H460細胞的研究中，經(jīng)不同濃度處理48 h后，CCK-8細胞活力檢測實驗、細胞克隆形成實驗均表明DAG對肺癌NCI-H460細胞有明顯的抑制作用，且具有明顯的濃度依賴關系，其活性與陽性藥依托泊苷接近，說明DAG抗腫瘤活性明顯。DAG在15 mg·L-1濃度下可抑制大部分腫瘤細胞的增殖，提示該濃度是DAG較為合適的治療窗。Hoechst 33342實驗中發(fā)現(xiàn)NCI-H460細胞胞核出現(xiàn)明顯的破碎現(xiàn)象，提示DAG可引起DNA損傷，可能引起細胞凋亡。進一步機制研究發(fā)現(xiàn)，DAG能明顯降低TopoⅡα、TopoⅡβ mRNA水平，并且隨著DAG濃度的增加，抑制作用逐步增加。與此相對應的是，DAG也能抑制細胞內(nèi)TopoⅡα和TopoⅡβ的蛋白表達。為了更進一步探討DAG與TopoⅡ之間是否具有直接的結合作用，通過分析人TopoⅡα ATPase晶體結構及TopoⅡβ的晶體結構，發(fā)現(xiàn)DAG主要通過極性的氫鍵結合到TopoⅡ上，且與陽性藥結合位點有部分重疊，說明其與陽性藥的結合區(qū)域相似，可能會導致TopoⅡ活性受到抑制。Levin等[12]以14C標記DAG對3種鼠類腦腫瘤的活性進行研究，發(fā)現(xiàn)DAG均可與RNA和DNA結合，且與RNA的結合能力為DNA的6倍。因此，DAG可能是通過與TopoⅡ mRNA結合，從而影響TopoⅡ蛋白的合成，進而引起細胞內(nèi)DNA的斷裂，最終導致細胞死亡。另一方面，DAG也有可能和TopoⅡ直接結合，影響TopoⅡ的活性，從而導致DNA復制和轉(zhuǎn)錄過程受到影響，進而影響TopoⅡ mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，但是DAG的具體作用機制尚待進一步研究。

(致謝：本文實驗在廣西醫(yī)科大學藥學院公共實驗平臺完成，對參與實驗的人員表示感謝！)

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Inhibitory effect of dianhydrogalactitol on DNA TopoⅡ in NCI-H460 cells

HUANG Yin-mei1, LIU Hua-gang2, SU Gui-yu3, LI Ying-jie4, WANG Xiao-jie1, JIANG Xia5

(1.PharmacyCollege,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;2.GuangxiFoodandDrugAdministration,Nanning530022,China; 3.PharmacyCollege,GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530001,China;4.InstituteofTraditionalChineseMedicineandNaturalProducts,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;5.DeptofClinicalPharmacy,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Aim To evaluate the antitumor activity of dianhydrogalactitol (DAG)invitro, and further clarify its underlying mechanisms. Methods The inhibitory effect of DAG in NCI-H460 cells was detected by CCK-8 assay and colony formation assay. The morphology of cells treated with DAG was observed under optical microscope. Nuclear morphology was captured by fluorescence microscopy after Hoechst 33342 staining. Real-time PCR was used to analyze the expression level of topoisomerase Ⅱ (Topo Ⅱ) mRNA. The protein expression level of Topo Ⅱ was detected by Western blot. Additionally, molecular docking approaches were used to predict the interaction between DAG and Topo Ⅱ. Results DAG exhibited potent antitumor activity in NCI-H460 cells, and inhibited cell proliferation persistently. DAG obviously induced nuclear morphological changes of NCI-H460 cells. Furthermore, DAG could down-regulate the mRNA and protein expression level of Topo Ⅱ detected by Real-time PCR analysis and Western blot, respectively. Molecular docking predicted that DAG could bind to Topo Ⅱ. Conclusion DAG can significantly inhibit the proliferation of NCI-H460 cells, and its underlying mechanisms may involve the down-regulation of Topo Ⅱ mRNA and direct binding to Topo Ⅱ, leading to cancer cell death.

dianhydrogalactitol; lung cancer; NCI-H460 cell; Topo Ⅱ; Topo Ⅱ inhibitor; molecular docking

2016-07-14,

2016-08-19

廣西科學研究與技術開發(fā)計劃項目(No 桂科能12237007)；廣西自然科學基金資助項目(No 2015GXNSFAA139194)

黃銀妹(1990-)，女，碩士生，研究方向：藥物抗腫瘤，E-mail:492499884@qq.com；

蔣 霞(1974-)，女，博士生，碩士生導師，研究方向：藥物抗腫瘤、臨床藥學與中藥藥理學，通訊作者，E-mail:47240986@qq.com

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.046.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.023

A

1001-1978(2016)11-1601-07

R282.71；R329.24；R734.202.2；R977.3；R979.1

結果 CCK-8法檢測結果顯示，DAG對NCI-H460細胞的體外抗腫瘤活性明顯。細胞克隆形成實驗結果表明，DAG能持續(xù)抑制腫瘤細胞的增殖。Hoechst 33342檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)細胞核染色質(zhì)發(fā)生明顯改變。Real time PCR和Western blot檢測結果顯示Topo Ⅱ mRNA和蛋白表達量降低。計算機模擬分子對接顯示DAG與Topo Ⅱ有相互結合作用。結論 DAG能明顯抑制NCI-H460細胞的增值，作用機制研究表明DAG能降低Topo Ⅱ mRNA和蛋白水平，并與Topo Ⅱ結合，最終可能導致DNA雙鏈斷裂，引起細胞死亡。