絲膠對2型糖尿病大鼠肝臟胰島素受體底物-2表達(dá)的影響

邢恩鴻 付文亮 宋成軍 陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 承德 067000)

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絲膠對2型糖尿病大鼠肝臟胰島素受體底物-2表達(dá)的影響

邢恩鴻 付文亮1宋成軍1陳志宏1

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 承德 067000)

目的 研究絲膠對2型糖尿病大鼠肝臟胰島素受體底物(IRS)-2表達(dá)的影響。方法 36只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、糖尿病模型組、絲膠治療組，每組12只。采用鏈脲佐菌素連續(xù)腹腔注射法制作2型糖尿病大鼠模型。待模型成功建立后，絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4 g·kg-1·d-1)灌胃。SP免疫組織化學(xué)染色、免疫印跡法和RT-PCR檢測大鼠肝臟組織IRS-2的表達(dá)。結(jié)果 絲膠可明顯提高糖尿病模型大鼠肝臟組織IRS-2陽性細(xì)胞數(shù)、IRS-2蛋白和mRNA的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論 絲膠可通過上調(diào)糖尿病大鼠肝臟IRS-2的表達(dá)，影響胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和改善胰島素抵抗，起到降低血糖的作用。

絲膠；2型糖尿??；肝臟；胰島素受體底物-2；胰島素抵抗

胰島素受體底物(IRS)是參與胰島素及其他細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能夠被激活的胰島素受體酪氨酸激酶作用的底物，磷酸化后能結(jié)合并激活下游效應(yīng)物，是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵的中介分子。目前，已發(fā)現(xiàn)IRS家族有4個(gè)成員(IRS-1～I(xiàn)RS-4)，在組織分布、亞細(xì)胞定位、與胰島素結(jié)合以及與含SH2蛋白質(zhì)的相互作用方面存在差異。其中，IRS-2在肝臟大量表達(dá)，具有促進(jìn)肝臟糖原合成和抑制肝葡萄糖輸出的作用〔1〕。由于糖尿病發(fā)病率的升高以及化學(xué)合成降糖藥物的毒副作用，探尋能夠有效降低血糖并能控制其并發(fā)癥的天然物質(zhì)成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，絲膠蛋白(彩色蠶繭水提物)對2型糖尿病(T2DM)大鼠血糖升高和血脂代謝紊亂具有明顯的改善和預(yù)防效果，且能有效保護(hù)胰島細(xì)胞損傷〔2,3〕。但關(guān)于絲膠降糖作用的機(jī)制目前尚不明確，為此，本研究觀察了絲膠對肝臟IRS-2表達(dá)的影響，以期豐富絲膠抗T2DM作用的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級雄性SD大鼠36只，合格證號712024，體質(zhì)量200～250 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。絲膠(自制)：由承德醫(yī)學(xué)院桑蠶研究所提供彩色蠶繭，浸泡、水煎2次后合并濾液，濃縮至所需濃度。鏈脲佐菌素，美國Sigma公司；兔抗IRS-2多克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色液，武漢博士德生物工程有限公司；小鼠抗β-actin單克隆抗體，美國Santa Cruz公司；二抗(山羊抗小鼠、抗兔IgG)，美國KPL公司；IRS-2引物，上海生工生物工程有限公司合成；RT-PCR試劑盒、DNA Ladder(600 bp)，北京天根生化科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、模型的建立和給藥 36只大鼠隨機(jī)分為以下3組：①正常對照組，12只，大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不做處理。②糖尿病模型組，12只，建立T2DM大鼠模型后不做處理。建立模型的方法：2%鏈脲佐菌素(25 mg/kg)1次/d連續(xù)腹腔注射3 d，注射鏈脲佐菌素后7 d以空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L作為模型成功建立的標(biāo)準(zhǔn)。③絲膠治療組，12只，按上述方法建立2型糖尿病大鼠模型后按2.4 g/kg的劑量給予絲膠灌胃35 d(1次/d)。

1.3 取材和指標(biāo)檢測 4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采血，離心取血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。大鼠取血后處死，取肝臟，部分入Bouins液固定，部分入液氮速凍后移入-80℃冰箱保存。

1.3.1 IRS蛋白表達(dá)的檢測 (1)免疫組織化學(xué)染色及定量分析：Bouins液固定肝臟，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。采用免疫組化SP法，一抗1∶70稀釋，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以PBS代替一抗作為陰性對照，以細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃(褐)色顆粒為IRS-2蛋白免疫陽性反應(yīng)。在10×40倍顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取組織結(jié)構(gòu)保存較好的肝小葉作為觀察視野，計(jì)數(shù)免疫陽性細(xì)胞數(shù)，每組隨機(jī)選取6只大鼠的肝臟，每個(gè)肝臟選取3張切片，取平均值。(2)免疫印跡法和定量分析：取30 mg冷凍保存肝臟勻漿提取蛋白。二喹林甲酸蛋白試劑盒確定蛋白濃度，8%積層膠和7%分離膠電泳，蛋白上樣量為80 μg，4℃、2 mA/cm2轉(zhuǎn)膜2h，5%脫脂奶粉封閉過夜，一抗(IRS-2 1∶200，β-actin 1∶1 000)室溫孵育2 h，二抗(1∶5 000)1 h，Super ECL Plus超敏發(fā)光液顯影后掃描膠片。采用Quantity One 4.6.2軟件測定灰度值，以IRS-2條帶與β-actin條帶的灰度比值表示待測蛋白的相對水平。

1.3.2 IRS mRNA表達(dá)的檢測 采用RT-PCR法。取100 mg冷凍保存肝臟，在液氮中碾磨成粉末后加入Trizol提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為：42℃孵育3 min；加入反應(yīng)液Mix，42℃孵育15 min；99℃反應(yīng)3 min。PCR反應(yīng)條件：94℃，2 min；94℃，30 s；63℃，30 s；72℃，1 min，第2步起循環(huán)。PCR引物序列及擴(kuò)增條件。IRS-2正義鏈:5′-TGGAGACATTGAGATTGGTTCT-3′；反義鏈:5′-GTAAGAGCGGGGCAAAGAG-3′；退火溫度63℃；循環(huán)次數(shù)35次；產(chǎn)物大小523 bp。β-actin正義鏈:5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′；反義鏈:5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′退火溫度，57℃；循環(huán)次數(shù)35次；產(chǎn)物大小452 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后ZF型紫外透射反射分析儀攝片，應(yīng)用Quantity One 4.6.2軟件測定吸光度，以IRS-2條帶與β-actin條帶吸光度的比值作為待測基因的相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖檢測結(jié)果 糖尿病模型組大鼠的FPG水平〔(29.45±4.82)mmol/L〕明顯高于正常對照組大鼠〔(10.83±2.03)mmol/L，P<0.01〕；絲膠治療組大鼠的FPG水平明顯低于模型組〔(13.20±4.09)mmol/L，P<0.01〕。見表1。

表1 各組大鼠的肝臟IRS-2陽性細(xì)胞數(shù)和肝臟IRS-2的表達(dá)

與糖尿病模型組比較：1)P<0.01

2.2 大鼠肝臟IRS-2的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果：IRS-2免疫陽性產(chǎn)物為棕黃色和(或)棕褐色，主要位于肝細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，見圖1；免疫印跡結(jié)果、RT-PCR結(jié)果見圖2，圖3。與正常對照組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠肝臟IRS-2陽性細(xì)胞數(shù)、肝臟IRS-2蛋白及mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與糖尿病模型組大鼠比較，絲膠治療組大鼠肝臟IRS-2陽性細(xì)胞數(shù)、肝臟IRS-2蛋白及mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.01)。見表1。

圖1 大鼠肝臟組織IRS-2蛋白表達(dá)(DAB，×400)

圖2 大鼠肝臟IRS-2蛋白的表達(dá)(Western印跡法)

M.Marker；1.正常對照組；2.糖尿病模型組；3.絲膠治療組圖3 大鼠肝臟IRS-2 mRNA的表達(dá)(RT-PCR法)

3 討 論

胰島素抵抗(IR)是T2DM的主要發(fā)病機(jī)制之一，但具體的機(jī)制尚不十分明確。研究發(fā)現(xiàn)，IRS-2在IR和T2DM的發(fā)生過程中都具有重要作用〔4〕。同時(shí)敲除IRS-1和IRS-2基因，小鼠不但表現(xiàn)出IR，并且由于胰島β細(xì)胞數(shù)量的減少，小鼠同時(shí)出現(xiàn)了糖尿病的癥狀；而保留IRS-1基因、敲除IRS-2基因，小鼠則因糖尿病很快死亡〔5,6〕。另外，IRS-2還參與了其他信號的交叉反應(yīng)，如胰島素樣生長因子(IGF)-1、白介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α等，這些信號與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)4和蛋白激酶的磷酸化有關(guān)〔7,8〕。同時(shí)，IRS-2在調(diào)節(jié)胰島素在肝臟的作用中也發(fā)揮重要作用。IRS-2基因敲除的雄性小鼠，8周齡時(shí)表現(xiàn)為胰島素抑制肝葡萄糖產(chǎn)生的作用減弱，提示在肝臟存在顯著的IR〔9〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，T2DM模型大鼠肝臟IRS-2的表達(dá)明顯降低。胰島素在體內(nèi)發(fā)揮生理作用的過程包括胰島素與靶細(xì)胞胰島素受體的特異性結(jié)合、胰島素與受體結(jié)合后發(fā)生一系列生化反應(yīng)，使生物信號得以轉(zhuǎn)導(dǎo)和放大，進(jìn)而產(chǎn)生生物效應(yīng)。而IRS-2作為這一過程的重要組分，它的異常表達(dá)可導(dǎo)致胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常，進(jìn)而引發(fā)IR。

絲膠約占蠶繭的25%～30%，在繅絲提取絲素時(shí)作為廢料丟棄，不僅造成巨大浪費(fèi)，也造成了環(huán)境污染。本研究根據(jù)《本草綱目》記載的“蠶繭能煮水治消渴”以及民間蠶繭泡水降血糖的驗(yàn)方，提取了蠶繭中溶于水的高分子蛋白——絲膠，本研究發(fā)現(xiàn)，絲膠能明顯降低T2DM大鼠肝臟IRS-2的表達(dá)，提示絲膠可能通過影響肝臟IRS-2的表達(dá)，改善胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及IR，從而對糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)揮治療作用。絲膠為天然的物質(zhì)，可避免化學(xué)合成降糖藥物帶給人體的毒副作用，因此，有必要深入探討絲膠降血糖的作用機(jī)制，為將絲膠開發(fā)成為降糖的新藥積累實(shí)驗(yàn)資料。

1 Fritsche L,Weigert C,Haring HU,etal.How insulin receptor substrate proteins regulate the metabolic capacity of the liver-implications for health and disease 〔J〕？Curr Med Chem,2008;15(13):1316-29.

2 付秀美，鐘美蓉，付文亮，等.絲膠對2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(1)：103-5.

3 劉 平，劉東慧，付秀美，等.絲膠對糖尿病大鼠胰島細(xì)胞神經(jīng)肽Y表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014；34(8)：2182-4.

4 Ayaz L,Karakas Celik S,Cayan F.The G1057D polymorphism of insulin receptor substrate-2 associated with gestational diabetes mellitus 〔J〕.Gynecol Endocrinol,2014；30(2):165-8.

5 Withers DJ,Burks DJ,Towery HH,etal.Irs-2 coordinates Igf-1 receptor-mediated beta-cell development and peripheral insulin signaling 〔J〕.Nat Genet,1999；23(1):32-40.

6 Withers DJ,Gutierres JS,Towery H,etal.Disruption of IRS-2 causes type-2 diabetes in mice 〔J〕.Nature,1998;391(6670):900-4.

7 Boden G,Shulman GI.Free fatty acids in obesity and type 2 diabetes:defining their role in the development of insulin resistance and beta-cell dysfunction 〔J〕.Eur J Clin Invest,2002;32(3):14-23.

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9 張獻(xiàn)彩.胰島素受體底物-2與胰島素抵抗〔J〕.中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2011;8(12)：184.

〔2015-04-01修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

Effects of sericin on insulin receptor substrate-2 expression in liver of type 2 diabetes mellitus rats

XING En-Hong,FU Wen-Liang,SONG Cheng-Jun,et al.

The Affiliated Hospital of Chengde Medical College,Chengde 067000,Hebei,China

Objective To study the effects of sericin on insulin receptor substrate-2 (IRS-2) in liver of type 2 diabetes mellitus rats.Methods 36 male SD rats were randomly divided into 3 groups (n=12): normal control,diabetes model and sericin treatment groups.The type 2 diabetes model rats were induced by continuous intraperitoneal injection of streptozotocin.After successfully establishing the diabetes animal models,the rats in sericin treatment group were lavaged with sericin (2.4 g·kg-1·d-1).SP immunohistochemical staining,Western blotting and RT-PCR were used to detect the IRS-2 expression in liver.Results Sericin could significantly increase IRS-2 positive cell number,IRS-2 protein and mRNA expression in liver of diabetes model rats (P<0.01).Conclusions Sericin can affect insulin signaling and improve insulin resistance by up regulating IRS-2 expression in liver,thus reduce blood glucose.

Sericin; Type 2 diabetes mellitus; Liver; Insulin receptor substrate-2 (IRS-2); Insulin resistance

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81441133)；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(H2013406096)；河北省高校重點(diǎn)發(fā)展學(xué)科“人體解剖與組織胚胎學(xué)”建設(shè)項(xiàng)目資助(2013年)

1 承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室

陳志宏(1971-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病及治療研究。

邢恩鴻(1974-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事分子生物學(xué)和免疫學(xué)方面的研究。

R587.1

A

1005-9202(2016)19-4689-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.007