何首烏中大黃素對L02肝細胞CYP亞酶表達及細胞毒性的影響

汪美汐，王宇光，徐煥華1，，張照研，馬增春，肖成榮，譚洪玲，湯響林，高 月

(1. 廣東藥科大學研究生學院, 廣東 廣州 510006；2. 軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所藥理毒理研究室，北京 100850)

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何首烏中大黃素對L02肝細胞CYP亞酶表達及細胞毒性的影響

汪美汐1,2，王宇光2，徐煥華1，2，張照研2，馬增春2，肖成榮2，譚洪玲2，湯響林2，高 月1,2

(1. 廣東藥科大學研究生學院, 廣東 廣州 510006；2. 軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所藥理毒理研究室，北京 100850)

目的 研究何首烏中大黃素(emodin)對L02肝細胞CYP450酶主要亞型表達的影響，探討其對L02肝細胞的細胞毒性機制。方法 不同濃度的Emodin處理L02細胞，通過MTS法檢測細胞的存活率，測定LDH釋放率評價細胞損傷程度，Real time PCR法檢測Emodin各給藥組CYP450酶亞型mRNA表達的變化。結果 MTS結果顯示，隨著Emodin濃度的增加，呈現(xiàn)明顯的細胞損傷效應，細胞的存活率逐漸降低并呈現(xiàn)濃度和時間依賴性；同時，LDH釋放率在給藥48 h時相比于空白組均明顯增高。在基因水平上，與空白組相比，Emodin能明顯提高CYP450各亞型mRNA表達，并可劑量依賴性誘導CYP1A1、CYP1B1的表達。結論 何首烏中大黃素對人正常肝細胞具有明顯損傷作用，并能誘導CYP450酶mRNA表達。

何首烏；大黃素；CYP450；肝損傷；L02肝細胞；ABT；mRNA表達

何首烏為蓼科植物何首烏(PolygonummultiflorumThunb.)的干燥塊根，被廣泛應用于臨床上治療脫發(fā)、高血壓、高血脂等多種疾病[1]。大黃素(emodin)作為何首烏中的主要蒽醌類成分，具有廣泛的藥理學作用，包括抗癌、抗菌消炎作用，對肝癌、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌等的治療作用都有相關研究報道。但是，隨著對何首烏的臨床應用和對中藥安全性的認識日益深入，國內外相繼出現(xiàn)了關于何首烏致肝損傷的相關臨床病例報道，其安全性問題引起了國內外學者的高度關注。目前，普遍認為何首烏的肝損傷作用主要與其所含蒽醌類成分有關[2]，如大黃素、大黃酸。細胞色素P450作為重要的藥物代謝酶，主要分布于肝、腎等組織器官中，參與90%以上臨床藥物的代謝，當其活性受到抑制或誘導時，易發(fā)生不良反應[3]，如四氯化碳或醋氨酚(撲熱息痛)可被細胞色素 P450 酶系代謝成有毒代謝物從而損傷細胞。因此，探討藥物對CYP 的作用，對闡述中藥的毒性作用具有重要意義?；诖耍瑸榱诉M一步研究何首烏致肝損傷機制，本研究將從藥物代謝酶角度，探討何首烏中大黃素對L02肝細胞CYP450酶主要亞型表達的影響及其對L02肝細胞的毒性作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 Emodin購自上海一飛生物科技有限公司(批號：E054323)；1-氨基苯并三唑(1-aminobenzotriazole，ABT)購自美國Sigma-Aldrich公司(批號：95M4156V)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco)和血清(FBS)(Hyclone)；胰酶(Sigma)；MTS 試劑盒(Promega)；LDH試劑盒(普利萊基因技術有限公司)；TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix和TransStart?Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術有限公司)。

1.2 儀器 細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo)；超凈工作臺(北京長城空氣凈化設備公司，SW-CJ-1F型)；倒置顯微鏡(日本Nikon 120 型)；酶標儀(美國Perkin Elmer，PE Victor X5型)；PCR儀(Gene Amp 2400)；精密電子天平(德國Sartorius，BS110S)；StepOne PlusTMReal Time PCR(美國Applied Biosystems，StepOne PlusTM272006169) 。

1.3 細胞培養(yǎng) L02細胞為人正常肝細胞，來源于人肝臟上皮細胞(購自上海中喬新舟)，在 37℃、5% CO2的條件下，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，待細胞密度長至80%～90% 時，按1 ∶2的比例進行傳代，平均2～3 d傳一代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.4 Emodin母液配制 精確稱取Emodin 10.80 mg，溶解于DMSO中，使其終濃度為100 mmol·L-1，用槍頭緩慢吹打混勻；分裝至200 μL EP管中，標記清楚并用封口膜密封，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 MTS法檢測L02細胞活力 取對數(shù)生長期的L02細胞以2×104個/孔密度接種于96 孔培養(yǎng)板(空白孔不種細胞) ，每孔200 μL，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。實驗分為空白組、給藥組(濃度依次為0.5、5、10、25、50、100、200、300 μmol·L-1)和陰性對照組，分別培養(yǎng)24、48 h后，棄去培養(yǎng)基，向每孔加100 μL空培養(yǎng)基及20 μL MTS溶液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h。用酶標儀測定在490 nm處的吸光度值(OD)，按以下公式計算細胞存活率。

細胞存活率(IC)/%=(實驗組OD值-空白組OD值)/(陰性對照組OD值-空白組OD值)×100%

1.6 乳酸脫氫酶(LDH)比色法檢測L02細胞損傷 取對數(shù)生長期的L02細胞，以2×104個/孔密度接種于96 孔培養(yǎng)板(空白孔不種細胞)，每孔200 μL，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。實驗分為空白組、給藥組(濃度依次為3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1)和陰性對照組，分別培養(yǎng)24、48 h后，按照LDH試劑盒操作說明進行實驗，LDH釋放率計算如下：細胞LDH釋放率/%=細胞培養(yǎng)基中測定的酶活力單位/(細胞裂解液測定的酶活力單位+細胞培養(yǎng)基測定的酶活力單位)×100%

1.7 ABT對細胞活力的影響 對于細胞CYP450抑制性實驗，取對數(shù)生長期的L02細胞，以2×104個/孔密度接種于96 孔培養(yǎng)板(空白孔不種細胞) ，培養(yǎng)24 h后，去培養(yǎng)基，加入CYP450非特異性抑制劑ABT(1 mmol·L-1)，孵育1 h后給藥(濃度依次為1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1)，培養(yǎng)24、48 h后，采用MTS法檢測L02細胞活力，具體操作方法同“1.5”。

1.8 Real time PCR測定L02細胞CYP450 mRNA表達水平 根據(jù)MTS實驗結果，將實驗分為空白對照組、給藥組(濃度依次為2.5、5、10、20 μmol·L-1)，分別接種于6孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)16 h后，取各處理組L02細胞，采用TRIzol 試劑提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA樣本純度(A260/A280)在1.8～2.0之間，表示總RNA片段完整未降解可用。按照TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix操作說明進行逆轉錄反應合成cDNA ，42℃ 15 min，85℃ 5 s。 ABI StepOne PlusTMReal Time PCR測定CYP450各亞型mRNA基因表達水平，采用2-(△△Ct)方法進行分析[4-5]。特異性引物序列見Tab 1。

Tab 1 Sequences of primers used for real-time reverse transcription(RT-PCR) analysis

2 結果

2.1 Emodin對L02細胞活力的影響 以不同濃度Emodin處理L02細胞24、48 h以后，MTS法測定各給藥組細胞存活率，結果顯示，隨著Emodin給藥濃度的增加，細胞的存活率逐漸下降。低濃度條件下對細胞的存活率沒有影響。測定結果采用GraphPad Prism 5軟件擬合計算IC50值(Fig 1) 。

2.2 LDH比色法檢測L02細胞損傷 對各給藥組細胞的LDH進行測定，結果顯示，不同濃度Emodin處理L02細胞24 h時，LDH釋放率無明顯變化，而給藥處理48 h后，隨著給藥濃度的升高，LDH的釋放率呈增大趨勢(Fig 2)，再一次驗證了Emodin致細胞毒性具有一定的時間和劑量依賴性，與MTS結果相一致。

2.3 ABT對細胞活力的影響 ABT(1 mmol·L-1)為CYP450酶非特異性抑制劑，ABT處理細胞可有效降低細胞內藥物代謝酶活性。結果顯示，ABT處理以后能明顯增加Emodin對L02細胞的毒性，使其IC50值由12.62 μmol·L-1降低至11.64 μmol·L-1(Fig 3)。結果提示CYP酶的活性變化與Emodin細胞毒性密切相關，誘導I相藥物代謝酶代謝可以一定程度上降低Emodin的細胞毒性作用。

Fig 1 Effect of emodin on cell viability of L02 ±s)

Fig 2 Effect of emodin on LDH release rate of L02 ±s)

2.4 Emodin對L02細胞P450酶mRNA表達的影響 Emodin對L02細胞CYP450酶各亞型 mRNA 表達的影響如Fig 4所示，與空白組相比，Emodin對CYP450酶各亞型mRNA總體上均表現(xiàn)出不同程度的上調作用，且在低濃度處理條件下，對CYP2E1、2B6、1A2、2D6、7A1表現(xiàn)出較強的誘導作用，其強弱依次為CYP2E1>2B6>7A1>1A2>2D6,而對CYP2C9、3A4表現(xiàn)出一定的抑制作用。同時，結果顯示Emodin對CYP1A1、CYP1B1呈現(xiàn)劑量依賴性誘導作用。

Fig 3 Effect of nonspecific CYPs inhibitors ABT on cytotoxicity of ±s)

3 討論

隨著中醫(yī)藥研究的發(fā)展，中藥在臨床上的應用越來越廣泛。何首烏作為常用補益中藥，來源于蓼科植物何首烏的干燥塊根，具有解毒消癰、潤腸通便的作用，臨床主要用于補肝腎、益精血、烏須發(fā)、強筋骨[2]。自古以來，何首烏更是被認為是延年益壽、治療須發(fā)早白的良藥，并常年服用，但因此導致的藥物性肝損傷常被忽視。人們通常認為西藥會導致較大的副作用，而中藥十分安全，不存在副作用。實際上，與西藥比較，中草藥較溫和，用藥時往往不太注意劑量和用法。隨著近年來何首烏及其制劑的廣泛應用，國內外關于何首烏引起肝損傷的不良反應報道時有出現(xiàn)，因此如何正確使用何首烏，了解其肝損傷機制，避免不良反應的發(fā)生，是醫(yī)藥工作者亟待解決的問題。目前，人們普遍認為中藥引起肝損傷涉及很多損傷機制，主要包括細胞色素P450、細胞凋亡、氧化應激及免疫功能異常等，然而具體機制尚不明確。因此，加強其發(fā)病機制的研究顯得非常重要。

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)是指藥物在使用過程中，因藥物本身或其代謝物或由于特殊體質對藥物的超敏感性或耐受性降低所導致的肝臟損傷[6]。作為急性或慢性肝臟疾病的重要誘因之一，DILI引發(fā)肝臟損傷的主要方式有兩種，一種是由藥物及其中間產物對肝臟的直接毒性作用；另外一種是機體對藥物的特異質肝毒性。越來越多的的研究表明，何首烏中的大黃素雖然具有潛在的廣泛藥用價值，如抗菌消炎、抗腫瘤、免疫抑制等，但需要關注的是，何首烏中的大黃素是一把雙刃劍，對機體具有雙重作用?，F(xiàn)代藥理研究報道，大黃素作為何首烏中主要的蒽醌類化合物[7]，是造成 DILI 的主要原因之一。所以，從大黃素入手探討其DILI的機制顯得非常必要。研究發(fā)現(xiàn)[8-10]，大黃素能引起F344/N大鼠和B6C3F1小鼠腎小管損傷及肝細胞病變，低濃度大黃素短時間作用于細胞時，對細胞生長有促進作用，而隨著濃度的增加其對細胞的損傷增大，抑制率增加，細胞可見典型凋亡形態(tài)，G1期細胞所占比例明顯減小，S期、G2期比例增加，凋亡率達19.8%；而在大劑量大黃素給藥時，可以造成大鼠肝損傷，其損傷可能與機體氧化應激有關。此外，何首烏中的大黃素還能刺激腸道，引起腸道充血炎癥，導致惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉，服用過量可促進神經興奮，增加肌肉時值，使肌肉麻痹，導致神經緊張、煩躁不安、心動過快、呼吸困難、痙攣抽搐、循環(huán)衰竭、呼吸麻痹等癥狀。同時，美國“國家毒理學規(guī)劃(NTP)”也研究發(fā)現(xiàn)，長期服用大黃素可致大鼠腎小管透明小滴生成，誘發(fā)腎病和腎小管色素沉積等。 細胞色素P450混合功能氧化酶系[11](cytochrome P450，CYP450)，是由血紅素-巰基鹽蛋白所組成的超家族，主要存在于生物體的內質網(wǎng)內，既可以代謝內源性物質，如甾體激素、維生素及類花生四烯酸類化合物等，又可以代謝外源性物質，在藥物代謝中起主要作用的為CYP1、CYP2及CYP3家族。由CYP450酶系作用的生物轉化是生物體代謝的重要環(huán)節(jié)，多種內、外源性化學物對CYP450有誘導或抑制作用，導致酶的數(shù)量和活性改變，并引起自身或其他藥動學的改變，使藥物活性代謝成分積累導致毒性增強，或降低其血藥濃度和治療效果。因此，從藥物代謝酶的角度研究何首烏中大黃素活性單體，有利于從分子水平探討其肝損傷機制。大量體內研究表明[12]，大黃素能夠引起大鼠肝臟微粒體總CYP450明顯升高，可輕度誘導CYP3A、CYP1A、CYP2E1和CYP2B酶。本研究從細胞水平上，考察大黃素對L02肝細胞CYP450酶主要亞型表達的影響，探討其對肝損傷的作用機制。

Fig 4 Effect of emodin on CYP450 gene expression of L02 ±s，n=3)

實驗結果顯示，大黃素對肝臟多種CYP450 酶具有誘導作用。不同給藥劑量下，大黃素均能夠誘導L02肝細胞CYP450酶亞型2E1、2B6、1A2、3A4、2C9、2D6、7A1 mRNA表達，其強弱依次為CYP2E1>2B6>7A1>1A2>2D6>3A4>2C9。同時，qPCR結果顯示,大黃素對CYP1A1、CYP1B1表現(xiàn)出較好的劑量依賴性誘導作用。CYP1A1作為CYP1A家族的主要成員，參與氧化應激過程中還原型輔酶II 依賴的電子轉移通路，參與氧化一系列結構無關的化合物，如類固醇、脂肪酸和外源化合物[13]，因此被視為致癌物代謝酶。以往研究發(fā)現(xiàn)大黃素的腎毒性與其對CYP1A1的誘導有關，為大黃素致肝腎毒性提供了進一步研究的線索。本研究在mRNA水平上初步探究了大黃素致肝損傷的發(fā)生機制，發(fā)現(xiàn)其能明顯誘導CYP1A1 mRNA的表達，從而推測其肝損傷機制可能是通過誘導酶活性，將許多底物活化，進一步誘導氧化應激和肝臟毒性。同時，臨床上何首烏致肝損傷多表現(xiàn)為肝細胞損傷和膽汁淤積性肝損傷，這也提示我們大黃素能明顯誘導CYP7A1 mRNA的表達可能與膽汁酸分泌增加有關，進而導致產生膽汁淤積型肝損傷。

綜上所述，本文在藥物代謝酶水平上對何首烏中大黃素致肝損傷機制進行了初步探究，發(fā)現(xiàn)了大黃素對CYP1A1、CYP1B1具有明顯誘導作用，對于臨床用藥，避免藥物相互作用具有指導意義。同時，本文從CYP450酶角度發(fā)現(xiàn)了酶的變化可以影響其細胞毒性，為進一步深入研究提供了線索，需要從多個角度如吸收、分布及排泄等各個環(huán)節(jié)入手，綜合探討何首烏致肝損傷作用機制，從而為其臨床合理、科學使用提供可靠的依據(jù)。

(致謝:本實驗在軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所藥理毒理研究室完成，感謝各位老師對本實驗的幫助與指導。)

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Effects of emodin inPolygonummultiflorumon liver cytotoxicity and CYP450 isoenzymes expression in L02 cells

WANG Mei-xi1,2，WANG Yu-guang2，XU Huan-hua1,2，ZHANG Zhao-yan2，MA Zeng-chun2，XIAO Cheng-rong2，TAN Hong-ling2，TANG Xiang-lin2，GAO Yue1,2

(1.GraduateSchoolofGuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China；2.BeijingInstituteofRadiationMedicine，AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China)

Aim To study the effect of emodin inPolygonummultiflorumon the expression of CYP450 isoenzymes in L02 hepatocytes and explore its mechanism of cytotoxicity.Methods L02 cells were treated with different concentrations of emodin. Cell viability was examined by MTS assay kit, and cell membrane injury was examined by detecting the release rate of lactate dehydrogenase(LDH). The expression of cytochrome P450 mRNA was detected by real time PCR.Results The result of MTS assay showed that L02 cells viability was significantly reduced following exposure to emodin in a concentration and time dependent manner. The LDH release rate of L02 cells significantly increased after exposure to emodin for 48 h compared with the control group. On the mRNA level，compared with the control group，emodin had inductive effects on mRNA of each CYP450 enzyme，while had significant inductive effects on mRNA of CYP1A1 and CYP1B1 in a concentration and time dependent manner.Conclusion Emodin inPolygonummultiflorummay generate significant liver injury in L02 cells and has inductive effects on CYP450 enzyme activity.

PolygonummultiflorumThunb.；emodin；CYP450；liver injury；L02 cells；ABT；mRNA expression

2016-07-04，

2016-08-08

北京市自然科學基金資助項目(No 7164291)；國家科技重大專項(No 2015ZX09501004-003-003);國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項目(No 2011CB505300, 2011CB505304)

汪美汐(1993-)，女，碩士生，研究方向：新藥發(fā)現(xiàn)與中藥藥理學，E-mail：wangmx93@163.com；

高 月(1963-)，女，博士，研究員，研究方向：中藥藥理學，通訊作者，E-mail：gaoyue@nic.bmi.ac.cn；

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.026.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.013

A

1001-1978(2016)11-1543-06

R322.47 ；R284.1；R345.99；R575.02.2 ；R977.3

王宇光(1979-)，男，博士，副研究員，研究方向：中藥藥理學，通訊作者，E-mail：wyg79@139.com