小檗堿聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)高糖損傷下血管內(nèi)皮細(xì)胞能量代謝的影響

李 玲，譚佳佳，劉慧萍，喻 嶸，陳 沙，張樸真，吳 倩

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 1.中醫(yī)學(xué)院、2.針灸推拿學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410208)

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小檗堿聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)高糖損傷下血管內(nèi)皮細(xì)胞能量代謝的影響

李 玲1，譚佳佳2，劉慧萍1，喻 嶸1，陳 沙1，張樸真2，吳 倩2

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 1.中醫(yī)學(xué)院、2.針灸推拿學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410208)

目的 研究黃連的主要有效成分小檗堿聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于高糖作用下血管內(nèi)皮細(xì)胞能量代謝的影響。方法 ① MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖以及活性情況；② 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期；③ 彗尾法檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷情況；④ HPLC測(cè)定細(xì)胞中ATP、ADP、AMP含量，能荷EC值；⑤ RT- PCR法測(cè)定CCR、COX mRNA表達(dá)；⑥ Western blot法檢測(cè)COX、CCR的蛋白表達(dá)。結(jié)果 ① 高糖干預(yù)損傷后的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性明顯降低、增殖能力減弱，S+G2期的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)一定程度的DNA損傷，而小檗堿、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其聯(lián)合使用均能不同程度提高細(xì)胞活性和增殖能力，增加S+G2期的細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)DNA的修復(fù)(P<0.01)，且小檗堿聯(lián)合干細(xì)胞組的效應(yīng)優(yōu)于單用組；② 血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)高糖干預(yù)損傷后ATP和ADP含量減低、AMP含量增多、EC值明顯降低，小檗堿、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其聯(lián)合使用均能提高ATP和ADP含量(P<0.01)；且小檗堿聯(lián)合干細(xì)胞的效應(yīng)優(yōu)于單用組；③ 血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)高糖干預(yù)損傷后，COX、CCR mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，經(jīng)小檗堿、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其聯(lián)合使用干預(yù)后，CCR 、COX mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01或P<0.05)，且小檗堿聯(lián)合干細(xì)胞的上調(diào)作用最為明顯。結(jié)論 小檗堿、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以及兩者聯(lián)合使用對(duì)于高糖損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞能量代謝的改善具有促進(jìn)作用，其機(jī)制可能是小檗堿、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可上調(diào)COX和CCR mRNA和蛋白的表達(dá)，從而介導(dǎo)葡萄糖類氧化物的水解，改善血液環(huán)境，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的葡萄糖供應(yīng)和攝取，從而改善高糖損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞的能量代謝。

小檗堿；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；血管內(nèi)皮細(xì)胞；高糖損傷；能量代謝；細(xì)胞色素C氧化酶，細(xì)胞色素C還原酶

能量代謝(energy metabolism)是機(jī)體生命活動(dòng)的基本特征，是指生物體內(nèi)物質(zhì)代謝過(guò)程中所伴隨的能量釋放、轉(zhuǎn)移和利用等。當(dāng)能量代謝發(fā)生障礙的時(shí)候，機(jī)體細(xì)胞的活性降低，存活、分化、發(fā)育和穩(wěn)態(tài)都將受到強(qiáng)烈的影響[1]。有研究表明[2]，高血糖癥或血糖升高所引起機(jī)體的能量代謝障礙，是糖尿病不加控制的一種通常結(jié)果。長(zhǎng)期高糖會(huì)對(duì)人體的多個(gè)系統(tǒng)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p害，尤其神經(jīng)和血管[3]。高血糖等因素對(duì)血管的損傷通常會(huì)導(dǎo)致糖尿病患者產(chǎn)生心血管和腦血管并發(fā)癥，與非糖尿病患者相比，糖尿病人群患動(dòng)脈粥樣硬化的比例更高且發(fā)病年齡更低[4]。血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成血液循環(huán)的基本，在維持血腦屏障以及保證各組織營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞能量代謝障礙是引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的主要原因，也是凝血反應(yīng)啟動(dòng)至血栓形成過(guò)程中一個(gè)重要特征[5]。在高糖損傷干預(yù)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生能量代謝障礙，如存活率降低、生長(zhǎng)緩慢、活性降低等癥狀[6]。

大量研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)不僅僅具有多向分化能力、低免疫原性、可以調(diào)節(jié)代謝以及可用來(lái)自體移植治療等優(yōu)勢(shì)被作為細(xì)胞治療的重要來(lái)源，而且可以提供營(yíng)養(yǎng)支持，促進(jìn)血管再生、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，重構(gòu)免疫網(wǎng)絡(luò)等從而促進(jìn)組織再生等能力，是應(yīng)用于糖尿病治療的新生力量[7]。小檗堿是中藥黃連的主要有效成分之一，故鹽酸小檗堿又稱黃連素，應(yīng)用于糖尿病及其并發(fā)癥的治療已經(jīng)超過(guò)20年，但其作用機(jī)制、療效仍不明確[8]。BM-MSCs以及小檗堿的治療作用是否是通過(guò)改善血管內(nèi)皮細(xì)胞能量代謝而實(shí)現(xiàn)，其相互作用是表現(xiàn)為協(xié)同還是相加，需要進(jìn)一步研究。因此，本研究探討了在高糖損傷下，血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生了怎樣的能量代謝障礙，然后再在此基礎(chǔ)上進(jìn)行小檗堿、BM-MSCs以及聯(lián)合使用抗高糖損傷下能量代謝障礙的實(shí)驗(yàn)研究，為其進(jìn)一步地研究和臨床的合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑 葡萄糖(C6H12O6)(批號(hào)：G7528-250G)；甘露醇(C6H14O6)(批號(hào)：M8140);小檗堿(berberine)(批號(hào)：SB8130);胎牛血清(批號(hào)：1347477);RPMI 1640培養(yǎng)液(批號(hào)：8114020);胰蛋白酶(批號(hào)：1552993);7 sea-cell counting試劑盒(批號(hào)：20151226);Reverse Transcription逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：A3500);無(wú)機(jī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；Transwell板(批號(hào)：08909028)。

1.2 儀器 培養(yǎng)箱(Galaxy 170R)；離心機(jī)(Centrifuge 5804 R)；顯微鏡(ZEISS，1777-614)；超凈工作臺(tái)(1305011)；高效液相分析儀(Waters，2498/Waters，1525)。

1.3 細(xì)胞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)購(gòu)自于上海中科院細(xì)胞庫(kù)；臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)購(gòu)自于湘雅細(xì)胞中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)以及高糖等因素干預(yù) HUVEC、BM-MSC細(xì)胞均以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(含葡萄糖5.5 mmol·L-1、體積分?jǐn)?shù)為0.10的胎牛血清和1%青、鏈霉素)于37℃、5 mol·L-1CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后傳代培養(yǎng)。細(xì)胞以1×107·L-1接種于12孔Transwell培養(yǎng)板，每孔0.5 mL，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，再加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化到G0期，棄培養(yǎng)液，用以下干預(yù)方式處理細(xì)胞，2 d換液1次，待測(cè)。具體分組及干預(yù)方式見(jiàn)Tab 1。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖與活性 將干預(yù)后的細(xì)胞每孔加入7 sea-cell counting試劑盒中工作液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h之后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光值(OD)，細(xì)胞增殖抑制率/%=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值/空白組OD值)]×100%)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 離心收集各組細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次，收集1×105～5×105細(xì)胞；加入500 μL的Binding Buffer至懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide(PI)，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min；在1 h之內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測(cè)。

2.4 彗星實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)細(xì)胞損傷情況 離心收集各組細(xì)胞進(jìn)行彗尾實(shí)驗(yàn)檢測(cè)：① 取100 μL于45 ℃水浴中保溫的7.5 g·L-1NMA，鋪于磨沙載玻片上，形成底膠。4 ℃凝固5～8 min；② 水平取下蓋片，取100 μL于37 ℃水浴中保溫的5 g·L-1LMA與20 μL細(xì)胞懸液(約400個(gè)細(xì)胞)混勻，4 ℃凝固5～8 min；③ 將制備好的膠板去掉蓋玻片后，在4 ℃下裂解2.5～3 h，解旋20 min；④ 玻片水平放置陽(yáng)極端附近，4 ℃電泳20～25 min(25 V，300 mA)；⑤ 電泳結(jié)束，中和10 min×3次，最后晾干；⑥ 取出膠板，在2 mg·L-1的EB染色液中，暗處染色5～10 min；⑦ 蒸餾水漂洗5 min×2次。晾干，在熒光顯微鏡下觀察。

2.5 高效液相色譜法檢測(cè)能量代謝指標(biāo) 將各組細(xì)胞經(jīng)高氯酸裂解后，用反向HPLC法檢測(cè)細(xì)胞中ATP、ADP和AMP的含量。HPLC系統(tǒng)采用Ecosil C18反相柱(4.6×250 mm, 5 μm, pH 2～8)，流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)為0.90的15 mmol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液和體積分?jǐn)?shù)為0.10的甲醇，流速0.5 mL·min-1，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；檢測(cè)溫度為25℃，進(jìn)樣量20 μL。以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算ATP、ADP和AMP含量，并計(jì)算腺苷酸能荷值(EC)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和樣本測(cè)定：分別吸取1、2、3、4、5 μL標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和HPLC的峰面積得到標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：ATP：Y=0.117X-0.077(r=0.9996)；ADP：Y=0.104X+0.695(r=0.9999)；AMP：Y=0.128X-0.606(r=0.9998)。其中Y為濃度，X為峰面積。再將樣品進(jìn)行HPLC測(cè)定，得到的峰面積由標(biāo)準(zhǔn)曲線推算樣本各待測(cè)物的含量，EC=(ATP+0.5 ADP)/(ATP+ADP+AMP)。

Tab 1 Grouping and intervention

2.6 RT-PCR法檢測(cè)COX、CCR的mRNA表達(dá) 收集細(xì)胞，進(jìn)行如下操作：① TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA，超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度；② 運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；③ PCR擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因，反應(yīng)條件：94℃ 4 min，94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 45 s，×30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。引物設(shè)計(jì)：參照參考文獻(xiàn)[7]，由上海生工合成，見(jiàn)Tab 2。

Tab 2 Primer sequences utilized in studies of RNA by RT-PCR

2.7 Western blot法檢測(cè)COX、CCR的蛋白表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)及處理同前，收集細(xì)胞，進(jìn)行如下操作：① 細(xì)胞蛋白質(zhì)的提?。何ド锨澹琍BS洗滌，刮下細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min后棄去上清，加入100 μL的蛋白裂解液和1 μL的蛋白酶抑制劑，冰上充分混勻后靜置20 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清，BCA試劑盒測(cè)定總蛋白含量。取30 μg蛋白100℃水浴10 min變性；② Westrn blot：60 V恒壓電泳3 h后，105 mA轉(zhuǎn)膜2 h，質(zhì)量濃度為50 g·L-1脫脂牛奶封閉1 h，再分別與COX兔源IgG(1 ∶1 000)、CCR兔源IgG(1 ∶1 000)和β-actin鼠源IgG(1 ∶1 000)溶液混合，4℃搖床過(guò)夜，TBS洗10 min×3次；然后分別加羊抗兔二抗(1 ∶2 000)或羊抗鼠二抗(1 ∶2 000)，37℃孵育1 h，TBS洗10 min×3次，暗室中加ECL化學(xué)發(fā)光劑，X膠片壓片、顯影及定影；③ 圖片分析：Image Pro-Plug 6.0圖像分析軟件測(cè)定目的條帶的累積光密度值(IOD)，以目的條帶的IOD與β-actin條帶的IOD的比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 各組細(xì)胞增殖與活性的比較 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)高糖干預(yù)損傷后活性明顯降低、增殖能力減弱，與正常組和甘露醇組比較，差異有顯著性(P<0.01)；而小檗堿、BM-MSCs及其聯(lián)合使用均能提高細(xì)胞活性和增殖能力，與高糖組比較，差異有顯著性(P<0.01)，其中BM-MSCs聯(lián)合小檗堿組的作用優(yōu)于單用組(P<0.01),見(jiàn)Tab 3。

Tab 3 Cell proliferation and ±s,n=5)

**P<0.01vsNC；##P<0.01vsHG；△△P<0.01vsXBJ+BM-MSCs

3.2 各組細(xì)胞周期的比較 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)高糖干預(yù)損傷后處于S期(DNA合成期)+G2(DNA合成后期)的細(xì)胞明顯減少，說(shuō)明細(xì)胞分裂減慢，與正常組比較，差異有顯著性(P<0.01)；而小檗堿、BM-MSCs及其聯(lián)合使用組S+G2期的細(xì)胞均有不同程度增加，與高糖組比較，差異有顯著性(P<0.01)，其中小檗堿聯(lián)合BM-MSCs組作用優(yōu)于單用組(P<0.01)，見(jiàn)Fig 1。

3.3 各組細(xì)胞的DNA損傷比較 彗尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)高糖干預(yù)損傷后，細(xì)胞DNA出現(xiàn)了明顯的損傷，產(chǎn)生脫尾現(xiàn)象，與正常組比較，差異有顯著性(P<0.01)；而小檗堿、BM-MSCs及其聯(lián)合使用均能改善細(xì)胞DNA的損傷情況，與高糖組比較，差異有顯著性(P<0.01)，其中小檗堿聯(lián)合BM-MSCs組的作用優(yōu)于單用組(P<0.01或P<0.05)，見(jiàn)Fig 2。

3.4 各組細(xì)胞能量代謝指標(biāo)比較 HPLC結(jié)果顯示：血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)高糖干預(yù)損傷后，細(xì)胞ATP、ADP以及EC值明顯降低，AMP升高，AMP與正常組比較，差異有顯著性(P<0.01)；而小檗堿、BM-MSCs及其聯(lián)合使用均能上調(diào)ATP、ADP含量以及EC值，下調(diào)AMP，與高糖組比較，差異有顯著性(P<0.01或P<0.05)，其中小檗堿聯(lián)合BM-MSCs組的作用優(yōu)于單用組(P<0.01或P<0.05)，見(jiàn)Tab 4。3.5 RT-PCR法檢測(cè)COX、CCR的mRNA表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示：血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)高糖干預(yù)損傷后，細(xì)胞COX、CCR mRNA表達(dá)量明顯降低，與正常組比較，差異有顯著性(P<0.01)；而小檗堿、BM-MSCs及其聯(lián)合使用均能上調(diào)COX、CCR mRNA表達(dá)，與高糖組比較，差異有顯著性(P<0.01或P<0.05)，其中小檗堿聯(lián)合BM-MSCs組的作用優(yōu)于單用組(P<0.05)，見(jiàn)Fig 3。

Fig 1 Cell cycle detected by flow cytometry

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsHG group;△△P<0.01vsXBJ+BM-MSCs group

Tab 4 Energy metabolism indexes of cells by ±s，n=3)

*P<0.05,**P<0.01vsNC group；#P<0.05,##P<0.01vsHG group；△P<0.05，△△P<0.01vsXBJ+BM-MSCs group

3.6 Western blot法檢測(cè)COX、CCR的蛋白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示：血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)高糖干預(yù)損傷后，細(xì)胞COX、CCR蛋白表達(dá)量明顯降低，與正常組比較，差異有顯著性(P<0.01)；而小檗堿、BM-MSCs及其聯(lián)合使用均能上調(diào)COX、CCR蛋白表達(dá)，與高糖組比較，差異有顯著性(P<0.01)，其中小檗堿聯(lián)合BM-MSCs組的作用優(yōu)于單用組(P<0.05)。見(jiàn)Fig 4。

4 討論

近年來(lái)，大量研究發(fā)現(xiàn)糖尿病中胰島素抵抗的發(fā)生與線粒體功能障礙密切相關(guān)。胰島素抵抗的小鼠、2型糖尿病動(dòng)物和患者均伴有機(jī)體中線粒體氧化磷酸化活性下降、ATP生成減少、線粒體功能障礙[9]。ATP作為組織細(xì)胞的主要能量來(lái)源，對(duì)于維持細(xì)胞的生理功能，如主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)合成與加工、離子內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞膜完整性等發(fā)揮著重要作用[10]。EC是動(dòng)態(tài)反映細(xì)胞能量平衡的一個(gè)參數(shù)，可有效評(píng)估組織細(xì)胞的能量?jī)?chǔ)備狀態(tài)。能荷值高，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)ATP生成活躍，反之則表明ATP生成不足或利用增加。高糖損傷下的血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)有氧氧化障礙，代謝紊亂，ATP含量下降，ATP分解產(chǎn)物ADP、AMP含量增加，隨后ADP、AMP相繼分解，最終導(dǎo)致EC值明顯下降，血管損傷。細(xì)胞色素C還原酶(cytochrome c reductase，CCR)和細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase，COX)是氧化磷酸化過(guò)程中呼吸鏈的重要組分，在體內(nèi)ATP 生成起著關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，高糖損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞之后，血管內(nèi)皮細(xì)胞的COX與CCR mRNA和蛋白表達(dá)均降低，呼吸鏈過(guò)程受阻，導(dǎo)致整個(gè)ATP合成量下降。

Fig 2 Cell damage detected by comet assay

A:NC;B:MA;C:HG;D:XBJ;E:BM-MSCs;F:XBJ+BM-MSCs

Fig 3 mRNA expression of COX and CCR by RT-PCR

**P<0.01vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group;△P<0.05vsXBJ+BM-MSCs group

Fig 4 Protein expression of COX and CCR by Western blot

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsHG group;△P<0.05vsXBJ+BM-MSCs

小檗堿是黃連中含量最為豐富的單體成份，中藥黃連是中醫(yī)用于治療糖尿病的常用藥物，中醫(yī)記載黃連具有清熱、解毒、瀉火以及治療消渴癥的作用[11]。BM-MSCs是一類具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)的細(xì)胞，在細(xì)胞替代治療中有極其重要的作用[12]。BM-MSCs在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)[13]。在治療糖尿病的難題上提供了新思路。

本文結(jié)果顯示，小檗堿、干細(xì)胞和小檗堿聯(lián)合干細(xì)胞使用均能明顯改善高糖損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性與增殖情況，并且可以加快細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)，以及改善細(xì)胞的DNA損傷情況。與此同時(shí)，在提高ATP的含量，增加EC值上也發(fā)揮了不可估量的作用，改善了血管內(nèi)皮細(xì)胞的能量代謝，且小檗堿聯(lián)合干細(xì)胞組的作用強(qiáng)于單用組。在COX與CCR mRNA和蛋白表達(dá)的干預(yù)上，小檗堿、干細(xì)胞和小檗堿聯(lián)合干細(xì)胞使用均能明顯上調(diào)，且聯(lián)合使用的作用強(qiáng)于單用組，這可能與上調(diào)COX與CCR mRNA和蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞中氧化物的氧化，減輕細(xì)胞的負(fù)擔(dān)，從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞能量代謝有關(guān)。

綜上所述，將小檗堿和BM-MSCs合理配伍，將可能對(duì)糖尿病的治療發(fā)揮增效作用，這種作用與其配伍后增強(qiáng)改善血管內(nèi)皮細(xì)胞能量代謝有關(guān)，為治療糖尿病提供了新思路和一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但是其具體的作用通路及其機(jī)制還有待我們進(jìn)一步研究。

(致謝：感謝團(tuán)隊(duì)成員為該項(xiàng)目付出的辛勤勞動(dòng)，感謝湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地，感謝中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和中醫(yī)方證研究轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供指標(biāo)檢測(cè)儀器！)

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Effect of berberine combined with bone marrow mesenchymal stem cells on energy metabolism of HUVECs damaged by high glucose

LI Ling1, TAN Jia-jia2, LIU Hui-ping1,YU Rong1,CHEN Sha1, ZHANG Pu-zhen2, WU Qian2

(1.CollegeofTraditionalChineseMedicine, 2.CollegeofAcupuncture&MoxibustionandTui-na,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China)

Aim To investigate the effects of berberine combined with bone marrow mesenchymal stem cells(BM-MSCs) on the energy metabolism of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) under the condition of high glucose. Methods ①The state of cell reproduction and cell proliferating activity were determined by MTT assay. ②The cell cycle was detected by flow cytometry (FCM). ③DNA damage of cells was measured by comet tail assay. ④The contents of ATP, ADP and AMP were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) and the level of energy charge (EC) was calculated. ⑤The expression of CCR and COX mRNA was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). ⑥The expressions of COX and CCR were detected by Western blot. Results ①The proliferating activity of HUVECs declined apparently and the proliferation decreased after high glucose intervention. Meanwhile, the quantity of cells during S+G2dropped dramatically and there was certain degree of damage to DNA. The berberine and BM-MSCs respectively improved the proliferating activity and the proliferation in different degrees, increased the quantity of cells during S+G2and promoted the repair of DNA (P<0.01), and so did the combination of the two, with a better effect than each of them alone. ②After high glucose intervention and the damage caused, the content of both ATP and ADP of HUVECs was reduced, and EC level also declined significantly, while the content of AMP increased. The berberine and BM-MSCs respectively up-regulated the content of ATP and ADP (P<0.01), and so did the combination of the two, with a better effect than each of them alone.③After high glucose intervention and the damage caused, the expression of COX, CCR mRNA and protein decreased obviously. Yet, all of the three gained a dramatic increase when the berberine, BM-MSCs or the combination of the two were added (P<0.01 orP<0.05), among which the combination worked more effectively. Conclusions The berberine, BM-MSCs and the joint use of the two could improve the energy metabolism of HUVECs, which had been damaged by high glucose, probably because the berberine and BM-MSCs could up-regulate the expression of COX, CCR mRNA and protein, which leads to the hydrolyzation of glucose oxide and thus the improvement of blood environment and the enhancement of glucose's supply and intake of HUVECs. Then, here comes the final result: the improvement of the energy metabolism of damaged vascular endothelial cells by high glucose.

berberine; bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs); vascular endothelial cells; damage by high glucose; energy metabolism; cytochrome C oxidase (COX); cytochrome C reductase (CCR)

2016-07-13，

2016-08-12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81573956，81273753)；中西醫(yī)結(jié)合防治心腦疾病的相關(guān)基礎(chǔ)研究湖南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)開(kāi)放基金項(xiàng)目(No 2015CXTD-4);中西結(jié)合基礎(chǔ)湖南省“十二五”重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放基金資助項(xiàng)目(No ZXJCXK201514)；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)經(jīng)典理論與經(jīng)方應(yīng)用研究科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)

李 玲(1983-)，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：內(nèi)分泌疾病的中醫(yī)藥防治，E-mail: 185738041@qq.com；

喻 嶸(1969-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：內(nèi)分泌疾病的中醫(yī)藥防治，通訊作者，E-mail: yurong8072@qq.com

時(shí)間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.040.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.020

A

1001-1978(2016)11-1585-07

R329.24；R284.1；R322.12；R329.24；R349.1；R977.3