左卡尼汀對(duì)D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

欒海云

(濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003)

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左卡尼汀對(duì)D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

欒海云

(濱州醫(yī)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003)

目的 觀察左卡尼汀對(duì)D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。方法 50只小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組和左卡尼汀低、中、高劑量組(0.25、0.5、1.0 g·kg-1·d-1)，共5組。采用D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉復(fù)制衰老模型，實(shí)驗(yàn)6 w后檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能，測(cè)定腦中皮層和海馬組織超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA) 含量。結(jié)果 模型組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能下降，逃避潛伏期延長(zhǎng)；腦組織SOD、GSH-Px活性降低，MDA 含量增高。左卡尼汀組能改善模型組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，顯著提高腦組織SOD、GSH-Px活性，降低MDA 水平，且呈劑量依賴性。結(jié)論 左卡尼汀可以改善衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，其機(jī)制可能與其抗氧化作用有關(guān)。

左卡尼?。凰ダ?；學(xué)習(xí)記憶；抗氧化作用

左卡尼汀(LC)是一種廣泛存在于機(jī)體組織中的氨基酸。它的主要功能是參與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的能量代謝，尤其是脂類的代謝〔1〕。課題組前期已經(jīng)成功建立了D-半乳糖引起的衰老小鼠的動(dòng)物模型，考察了LC的抗氧化作用〔2〕。本研究通過(guò)建立D-半乳糖小鼠衰老模型，觀察LC對(duì)衰老小鼠的認(rèn)知能力及腦內(nèi)抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑 D-半乳糖(Sigma公司)，LC原料藥(東北制藥總廠提供)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)試劑盒( 南京建成生物工程研究所)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 分組與給藥昆明種小鼠50只，16周齡SPF級(jí)，雄性，體重(25±5)g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2005-0017。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。隨機(jī)分為5組，每組10只，對(duì)照組，D-gal模型組，LC低、中、高劑量組。除對(duì)照組外，其他小鼠每日頸背部皮下注射D-gal 200 mg/kg聯(lián)合亞硝酸鈉45 mg/kg，每日1次，連續(xù)6 w，對(duì)照組頸背部皮下注射等體積生理鹽水。從第5周開(kāi)始，LC組繼續(xù)注射D-gal的同時(shí)，分別注射0.25、0.5、1.0 g/kg LC，對(duì)照組與模型組注射等量的生理鹽水。

1.3 行為學(xué)檢測(cè)

1.3.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d，每天分上午、下午兩段，每段2次，每次訓(xùn)練小鼠分別從4個(gè)不同的標(biāo)記點(diǎn)入水，將小鼠面向池壁放入水中。儀器將自動(dòng)記錄小鼠尋找并爬上平臺(tái)的路線圖及尋找平臺(tái)所需時(shí)間(逃避潛伏期)。若小鼠入水后60 s內(nèi)未能找到或爬上平臺(tái)，則將其引到平臺(tái)上，這時(shí)潛伏期記為60 s，讓小鼠停留10 s，再放回籠中。每次訓(xùn)練間隔60 s。

1.3.2 空間搜索實(shí)驗(yàn) 在第5天訓(xùn)練結(jié)束后撤去平臺(tái)，然后任選一個(gè)入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠在60 s內(nèi)第一次經(jīng)過(guò)原平臺(tái)的時(shí)間(潛伏期)，小鼠在60 s內(nèi)經(jīng)過(guò)平臺(tái)的次數(shù)以及在原平臺(tái)所在象限內(nèi)逗留的時(shí)間。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，眼球取血，隨后頸部脫臼處死，在冰袋上快速分離小鼠腦組織、胸腺和脾臟，并用冰冷生理鹽水清洗后濾紙吸干并稱重，計(jì)算小鼠的臟器指數(shù)：臟器指數(shù)= 臟器質(zhì)量(mg)/體重(g)。在冰袋上分離海馬和皮層，并用預(yù)冷的生理鹽水制成10%組織勻漿，4 000 r/min 4℃離心10 min，取上清液分裝于離心管中，-20℃冰箱凍存待分析。所有指標(biāo)測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 LC對(duì)衰老小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響 與對(duì)照組比較，模型組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有顯著性降低(P<0.05)；與模型組比較，LC低、中、高劑量組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有顯著升高(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠臟器指數(shù)比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

2.2 Morris 水迷宮試驗(yàn)

2.2.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 各組小鼠在學(xué)習(xí)期間，逃避潛伏期呈縮短趨勢(shì)，表明小鼠在5 d的游泳訓(xùn)練中，尋找平臺(tái)有一定的空間學(xué)習(xí)記憶能力，不過(guò)各組的學(xué)習(xí)記憶能力有所差別。模型組小鼠逃避潛伏期較其他組明顯延長(zhǎng)，說(shuō)明其出現(xiàn)明顯的空間學(xué)習(xí)記憶障礙；而LC各組小鼠逃避潛伏期介于對(duì)照組和模型組之間，說(shuō)明LC能提高衰老模型小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，見(jiàn)表2。

2.2.2 空間探索試驗(yàn) 與對(duì)照組小鼠比較，模型組小鼠在原平臺(tái)所在象限搜索時(shí)間縮短，穿越原平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.05，P<0.01)，表明模型組小鼠的空間記憶能力受到嚴(yán)重?fù)p害；而LC治療組小鼠均能明顯增加小鼠在原平臺(tái)所在象限搜索時(shí)間，增加通過(guò)目標(biāo)區(qū)域次數(shù)(P<0.05，P<0.01)，與模型組比較顯著(P<0.05，P<0.01)，表明LC各組小鼠的空間定位記憶能力較模型組有明顯改善，見(jiàn)表3。

表2 LC對(duì)衰老小鼠尋找平臺(tái)潛伏期能力的影響±s,s)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

表3 LC對(duì)衰老小鼠空間探索能力的影響

2.3 LC對(duì)D-半乳糖小鼠皮層抗氧化能力的影響 模型組小鼠皮層中SOD、GSH-Px活性均明顯低于對(duì)照組降低(P<0.01或P<0.05)。LC各組小鼠皮層中SOD、GSH-Px活性相對(duì)于模型組明顯提高(P<0.01或P<0.05)。對(duì)照組、LC各組小鼠皮層中MDA含量，相對(duì)于模型組明顯降低(P<0.01或P<0.05)，并隨著LC劑量的增大MDA含量降低得更加明顯(P<0.01或P<0.05)，見(jiàn)表4。

2.4 LC對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠海馬抗氧化能力的影響 模型組小鼠海馬中SOD、GSH-Px活性較對(duì)照組明顯降低，而LC各組小鼠海馬中SOD、GSH-Px活性相對(duì)于模型組明顯提高(P<0.01或P<0.05)。模型小鼠海馬中MDA 含量較對(duì)照組明顯升高，而LC各組MDA 含量較模型組明顯降低(P<0.01或P<0.05)，見(jiàn)表5。

表4 LC對(duì)衰老小鼠皮層SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

表5 LC對(duì)衰老小鼠海馬SOD、GSH-Px活性及MDA 含量影響

3 討 論

機(jī)體衰老是個(gè)復(fù)雜的變化過(guò)程，現(xiàn)代科學(xué)認(rèn)為自由基反應(yīng)異常是衰老的主要原因。自由基是生物體新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一類具有氧化活性的帶負(fù)電的離子，其化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)活躍〔3〕。人們已經(jīng)意識(shí)到，自由基的產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡同人體的生理、病理、生長(zhǎng)發(fā)育及疾病、衰老密切相關(guān)。D-半乳糖皮下注射后，其代謝產(chǎn)物半乳糖醇不能被進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，代謝紊亂，體內(nèi)活性氧水平升高，過(guò)量的氧自由基可引起神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，造成動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力下降及機(jī)體衰老〔4〕。亞硝酸鈉進(jìn)入體內(nèi)，使血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，從而失去攜氧能力，導(dǎo)致組織缺氧，引起大腦行為上障礙〔5〕。因此，本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉復(fù)制機(jī)體衰老相關(guān)疾病的模型。研究表明，胸腺、脾臟指數(shù)在一定程度上可間接反映衰老狀況〔6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LC有可能降低D-半乳糖引起的器官萎縮和退化，進(jìn)而延緩腦衰老過(guò)程。LC能提高衰老模型小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。且本文提示LC能有效地劑量依賴性地清除衰老機(jī)體過(guò)多生成的自由基，減輕自由基的損傷效應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，使機(jī)體各項(xiàng)生理功能得到明顯改善,起到延緩衰老的作用。

1 Strijbis K,Vaz FM,Distel B.Enzymology of the carnitine biosynthesis pathway〔J〕.IUBMB Life,2010;62(5):357-62.

2 欒海云，楊清寶，楊美子,等.左卡尼汀對(duì)衰老小鼠抗氧化作用的研究〔J〕.中國(guó)新藥雜志,2012;21(5):548-50.

3 陳 瑾.衰老的自由基機(jī)制〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2004;24(7):677-9.

4 Cui X，Zuo PP，Zhang Q，etal.Chronic systemic D-galactose exposure induces memory loss，neurodegeneration，and oxidative damage in mice:protective effects of R-a-Lipoic acid〔J〕.J Neurosci Res，2006;84:647-54.

5 陳 莉,劉曉艷，黃日越,等.烏圓補(bǔ)血口服液對(duì)D-半乳糖和亞硝酸鈉所致癡呆模型小鼠生化指標(biāo)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2009;29(10):1206-8.

6 Foster PM,Auton TR.Application of benchmark dose risk assessment methodology to developmental toxicity:an industrial view〔J〕.Toxicol Lett,1995;82-3:555-9.

〔2015-05-01修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

欒海云(1979-)，女，副教授，碩士，主要從事抗衰老藥理研究。

R743

A

1005-9202(2016)19-4731-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.026