輪蟲在環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

楊曉凡，徐曉平

(1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000；2.安徽工程大學(xué)建筑工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000)

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輪蟲在環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

楊曉凡1，徐曉平2

(1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000；2.安徽工程大學(xué)建筑工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000)

環(huán)境微生物學(xué)是高等學(xué)校環(huán)境工程的專業(yè)基礎(chǔ)課，該課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中包括大量原核微生物，實(shí)驗(yàn)難度較大。為了克服上述問題，結(jié)合教師科學(xué)研究項(xiàng)目，選擇培養(yǎng)簡(jiǎn)單、繁殖迅速的微型后生動(dòng)物輪蟲作為測(cè)試對(duì)象，新開了6個(gè)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。結(jié)果表明，輪蟲在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用突出了環(huán)境專業(yè)的特點(diǎn)，提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，取得顯著的教學(xué)成效。

輪蟲；環(huán)境微生物學(xué)；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)作為培養(yǎng)環(huán)境工程類工科人才的實(shí)踐性教學(xué)環(huán)節(jié)，對(duì)培養(yǎng)學(xué)生運(yùn)用微生物知識(shí)解決實(shí)際環(huán)境問題的能力和開發(fā)學(xué)生的創(chuàng)造力至關(guān)重要。安徽工程大學(xué)于2004年開辦了環(huán)境工程專業(yè)，在數(shù)十年的教學(xué)實(shí)踐中不斷發(fā)現(xiàn)問題并進(jìn)行創(chuàng)新和嘗試，在環(huán)境工程微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)上積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。筆者結(jié)合環(huán)境學(xué)科教師科研方向，選擇微型后生動(dòng)物輪蟲作為測(cè)試生物，依托環(huán)境學(xué)科的師資力量開展了新的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，融合了環(huán)境學(xué)科教學(xué)與科研資源，強(qiáng)化了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的學(xué)科特性，收到了較好的成效。

1 實(shí)驗(yàn)教學(xué)面臨的問題與發(fā)展困境

以往的環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)存在很多問題：實(shí)驗(yàn)生物以單一的原核微生物為主；教學(xué)體系上簡(jiǎn)單地延續(xù)了生物技術(shù)或生物工程類等生物專業(yè)實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)難度較大，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)之間連續(xù)性和遞進(jìn)性不強(qiáng)；內(nèi)容與工程實(shí)踐應(yīng)用脫節(jié)，常用的環(huán)境微生物很少被提及，難以激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)和探索的興趣。另一方面，環(huán)境工程專業(yè)涉及化學(xué)、水力學(xué)、測(cè)量學(xué)、微生物學(xué)、電工學(xué)等諸多基礎(chǔ)學(xué)科，由于師資條件的限制，教學(xué)任務(wù)不可能在1個(gè)專業(yè)甚至1個(gè)學(xué)院完成，跨專業(yè)和學(xué)科師資共享是常態(tài)，從而給實(shí)驗(yàn)教學(xué)的專業(yè)性和實(shí)踐特性的提升帶來困難。目前，很多學(xué)校環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)依托生物專業(yè)或基礎(chǔ)教學(xué)部門開設(shè)，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容強(qiáng)調(diào)微生物學(xué)共性，很難體現(xiàn)環(huán)境微生物學(xué)的專業(yè)特性，在一定程度上影響教學(xué)質(zhì)量的提高。

2 輪蟲在生態(tài)環(huán)境中的地位和應(yīng)用

2.1 輪蟲的生物學(xué)特征 輪蟲是袋形動(dòng)物門輪蟲綱近2 000種微小無脊椎動(dòng)物的統(tǒng)稱，廣泛分布于湖泊、池塘、江河、近海等各類淡、咸水水體中。常見的有旋輪屬(Philodina)、豬吻輪屬(Dicraniphorus)、腔輪屬(Lecane)和水輪屬(Epiphanes)等。輪蟲形體微小，一般長(zhǎng)40～200 μm,身體為長(zhǎng)形，分頭、軀干和足，頭部有纖毛組成的能轉(zhuǎn)動(dòng)的輪盤，形如車輪，故稱為輪蟲。輪蟲雌雄異體，卵生，多為孤雌生殖(圖1)[1]。

圖1 輪蟲雌體形態(tài)結(jié)構(gòu)模擬Fig.1 Simulation of female morphology and structure

2.2 水生態(tài)鏈中的關(guān)鍵生物 在水生環(huán)境中，輪蟲是后生動(dòng)物中擁有最高繁殖速率的一個(gè)類群，在各類淡水水體中，其密度通常在 1 000 個(gè)/L以上[2-3]，在食物充足的條件下更高[4-6]。輪蟲能夠極其迅速地?fù)屨忌鷳B(tài)系統(tǒng)中空生態(tài)位，將初級(jí)生產(chǎn)量(藻類和細(xì)菌等)轉(zhuǎn)化成次級(jí)消費(fèi)者(昆蟲、甲殼動(dòng)物和魚類的幼體等)可利用的形式，轉(zhuǎn)換效率高，繁殖快，總浮游生物現(xiàn)存量的30%由其產(chǎn)生。因此，輪蟲在生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)功能、能量傳遞及物質(zhì)轉(zhuǎn)換上發(fā)揮重要作用[7]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，輪蟲是蝦、蟹及魚類等水產(chǎn)幼苗的優(yōu)質(zhì)食物[8]。

2.3 凈化水質(zhì) 輪蟲的輪形器官造成水的旋動(dòng)，使水流向其頭部前端，以便于捕食水流卷來的細(xì)菌、霉菌、藻類、原生動(dòng)物以及有機(jī)微顆粒，阻止水體因過多有機(jī)物停滯而造成水質(zhì)污染。輪蟲的廢棄產(chǎn)物會(huì)結(jié)合成黏性團(tuán)塊，能吸附其他有機(jī)物的顆粒，增強(qiáng)水體的深沉性能，從而凈化水質(zhì)。針對(duì)輪蟲的這一作用，可將輪蟲運(yùn)用于水污染綜合治理實(shí)踐中[9]。

2.4 指示生物 輪蟲是污水處理廠出水達(dá)標(biāo)的指示生物。輪蟲在活性污泥廢水處理系統(tǒng)正常運(yùn)行，且有機(jī)物含量較低以及出水水質(zhì)良好時(shí)才會(huì)出現(xiàn)，故輪蟲的存在說明污水處理效果較好。但是豬吻輪蟲是生化池運(yùn)行失調(diào)的指示生物，因污泥齡較長(zhǎng)，負(fù)荷較低，污泥因缺乏營(yíng)養(yǎng)而老化解絮，豬吻輪蟲可因污泥碎屑增多而大量繁殖，這是污泥老化解絮標(biāo)志[10]。富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重影響輪蟲的種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量[11-12]，因此輪蟲也是水體富營(yíng)養(yǎng)化的指示生物。輪蟲對(duì)被測(cè)試化學(xué)物質(zhì)敏感[13-15]，是有毒物質(zhì)環(huán)境毒理測(cè)試?yán)硐氲闹甘旧铩?0世紀(jì)90年代初，美國(guó)材料與實(shí)驗(yàn)協(xié)會(huì)(ASTM)開始以輪蟲作為測(cè)試生物制定了水質(zhì)急性毒性測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)[16]。

2.5 抑制生物膜的老化 根據(jù)生物膜的生長(zhǎng)過程，生物膜經(jīng)過潛伏期、增長(zhǎng)期和穩(wěn)定期之后，必將進(jìn)入老化脫落期，影響生物膜的活性和污水處理效果。輪蟲可作為生物膜法應(yīng)用的理想微型動(dòng)物，可以延長(zhǎng)生物膜上食物鏈的長(zhǎng)度，增強(qiáng)對(duì)低營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物的捕食強(qiáng)度，達(dá)到去除過量生物膜的目的。在生物膜處理中，輪蟲的參與可以有效控制細(xì)菌的數(shù)量和增強(qiáng)生物膜活性[9]。

輪蟲在生態(tài)環(huán)境及水生物處理工程中應(yīng)用廣泛，是真核生物域微型后生動(dòng)物的典型代表，因此，輪蟲知識(shí)是環(huán)境專業(yè)學(xué)生應(yīng)該掌握的基礎(chǔ)知識(shí)。目前，輪蟲是環(huán)境生態(tài)學(xué)中的一個(gè)研究熱點(diǎn)，將其引入實(shí)驗(yàn)教學(xué)，能夠促進(jìn)教學(xué)和科研的融通，并且輪蟲培養(yǎng)方便，增殖迅速，具有生物實(shí)驗(yàn)材料的通性。因此，輪蟲的引入有利于化解環(huán)境微生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)窘境，增強(qiáng)教學(xué)的專業(yè)相關(guān)性，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。

3 輪蟲在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用方法

輪蟲作為實(shí)驗(yàn)生物材料，實(shí)驗(yàn)周期可控，操作簡(jiǎn)單。其在環(huán)境工程微生物實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)用除了顯微鏡的使用和微生物的形態(tài)觀察、液體培養(yǎng)基的配制與滅菌、微生物的計(jì)數(shù)和測(cè)量等常規(guī)微生物專項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，還涉及輪蟲的急性毒性、藻類生長(zhǎng)抑制、水體富營(yíng)養(yǎng)化評(píng)價(jià)與治理等實(shí)踐性實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)將主要的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用和方法總結(jié)如下。

3.1 輪蟲的采集與培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)材料包括旋輪蟲或萼花臂尾輪蟲，采自校園池塘水，喂食斜生柵藻。斜生柵藻由中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所提供。HB-4培養(yǎng)液[17]培養(yǎng)斜生柵藻，輪蟲培養(yǎng)液采用EPA配方[18]。輪蟲和斜生柵藻置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度(20±1) ℃，光照與黑暗比為16 h∶8 h。輪蟲培養(yǎng)液7 d更換2次，保持投藻密度為2.0×106～3.0×106cells/mL。斜生柵藻培養(yǎng)液需要人工配制后溫?zé)釡缇?，因此可以讓學(xué)生掌握液體培養(yǎng)基的配制方法，理解濕熱滅菌的過程和原理。在培養(yǎng)過程中，輪蟲可就地取材，突出環(huán)境微生物學(xué)的實(shí)踐特性。

3.2 顯微鏡的使用和微生物的觀察 實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖亲寣W(xué)生熟練掌握顯微鏡的操作方法，并觀察不同種屬輪蟲以及斜生柵藻等微生物的個(gè)體形態(tài)，學(xué)會(huì)繪制生物圖。吸取1滴實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的高密度旋輪蟲、萼花臂尾輪蟲培養(yǎng)液，輕輕滴在載玻片上，不蓋蓋玻片。破壞液滴的凝聚狀態(tài)下，直接在顯微鏡下觀察液膜里的輪蟲運(yùn)動(dòng)和形態(tài)。如有必要，可以采用甲醛固定。以同樣的方法觀察活性污泥中的豬吻輪蟲以及其他原生動(dòng)物。

3.3 微生物的計(jì)數(shù) 在實(shí)驗(yàn)過程中，指導(dǎo)學(xué)生利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)斜生柵藻的濃縮液進(jìn)行稀釋并計(jì)數(shù)，計(jì)算一定體積輪蟲培養(yǎng)液的斜生柵藻的濃縮液投放量，配制不同濃度的藻培養(yǎng)液。在實(shí)驗(yàn)過程中，可先指導(dǎo)學(xué)生對(duì)不同密度的輪蟲水樣進(jìn)行計(jì)數(shù)，由簡(jiǎn)入繁，實(shí)驗(yàn)材料從真核生物藻跨越到后生動(dòng)物輪蟲，豐富了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。

3.4 水生生物毒性測(cè)定 輪蟲生態(tài)毒理學(xué)研究常用的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)主要集中在死亡率、行為學(xué)、繁殖和種群動(dòng)態(tài)、生化指標(biāo)等方面。實(shí)驗(yàn)中以Cr6+為例，研究重金屬對(duì)輪蟲的急性毒性效應(yīng)。設(shè)置不同的Cr6+暴露濃度，分別盛入5 mL的小燒杯，每個(gè)小燒杯放入10個(gè)輪蟲，重復(fù)3次，設(shè)無菌水空白對(duì)照，分別于24和48 h觀察輪蟲的存活量，以濃度的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，死亡率的概率單位為縱坐標(biāo)，通過回歸方程求得24和48 h的半致死濃度。微藻也是敏感的指示生物，可采用投喂輪蟲的斜生柵藻作為生物材料，開展環(huán)境污染物對(duì)指數(shù)生長(zhǎng)期斜生柵藻的抑制實(shí)驗(yàn)，96 h后應(yīng)用血球計(jì)數(shù)板或浮游植物計(jì)數(shù)框在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，觀察污染物暴露濃度對(duì)藻的生長(zhǎng)量的影響，計(jì)算半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)。

3.5 水體富營(yíng)養(yǎng)化的評(píng)價(jià) AGP實(shí)驗(yàn)是研究水體富營(yíng)養(yǎng)化問題的一個(gè)重要手段。在飼養(yǎng)輪蟲過程中，以投喂輪蟲的斜生柵藻為測(cè)試生物開展了藻類的潛在生產(chǎn)力實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)液用濾膜(1.2 μm)或高壓滅菌器(121 ℃，15 min)除去固體懸浮物(SS)和雜菌。取500 mL置于L型培養(yǎng)管(1 000 mL)，接入斜生柵藻，將培養(yǎng)管放入往復(fù)振蕩搖床上，在20 ℃、光照為4 000～6 000 lx條件下振蕩培養(yǎng)10 d(光周期同上)。取適量培養(yǎng)液和濾膜過濾，置于105 ℃烘至恒重，稱干重，計(jì)算1 L藻類的干重即為該水樣的AGP，也可采用葉綠素a法測(cè)定富營(yíng)養(yǎng)化水體中的藻量。

3.6 生物之間的捕食關(guān)系 為了讓學(xué)生更加深刻地理解微生物之間的生態(tài)關(guān)系，在教學(xué)中以輪蟲和斜生柵藻為研究對(duì)象，觀察二者之間的捕食關(guān)系。吸取輪蟲300以上，培養(yǎng)于10 mL的玻璃試管中，并投喂一定濃度(1.0×106～5.0×106cells/mL)的藻類食物，培養(yǎng)共持續(xù)10 h。培養(yǎng)過程中，每隔2、4、6、8 h抽樣計(jì)數(shù)各試管內(nèi)輪蟲和藻細(xì)胞密度，繪制密度隨時(shí)間變化曲線。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證2種微生物之間的捕食關(guān)系，為富營(yíng)養(yǎng)化水體的生態(tài)治理奠定理論基礎(chǔ)。

4 教學(xué)效果和展望

輪蟲具有繁殖快速、培養(yǎng)容易和成本低廉的特點(diǎn)，是理想的環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)材料。圍繞輪蟲開展相關(guān)環(huán)境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是安徽工程大學(xué)環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的一項(xiàng)創(chuàng)新。通過往屆教學(xué)效果的比較，發(fā)現(xiàn)相對(duì)傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，新開設(shè)的以輪蟲為中心的實(shí)驗(yàn)體系既能提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)技能(顯微鏡的使用、微生物的形態(tài)觀察、計(jì)數(shù)等)，又能提高學(xué)生的專業(yè)知識(shí)(有害污染物毒性、水體富營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)和生態(tài)鏈關(guān)系)；另一方面，輪蟲是安徽工程大學(xué)環(huán)境學(xué)科研究方向之一，在完成教學(xué)計(jì)劃的同時(shí)，讓更多的本科生參與教師的科學(xué)研究，整合了教學(xué)和科研資源，達(dá)到了教、學(xué)、研相互促進(jìn)的良性互動(dòng)效果。

在未來強(qiáng)化學(xué)科排名為導(dǎo)向的辦學(xué)模式中，緊緊圍繞環(huán)境學(xué)科開設(shè)環(huán)境專業(yè)基礎(chǔ)課，有利于環(huán)境學(xué)科的發(fā)展，有利于環(huán)境專業(yè)人才的培養(yǎng)。因此，在環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)改革方面，應(yīng)進(jìn)一步拓展包括輪蟲在內(nèi)的其他環(huán)境常用微生物的應(yīng)用范圍，完善其在基礎(chǔ)教學(xué)中的應(yīng)用。在基礎(chǔ)學(xué)科教學(xué)改革中，輪蟲在環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用和經(jīng)驗(yàn)值得借鑒。

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Application of Rotifer in Environmental Microbiology Experiment Teaching

YANG Xiao-fan1, XU Xiao-ping2

(1. College of Biological and Chemical Engineering, Anhui Polytechnic University, Wuhu, Anhui 241000; 2. College of Civil Engineering and Architecture, Anhui Polytechnic University, Wuhu, Anhui 241000)

The environmental microbiology is a professional basic course in environmental engineering of higher education, and the experiment teaching of the course includes a large number of prokaryotic micro-organisms which give some degree of difficulty. In order to solve the problem, the micro-metazoa rotifer was selected as the test object, for its simple culture and frequent reproducing, and 6 experiments were set up combined with the teachers' scientific research. The application of rotifer, which has highlighted the professional characteristic of environmental engineering, has stimulated students’ interest and achieved remarkable teaching effect.

Rotifer; Environmental microbiology; Experiment teaching

安徽省高等教育提升計(jì)劃(TSKJ2016B016)；安徽工程大學(xué)教育教學(xué)研究項(xiàng)目。

楊曉凡(1978-)，男，安徽壽縣人，講師，博士，從事生態(tài)毒理與水污染治理研究。

2016-08-12

S-01

A

0517-6611(2016)28-0256-03