茵陳總黃酮的提取及富集工藝

郭文娟，王娜娜，代 昭，張瑞平，李香華

（天津工業(yè)大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，天津 300387）

茵陳總黃酮的提取及富集工藝

郭文娟，王娜娜，代 昭，張瑞平，李香華

（天津工業(yè)大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，天津 300387）

采用超聲波輔助提取法對茵陳總黃酮的提取和富集工藝進(jìn)行研究，用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化茵陳總黃酮的最優(yōu)提取工藝為：在40℃時(shí)，以料液比1∶15（g/mL）的蒸餾水超聲提取60 min.以6種大孔吸附樹脂對茵陳總黃酮的富集作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明D101型樹脂對黃酮的吸附和解吸附效果最好.進(jìn)一步優(yōu)化最佳富集工藝條件為：上樣液質(zhì)量濃度0.55 mg/mL，pH 4.04，體積流量1.5 BV/h，洗脫溶劑乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%.

茵陳；大孔吸附樹脂；黃酮；富集；正交試驗(yàn)

茵陳是濱蒿（Artemisia scoparia Waldst.et kit）或茵陳蒿（Artemisia capillaris Thunb.）的干燥地上部分［1］，是一種傳統(tǒng)中藥，具有清熱利濕、利膽退黃和顯著的保肝作用.黃酮類化合物［1-3］是茵陳的主要有效成分，其藥理學(xué)活性廣泛，具有抗氧化［4-5］、抗腫瘤［4，6］、抗病毒等活性［7-8］.然而，因茵陳藥用部位為地上全草，葉綠素含量高，給茵陳黃酮類有效成分的提取和純化造成了困難.

大孔吸附樹脂是一種高分子材料，近年發(fā)展起來應(yīng)用于各種天然產(chǎn)物的吸附分離，具有吸附性能好［7-10］、適用范圍廣［11］、選擇性高［12］、價(jià)格低廉［7］以及再生處理方便［10，12］等優(yōu)點(diǎn)，將大孔吸附樹脂應(yīng)用于茵陳總黃酮的分離純化，將有望提高茵陳總黃酮的純度和收率，為茵陳總黃酮的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)踐參考.

本實(shí)驗(yàn)通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)探討超聲波輔助法提取茵陳總黃酮的最佳工藝條件，并選擇6種大孔吸附樹脂，包括D101、ADS-17、FL-2、LSA-21、HPD450和YWD07a，對茵陳總黃酮的富集作用進(jìn)行研究，獲得了茵陳總黃酮的大孔吸附樹脂最佳富集工藝，為茵陳總黃酮的應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及材料

儀器：765MC紫外可見分光光度計(jì)，上海光學(xué)儀器廠產(chǎn)品；KH-250B超聲波提取器，濟(jì)南博鑫生物技術(shù)公司產(chǎn)品；TD2002A電子天平，上海銀澤儀器設(shè)備公司產(chǎn)品；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮儀器廠產(chǎn)品；DK-S24電熱式恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器公司產(chǎn)品；101-2A電熱恒溫干燥箱，成都浩馳儀器公司產(chǎn)品.

材料：茵陳藥材，安徽千草藥業(yè)產(chǎn)品，經(jīng)鑒定為茵陳蒿（A.capillaris）；蘆丁對照品，中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；大孔樹脂D101、ADS-17、LSA-21，南開大學(xué)化工廠產(chǎn)品；大孔樹脂HPD450、YWD07a、FL-2，天津市海光化工有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純.

1.2 茵陳總黃酮的含量測定［13］

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.000 mg，置于50 mL容量瓶中用70%的乙醇定容得標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別在25 mL容量瓶中精密加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.3 mL 5%的亞硝酸鈉（NaNO2）溶液，搖勻后靜置6 min；再加入0.3 mL 10%的硝酸鋁（Al（NO3）3）溶液，搖勻后靜置6 min；再加4%的氫氧化鈉溶液4.0 mL，用70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置12 min，以70%乙醇作空白，用紫外分光光度計(jì)于510 nm處測定吸光度A，得標(biāo)準(zhǔn)曲線A=10.863C-0.002 9，R2= 0.999 2.式中：A為510 nm處吸光度；C為質(zhì)量濃度（mg/mL）.并進(jìn)行穩(wěn)定性、精密性、重現(xiàn)性、回收率實(shí)驗(yàn)，其RSD%值均小于2%.

1.3 總黃酮的提取工藝

本文利用功率為250 W的超聲提取器提取茵陳中總黃酮，選用L9（34）正交表，以料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）和乙醇濃度（D）為實(shí)驗(yàn)因子，各因子設(shè)3個(gè)水平，如表1所示.每組試驗(yàn)平行重復(fù)3次，用SPSS 20分析數(shù)據(jù).

表1 正交試驗(yàn)L9（34）因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test L9（34）design

1.4 大孔吸附樹脂預(yù)處理

稱取適量樹脂，用0.5倍體積的乙醇先充分浸泡24 h后裝柱，并用2～5倍體積的乙醇流通樹脂，至流出液與水混合無白色渾濁，再用大量蒸餾水沖洗樹脂至無醇味；然后用5%HCl沖洗樹脂，并浸泡3 h，用大量蒸餾水洗至中性，最后用5%NaOH沖洗樹脂，并浸泡3 h，大量蒸餾水洗至中性，抽干后備用［7］.

1.5 不同型號大孔樹脂的篩選

將已處理好的6種大孔樹脂分別稱取2.0 g，精密稱量3次，置于6個(gè)具塞三角瓶中，各加入質(zhì)量濃度為0.55 mg/mL的茵陳母液50 mL，置于恒溫?fù)u床中振搖2 h（60 r/min），取出放置24 h后過濾，對濾液進(jìn)行總黃酮的測定.將過濾后的樹脂加入70%乙醇30 mL，于恒溫?fù)u床中振搖2 h（60 r/min），取出放置24 h后過濾，對濾液進(jìn)行總黃酮含量的測定.根據(jù)結(jié)果計(jì)算吸附量和吸附率、解吸附量和解吸率［14-15］.

大孔樹脂吸附量、吸附率、解吸附量、解吸附率的計(jì)算公式如下：

式中：C0為吸附前溶液中黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）；C′為吸附后溶液中黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）；C為解吸液中黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）；V0為吸附前溶液體積（mL）；V為解吸溶液體積（mL）；W為樹脂質(zhì)量（g）.

1.6 富集純化工藝影響因素

1.6.1 上樣液質(zhì)量濃度的影響

取5份處理好的D101型樹脂2.0 g于100 mL具塞錐形瓶中，精確加入不同總黃酮質(zhì)量濃度的供試液50 mL，置于恒溫振蕩器中振蕩4 h后過濾，上清液測定茵陳總黃酮含量，計(jì)算吸附量、吸附率.樹脂再精密加入30 mL 70%乙醇溶液，于恒溫?fù)u床中振搖2 h后過濾，上清液測定茵陳總黃酮含量，計(jì)算解吸附量、解吸附率［16］.

1.6.2 上樣液pH值的影響

稱取6份處理好的D101型樹脂各2.0 g，分別加入總黃酮質(zhì)量濃度為0.55 mg/mL的母液50 mL，調(diào)節(jié)pH值，振蕩吸附4 h后過濾，上清液測定茵陳總黃酮含量，計(jì)算吸附量與吸附率.過濾后的樹脂精密加入70%乙醇溶液30 mL，于恒溫水浴箱中振搖2 h后過濾，上清液測定茵陳總黃酮含量，計(jì)算解吸附量和解吸附率［16-18］.

1.6.3 上樣體積流量的影響

取茵陳提取液50 mL（0.55 mg/mL），以不同的體積流量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 BV/h）上樣，柱體積為10 mL.測定吸附后溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附率［12，19］.

1.6.4 洗脫溶劑乙醇濃度的影響

稱取6份已經(jīng)處理好的D101型樹脂各2.0 g，分別加入總黃酮質(zhì)量濃度為0.55mg/mL的母液50mL，振蕩吸附4 h后過濾分離樹脂，樹脂中分別加入30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液30 mL，恒溫震蕩2 h，進(jìn)行解吸附，計(jì)算解吸附率［12］.

2 結(jié)果與討論

2.1 正交實(shí)驗(yàn)分析正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析分別如表2、表3所示.

表2 總黃酮提取率正交試驗(yàn)L9（34）結(jié)果Tab.2 Result of extraction rate of flavonoids on orthogonal test L9（34）

表3 不同因素對總黃酮提取的方差分析Tab.3 Variance analysis of different factors on extraction rate of flavonoids

從表2和表3中可以看出，各因素對茵陳總黃酮提取的影響程度為D＞A＞B＞C，即提取溶劑乙醇濃度對黃酮的提取效果影響最大，而影響最小的是提取時(shí)溫度.方差分析結(jié)果表明料液比、提取時(shí)間、提取溫度及溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對茵陳中總黃酮含量的提取的影響達(dá)到極顯著（P＜0.01）.因此確定超聲波提取茵陳總黃酮的最佳提取條件：用蒸餾水超聲提取，料液比1∶15（g/mL），提取時(shí)間60 min，提取溫度40℃.

2.2 最佳提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

平行稱取3份茵陳藥材5.0 g，按上述最佳提取方法進(jìn)行驗(yàn)證，總黃酮含量分別為75.16、71.27和72.72 mg/g，結(jié)果顯示此工藝穩(wěn)定可行.

2.3 不同型號大孔樹脂的篩選結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)以吸附/解吸附率為篩選指標(biāo)，尋找最合適的大孔樹脂來純化茵陳中總黃酮，其結(jié)果如圖1所示.

圖1 不同型號大孔樹脂的吸附和解吸作用Fig.1 Effect of adsorption and desorption of different macroporous resin

不同型號樹脂對總黃酮的吸附/解吸率不同，從圖1中可以看出，ADS-17和D101型樹脂對總黃酮的吸附率較其他樹脂要高，而FL-2型樹脂對總黃酮的吸附率最低，這主要與樹脂本身的結(jié)構(gòu)和性能有關(guān)［12］，如表面積、平均孔徑以及吸附力等；此外，D101樹脂的解吸附率要比其他樹脂稍高.綜合考慮，與其他樹脂相比D101擁有較好的吸附和解吸附能力，因此選擇D101進(jìn)行黃酮的分離.

2.4 不同因素對黃酮富集純化的影響

2.4.1 上樣液質(zhì)量濃度的影響

上樣液質(zhì)量濃度對大孔樹脂分離純化黃酮有很大的影響，如圖2所示.

圖2 上樣液質(zhì)量濃度對黃酮富集純化的影響Fig.2 Effect of sampling concentration on flavonoid-enriched purified

由圖2可以看出，隨著上樣液質(zhì)量濃度的增大，吸附率逐漸減小，上樣液質(zhì)量濃度較低時(shí)，吸附率較高，但是不能完全發(fā)揮樹脂的作用，浪費(fèi)樹脂且生產(chǎn)效率低；濃度太大，樹脂的吸附量增加，但同時(shí)泄漏較多，造成了藥液的浪費(fèi).綜合考慮吸附率和解吸附率，在上樣液質(zhì)量濃度為0.550 mg/mL時(shí)，有較好的吸附率和解吸附率.

2.4.2 上樣液pH值的影響

上樣液初始pH值對茵陳總黃酮富集純化的影響如圖3所示.

圖3 上樣液pH對黃酮富集純化的影響Fig.3 Effect of pH on flavonoid-enriched purified

上樣液初始pH值是影響溶質(zhì)和吸附劑之間的親和力，從而影響了吸附劑吸附能力的最重要參數(shù).由圖3可知，上樣液pH偏酸或者偏堿時(shí)，樹脂的吸附率都偏低，總黃酮的最高吸附容量出現(xiàn)在上樣液pH為4.04時(shí)，這是因?yàn)榭傸S酮含有許多羥基和酚羥基，呈弱酸性，所以在弱酸性溶液中是比較容易被吸附的，而在強(qiáng)酸條件下，總黃酮易生成佯鹽；在偏堿條件下，會(huì)破壞總黃酮的結(jié)構(gòu)，都不利于其吸附.

2.4.3 上樣體積流量的影響

上樣液體積流量對樹脂的吸附能力也有一定的影響，如圖4所示.

圖4 上樣液體積流量對黃酮吸附率的影響Fig.4 Effect of volumetric flow on flavonoid adsorption rate

由圖4可見，當(dāng)體積流量較小時(shí)，上樣液流速慢，黃酮和大孔樹脂充分接觸，吸附率較大；當(dāng)體積流量增大時(shí)，上樣液流速也增大，樣液吸附時(shí)間短，吸附率低.在體積流量從0.5 BV/h增加到1.5 BV/h時(shí)，吸附率變化平緩，在實(shí)驗(yàn)中，綜合考慮縮短吸附時(shí)間和增大吸附量，上樣液體積流量控制在1.5 BV/h.

2.4.4 洗脫溶劑乙醇濃度的影響

洗脫溶劑乙醇濃度對茵陳總黃酮解吸附率的影響如圖5所示.

圖5 洗脫劑乙醇濃度對黃酮解吸附率的影響Fig.5 Effect of eluent concentration on flavonoids desorption rate

由圖5可見，隨乙醇濃度不斷增加解吸附率變化較大，呈上升趨勢，當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到70%和80%時(shí)解吸附率達(dá)到最大.這是由于乙醇濃度小時(shí)，其極性與黃酮極性相差較大，而當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，兩者極性相近，在用其洗脫時(shí)能最大限度地把黃酮類物質(zhì)解吸下來.在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)，洗脫液比較渾濁，可能會(huì)把其它雜質(zhì)洗脫下來.

3 結(jié)論

（1）本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)L9（34）優(yōu)化了超聲波提取茵陳總黃酮的工藝條件，最優(yōu)條件為用蒸餾水以1∶5（g/mL）的料液比在40℃時(shí)超聲60 min，黃酮總提取量達(dá)到75 mg/g左右.

（2）本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大孔樹脂的吸附/解吸能力與其本身的結(jié)構(gòu)特性有密切關(guān)系［12］.6種不同型號的大孔吸附樹脂對總黃酮的吸附率不同，F(xiàn)L-2型樹脂吸附率最小，D101型樹脂最好，其吸附率和解吸率都能達(dá)到80%以上，所以D101型樹脂可用于茵陳總黃酮的富集純化，并可進(jìn)一步應(yīng)用于茵陳總黃酮的精制.

（3）用大孔樹脂純化茵陳中總黃酮物質(zhì)需要控制的因素很多，不同因素對茵陳中黃酮富集純化的影響差別較大，在上樣液質(zhì)量濃度為0.55 mg/mL時(shí)，有較好的吸附率和解吸附率；上樣液初始pH為4.04時(shí)，黃酮的吸附率最高；上樣液體積流量為1.5 BV/h，縮短了吸附時(shí)間、增大了吸附量，同時(shí)又較好的吸附率；洗脫劑乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，對總黃酮的解吸附效果最好，89%的黃酮都能洗脫下來.

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Extraction and enrichment process of total flavonoids from Artemisia capillaris Thunb.

GUO Wen-juan，WANG Na-na，DAI Zhao，ZHANG Rui-ping，LI Xiang-hua
（School of Environmental and Chemical Engineering，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300387，China）

The extraction and enrichment of total flavonoids from Artemisia capillaris Thunb.were studied by ultrasonic assistant extraction.The optimal extraction process obtained by orthogonal experiment was extraction 60 min by ultrasonic with distilled water at 40℃and liquid ratio was 1∶15（g/mL）.Six kinds of macroporous resin were used to study the enrichment of flavonoids，and the results showed that D101 resin was the most appropriate.Further optimizing the optimum conditions for the enrichment process，when the conditions were the sampling concentration of 0.55 mg/mL，pH 4.04，volume flow rate of 1.5 BV/h，and ethanol concentration of 70%，the purified flavonoids could be scientifically and reasonably separated.

Artemisia capillaris Thunb.；macroporous resin；flavonoids；enrichment；orthogonal experiment

TQ461

A

1671-024X（2016）05-0037-05

10.3969/j.issn.1671-024x.2016.05.007

2016-06-30

天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（15JCYBJC20500）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203046）

郭文娟（1980—），女，博士，副教授，主要研究方向?yàn)楦叻肿硬牧显谔烊划a(chǎn)物中的應(yīng)用.E-mail：guowenjuan@tjpu.edu.cn