桑葉黃酮和多糖對(duì)糖尿病大鼠血清腫瘤壞死因子-α、C反應(yīng)蛋白含量及腎功能的影響

黃立佳 杜月光 孫梽均 周宏明 呂 勃 沈晨璐 鮑徐敏

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053)

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桑葉黃酮和多糖對(duì)糖尿病大鼠血清腫瘤壞死因子-α、C反應(yīng)蛋白含量及腎功能的影響

黃立佳 杜月光1孫梽均 周宏明 呂 勃 沈晨璐2鮑徐敏

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053)

目的 研究桑葉黃酮和多糖對(duì)糖尿病(DM)大鼠血清腫瘤壞死因子(TNF)-α和C反應(yīng)蛋白(CRP)含量及腎功能的影響。方法 SD大鼠用高脂高糖飼料加小劑量鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型。將SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、桑葉黃酮治療組、桑葉多糖治療組。檢測(cè)血糖、血尿素氮、血肌酐、檢測(cè)24 h尿蛋白定量、計(jì)算腎指數(shù)；采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)大鼠血清中的CRP和TNF-α的含量。結(jié)果 ①模型組大鼠血糖、腎指數(shù)、24 h尿蛋白定量、血尿素氮和血肌酐與正常組大鼠比較均明顯升高(P<0.01)，而桑葉黃酮治療組和桑葉多糖治療組明顯低于模型組(P<0.01)。②模型組大鼠血清中CRP和TNF-α的含量明顯高于正常組(P<0.01),而桑葉黃酮治療組和桑葉多糖治療組低于模型組(P<0.05或P<0.01)。③桑葉黃酮和桑葉多糖可減輕腎臟病理變化。結(jié)論 桑葉黃酮和多糖可能通過(guò)下調(diào)糖尿病大鼠血清中TNF-α和CRP的含量，改善炎癥反應(yīng)，從而對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。

糖尿病腎??；桑葉黃酮；桑葉多糖；腫瘤壞死因子α；C反應(yīng)蛋白

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)主要的微血管并發(fā)癥，也是終末期腎衰竭(ESRF)的主要原因。目前普遍認(rèn)為糖脂代謝紊亂引起的免疫炎癥反應(yīng)在DN發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α及C反應(yīng)蛋白(CRP)可引起局部炎癥，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙或直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞等，與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)桑葉黃酮(MLF)和桑葉多糖(MLP)具有降血糖、抗炎癥的功能〔1～4〕，但對(duì)其是否可防治DN的相關(guān)研究尚甚少，本研究旨在通過(guò)觀察CRP和TNF-α在DN大鼠血液中的含量，研究桑葉黃酮和多糖對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用及從炎癥角度探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、飼養(yǎng)條件和飼料 32只健康SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重(220±20)g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)條件：清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室，溫度(23±2)℃，濕度50%～70%,分籠飼養(yǎng)，自由攝水飲食，自然晝夜光線照明。高脂飼料配方：膽固醇1%，膽鹽0.1%，豬油10%，蛋黃粉5%，全脂奶粉5%,普通飼料78.9%。

1.2 藥物與試劑 MLP和MLF(購(gòu)于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，MLP批號(hào)：ZL130915268，MLP批號(hào)：ZL131023596)，鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司)，CRP和TNF-α檢測(cè)試劑盒(杭州誠(chéng)維生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器 羅氏卓越型血糖儀及試紙；日立7020全自動(dòng)生化分析儀；Thermo牌Varioskan Flash型酶標(biāo)儀；Motic牌BA210型光學(xué)顯微鏡。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物模型復(fù)制 將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，禁食16～18 h。將STZ溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液(pH4.5)，配成1%的溶液，按30 mg/kg單次尾靜脈注射，注射當(dāng)天開(kāi)始給予高糖高脂飼料飼養(yǎng)。1個(gè)月后尾靜脈取血測(cè)定血糖，隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L，持續(xù)3 d，確定為DM大鼠模型。

1.4.2 分組與給藥 DM模型復(fù)制成功后，隨機(jī)分為模型組，治療組和MLP治療組，每組各8只，同時(shí)設(shè)立正常組。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組和治療組繼續(xù)給予高脂高糖飲食。治療組根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，MLF治療組給予MLP 40 mg/kg灌胃，MLP治療組給予MLF 150 mg/kg灌胃；模型組和正常組給予3 ml蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)8 w。

1.4.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法 于給藥8 w后，以20%烏拉坦1.5 g/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后，心臟抽血，處死大鼠。摘取腎臟，去除包膜，稱重，作長(zhǎng)軸方向?qū)η小Ｈ〔糠帜I臟固定于10%甲醛緩沖液中供病理檢測(cè)。

1.4.3.1 一般情況觀察 每日觀察大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)狀況、毛發(fā)及體重、排便情況。

1.4.3.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定空腹血糖(FBG)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)及24 h尿蛋白定量(U-TP)等生化指標(biāo)。利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法測(cè)定血液中CRP和TNF-α的含量，并分別記錄。

1.4.3.3 腎臟組織病理觀察與分析 腎組織經(jīng)10%中性甲醛固定，脫水，再石蠟包埋與切片，行HE染色，光鏡下觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件行方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察 正常組大鼠精神狀態(tài)良好，毛色白且致密，有光澤，反應(yīng)靈敏，活動(dòng)正常。模型組大鼠精神萎靡，行動(dòng)遲緩，毛發(fā)雜亂、短豎、無(wú)光澤，表現(xiàn)為多飲、多食、多尿、消瘦。MLF治療組和MLP治療組大鼠精神狀況較好，反應(yīng)較靈敏，毛色可，體重較模型組大鼠有所增加，反應(yīng)靈敏度較正常組差，但仍高于模型組。

2.2 各組大鼠生化標(biāo)指檢測(cè) 模型組GLU、BUN、Cr、腎指數(shù)、U-TP均高于正常組(P<0.01),與模型組比較，MLF治療組和MLP治療組的GLU、BUN、Cr、腎指數(shù)、U-TP均明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.3 各組大鼠血液TNF-α和CRP的含量 模型組血液TNF-α和CRP的含量明顯高于正常組(P<0.01)，而MLF治療組和MLP治療組血液TNF-α和CRP的含量低于模型組(P<0.01或P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4 各組大鼠腎組織病理變化 光鏡下HE染色可見(jiàn)正常組大鼠腎小球內(nèi)毛細(xì)血管腔張開(kāi),系膜區(qū)基質(zhì)均勻，腎小管結(jié)構(gòu)正常。模型組可見(jiàn)腎小球體積增大，系膜細(xì)胞增多，基底膜增厚，系膜區(qū)基質(zhì)增多,使血管腔變小,部分腎小管上皮細(xì)胞呈空泡變，間質(zhì)可見(jiàn)有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。治療組以上病變有不同程度的減輕。

表1 各組生化指標(biāo)、血液TNF-α和CRP的含量比較

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05

3 討 論

DN的病理基礎(chǔ)是腎小球和腎小管間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)進(jìn)行性積聚。研究證實(shí)〔5〕炎癥因子在DN 發(fā)病機(jī)制中具有非常重要的作用，可通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腎小球肥大和巨噬細(xì)胞在腎組織中的浸潤(rùn)，刺激ECM合成并抑制其降解， 促進(jìn)腎小球硬化和間質(zhì)纖維化的發(fā)生，導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生及腎臟衰竭。

TNF-α是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)重要成員，可由體內(nèi)多種細(xì)胞產(chǎn)生，可介導(dǎo)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，炎癥、免疫調(diào)節(jié)等多方面效應(yīng)。在高血糖刺激下血流動(dòng)力學(xué)改變、糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、代謝紊亂均可使腎臟局部釋放TNF-α〔6〕。TNF-α通過(guò)以下機(jī)制引起DN的發(fā)生〔7,8〕：①誘導(dǎo)產(chǎn)生氧自由基引起氧化應(yīng)激；②增加系膜細(xì)胞cAMP及cGMP的合成，促進(jìn)系膜細(xì)胞合成前列腺素和血小板活化因子增多，促進(jìn)血栓形成，使系膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生改變；③提高系膜細(xì)胞單核細(xì)胞趨化因子(MCP)-1的表達(dá)和分泌，促進(jìn)DN產(chǎn)生；④TNF-α可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；⑤誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1的表達(dá)；⑥刺激瘦素的分泌。

CRP是由肝臟合成的一種急性期反應(yīng)蛋白，CRP不僅是炎癥標(biāo)志物，而且其本身直接參與炎癥過(guò)程。正常時(shí)機(jī)體CRP含量甚微，當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染和炎癥等時(shí)CRP急劇上升。近年研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)高水平CRP與DM有關(guān)，并且可能是DN發(fā)生發(fā)展的一個(gè)危險(xiǎn)因素。CRP引起DN的機(jī)制〔7,9～11〕包括：①引起局部炎癥，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙或直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致微血管病變；②降低內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)及生物學(xué)活性；③參與氧化應(yīng)激，使低密度脂蛋白被氧化為氧化低密度脂蛋白，后者可增強(qiáng)單核細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的黏附和浸潤(rùn)；④刺激血管內(nèi)皮釋放炎癥因子ICAM-1,TNF-α及MCP-1等，促進(jìn)白細(xì)胞釋放超氧化物和蛋白水解酶，引起組織損傷；⑤激活機(jī)體凝血和補(bǔ)體系統(tǒng)，打破機(jī)體凝血和纖溶系統(tǒng)的平衡，引發(fā)血管病變，最終導(dǎo)致DN發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明炎癥反應(yīng)可能參與了DN的發(fā)生發(fā)展。

桑葉是常用中草藥之一，其中含有豐富的多糖和黃酮成分。近年來(lái)研究證實(shí)〔12〕，黃酮通過(guò)抗氧化機(jī)制清除自由基， 保持胰島β 細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整維持其正常生理功能， 從而降低DM患者血糖水平， 防止并發(fā)癥的發(fā)生。MLP通過(guò)調(diào)節(jié)糖脂代謝，降低血糖、血脂和升高胰島素水平，但其是否對(duì)DN具有保護(hù)作用及其機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)MLP可降低血糖，抑制腎臟肥大、降低尿蛋白， 防止DN的發(fā)生發(fā)展，并且可降低血中TNF-α和CRP含量。DM時(shí)高血糖、氧化應(yīng)激等因素誘導(dǎo)大量炎癥介質(zhì)釋放，加重腎臟炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎臟損傷。 由此我們推測(cè)，MLF和MLP對(duì)DN模型大鼠腎臟具有一定的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與降低血糖水平及抗氧化作用，進(jìn)而抑制炎癥因子TNF-α和CRP等的分泌有關(guān)，但這還有待進(jìn)一步研究。

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2 李先佳,任麗平,于海英,等.桑葉總黃酮對(duì)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞氧化損傷的影響〔J〕.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2013；32(6):701-4.

3 羅明琍,吳 薇,劉 偉，等.桑葉不同有效部位對(duì)2型糖尿病大鼠的降糖作用〔J〕.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2013；33(15):1221-6.

4 任巖海,劉洪鳳,韓智學(xué).桑葉多糖對(duì)2型糖尿病大鼠血糖血脂的影響〔J〕.中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2013；41(1):20-1.

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〔2015-05-01修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

浙江省新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013R410009)

1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 2 護(hù)理學(xué)院

杜月光(1968-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的中醫(yī)藥防治的實(shí)驗(yàn)研究。

黃立佳(1992-)，男，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究。

R363

A

1005-9202(2016)19-4703-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.013