白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制

宋碧輝 謝紅萍

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

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白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制

宋碧輝1謝紅萍

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

目的 探討白藜蘆醇抑制高糖誘導(dǎo)人近端腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)的凋亡及可能機(jī)制。 方法 MTT檢測(cè)HK-2細(xì)胞活力；Hoechst染色法、caspase-3活性檢測(cè)細(xì)胞凋亡；DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平；Real-time PCR檢測(cè)Nrf2 mRNA表達(dá)；Western印跡法檢測(cè)Nrf2蛋白表達(dá)。結(jié)果 30 mmol/L葡萄糖能顯著降低HK-2細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，并下調(diào)Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)。10 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理能部分逆轉(zhuǎn)高糖的作用。結(jié)論 白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2凋亡的保護(hù)機(jī)制可能與抑制活性氧的生成和上調(diào)Nrf-2的表達(dá)有關(guān)。

白藜蘆醇；糖尿病腎病；腎小管上皮細(xì)胞；Nrf2

糖尿病腎病(DN)在美國是導(dǎo)致終末期腎臟病(ESRD)的最常見病因，約占整個(gè)ESRD人群的40%〔1〕。DN早期表現(xiàn)為腎臟細(xì)胞外基質(zhì)增生，腎小球高濾過和腎小管高灌注。隨著病程的進(jìn)展，引發(fā)腎小球和腎小管細(xì)胞進(jìn)行性丟失，最終導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管萎縮，腎間質(zhì)纖維化。從代償性細(xì)胞增生向細(xì)胞丟失、萎縮的過渡過程中，凋亡是誘導(dǎo)腎細(xì)胞進(jìn)行性丟失的重要機(jī)制之一〔2〕。白藜蘆醇具有顯著降低蛋白尿和腎保護(hù)的功能〔3〕，本研究體外觀察白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)人近端腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物、主要試劑及儀器 人近端腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)，購自中科院上海實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中心(來源于美國ATCC細(xì)胞庫)。白藜蘆醇(Sigma，V900386)，濃度≥98.0%。低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone)，葡萄糖溶液(Sigma，G8644)，MTT(碧云天，ST316)，活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(碧云天，S0033)，Hoechst檢測(cè)試劑盒(碧云天， C1017)，Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(碧云天，C1115)，Trizol(Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)，sybergreen realtime PCR試劑盒(Takara)，Nrf2引物(上海生工)，β-actin引物(上海生工)，Nrf2一抗(Santa Cruz，sc-722)，β-actin一抗(Santa Cruz，sc-47778)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(Santa Cruz，sc-2491)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(Santa Cruz，sc-2489)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天， P0018)，恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)，熒光倒置顯微鏡(Olympus)，5810R低溫高速離心機(jī)(Eppendorf)，AB 7300 realtime PCR儀(ABI)，Western印跡裝置(Bio-Rad)，ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HK-2接種于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔2天換培養(yǎng)液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合后，用 0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法 對(duì)照組：細(xì)胞正常培養(yǎng)，不加任何處理；葡萄糖處理組：葡萄糖(30 mmol/L)處理HK-2；白藜蘆醇處理組：預(yù)先加10 μmol/L白藜蘆醇孵育1 h后加葡萄糖(30 mmol/L)處理24 h；甘露醇(30 mmol/L)對(duì)照組。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 細(xì)胞存活率檢測(cè) MTT比色試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率。按實(shí)驗(yàn)分組做不同處理后，在培養(yǎng)板中加入10×MTT 20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入200 μl DMSO，37℃孵育30 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定OD570。

1.4.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè) ①采用Hoechst法檢測(cè)。除去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入固定液室溫固定10 min。棄固定液，加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，染色5 min。棄染色液，PBS洗滌3次。倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。②caspase-3活性檢測(cè)。收集細(xì)胞，PBS洗滌2次。吸盡上清后，按照每200萬細(xì)胞加入100 μl裂解液的比例加入裂解液，冰浴裂解15 min。4℃，12 000 r/min，離心15 min。設(shè)置反應(yīng)體系：檢測(cè)緩沖液70 μl，待測(cè)樣品20 μl，Ac-DEVD-pNA(2 mmol/L)10 μl。37℃孵育60～120 min。測(cè)定A405。用Bradford法檢測(cè)待測(cè)樣品中的蛋白濃度。計(jì)算出一個(gè)樣品單位重量蛋白中所含的caspase-3的酶活力單位。

1.4.3 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè) 采用ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。去除培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加入1 ml稀釋好的DCFH-DA(按1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3遍，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.4 Nrf2 mRNA表達(dá)檢測(cè) Trizol抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，引物序列：Nrf2正義鏈：TTCAGCAGCATCCTCTCCACAG，反義鏈：GCATGCTGTTGCTGATACTGG。β-actin 正義鏈：CCACACCTTCTACAATGAGC，反義鏈：GGTCTCAAACATGATCTGGG。熒光定量PCR擴(kuò)增體系及條件：SYBR(2×)5.0 μl ，正義鏈引物(10 μmol/L)0.2 μl，反義鏈引物(10 μmol/L)0.2 μl，cDNA 2.0 μl ，RNase Free dH2O 2.4 μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 20 s，(95℃ 5 s，60℃ 31 s)，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后用7300 System SDS Software分析數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)ΔΔCt值，計(jì)算相應(yīng)RQ值，比較各組 mRNA的表達(dá)。

1.4.5 Nrf2 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western印跡檢測(cè)。Western IP裂解液提取蛋白。取60 μg樣品經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，用半干轉(zhuǎn)膜法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5 %脫脂牛奶封閉1 h。一抗(Nrf2 1∶1 000，β-actin 1∶1 000)4 ℃孵育過夜。二抗(山羊抗兔 1∶5 000，山羊抗小鼠 1∶5 000)室溫孵育1 h。用ECL發(fā)光劑顯影，采用ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，Image Lab軟件進(jìn)行灰度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 高糖和白藜蘆醇對(duì)HK-2活力的影響 與對(duì)照組相比，葡萄糖(30 mmol/L)處理HK-2 24 h，可顯著抑制細(xì)胞活力(97.79%±3.51% vs 57.15%±2.51%，P<0.01)，而30 mmol/L甘露醇對(duì)照組對(duì)細(xì)胞沒有影響(90.01%±2.88%);預(yù)先用不同濃度白藜蘆醇處理1 h后，白藜蘆醇(10 μmol/L)能顯著上調(diào)葡萄糖(30 mmol/L)誘導(dǎo)細(xì)胞活力下降(76.67%±4.97%，P=0.005)。

2.2 白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2凋亡的影響 與對(duì)照組相比，葡萄糖(30 mmol/L)處理HK-2 24 h，caspase-3活性顯著升高(96.89%±3.51% vs 246.02%±14.57%，P<0.01)，Hoechst染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞明顯增多，而甘露醇對(duì)照組對(duì)細(xì)胞沒有影響(98.33%±10.92%);預(yù)先用白藜蘆醇(10 μmol/L)處理1 h后，可抑制caspase-3活性(150.02%±15.27%，P<0.01)，可減少HK-2細(xì)胞凋亡(圖1)。

圖1 白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2凋亡的影響(Hoechst染色，×200)

2.3 白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞ROS的影響 與對(duì)照組相比，葡萄糖(30 mmol/L)處理HK-2 24 h，ROS的生成顯著增加，而甘露醇對(duì)照組對(duì)細(xì)胞沒有影響，預(yù)先用白藜蘆醇(10 μmol/L)處理1 h后，可顯著抑制葡萄糖(30 mmol/L)誘導(dǎo)的ROS生成(圖2)。

圖2 白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2 ROS生成的影響(×200)

2.4 白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，葡萄糖(30 mmol/L)處理HK-2 24 h，Nrf2 mRNA表達(dá)顯著降低(1.11±0.14 vs 0.46±0.057，P<0.01)，而甘露醇對(duì)照組對(duì)細(xì)胞沒有影響(1.13±0.16);預(yù)先用白藜蘆醇(10 μmol/L)處理1 h后，可顯著上調(diào)葡萄糖(30 mmol/L)抑制的Nrf2 mRNA水平(0.80±0.051，P<0.01)。Nrf2蛋白表達(dá)結(jié)果與mRNA一致，對(duì)照組1.01±0.10，葡萄糖處理組0.53±0.08,白藜蘆醇處理組0.82±0.09,甘露醇對(duì)照組1.13±0.11(圖3)。

1～4：對(duì)照組、葡萄糖處理組、白藜蘆醇處理組、甘露醇對(duì)照組圖3 白藜蘆醇對(duì)高糖處理HK-2 Nrf2蛋白表達(dá)的影響(Western印跡)

3 討 論

高血糖是公認(rèn)的在DN中起關(guān)鍵作用的因子，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖刺激HK-2 24 h后，Hoechst染色發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞增加，caspase-3活性增加，證明高糖對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的損傷。在高糖作用下，ROS產(chǎn)生過多，氧化應(yīng)激損傷增強(qiáng)。ROS對(duì)腎小球和腎小管的多種細(xì)胞均有影響：①高糖可能以ROS為第二信使，上調(diào)纖溶酶原激活物抑制物(PAI)-1的表達(dá)，促進(jìn)系膜基質(zhì)和膠原堆積〔4〕。②ROS通過激活A(yù)ngⅡ-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1-Smad 信號(hào)途徑誘導(dǎo)系膜細(xì)胞分泌過量的TGF-β1，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，并減少其降解〔5〕。③ROS通過激活蛋白激酶C(PKC)，使核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB發(fā)生磷酸化，活化后啟動(dòng)纖維連接蛋白、層黏連蛋白以及一些炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，增加細(xì)胞外基質(zhì)的沉積〔6〕。④ROS在激活PKC、TGF-β1、AngⅡ等信號(hào)通路的同時(shí)，這些信號(hào)反過來也能誘導(dǎo)高糖狀態(tài)下的ROS過度生成，這一正反饋的結(jié)果使得ROS成為一種信號(hào)放大器，導(dǎo)致了DN氧化應(yīng)激損傷的惡性循環(huán)〔7〕。人類Nrf2基因位于2q31， Nrf2有一高度保守的堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)。正常的生理狀態(tài)下，Nrf2位于胞質(zhì)中，與其抑制蛋白Keap1相互作用后降解、失活。當(dāng)受到來源于活性氧或親核劑的信號(hào)攻擊后，Nrf2與Keap1解離從而使其泛素化減少并進(jìn)入胞核，與其他的bzIP蛋白結(jié)合成異二聚體后，與抗氧化反應(yīng)元件ARE靶向結(jié)合，使ARE相關(guān)的抗氧化酶基因的表達(dá)上調(diào)，啟動(dòng)Nrf2下游靶基因包括過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、血紅素加氧酶(HO-1)等表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)作用〔8～10〕。在正常的生理狀態(tài)下，HO-1的表達(dá)與活力較低，但過氧化氫、內(nèi)毒素、重金屬、紫外輻射、肺損傷、高氧/低氧等應(yīng)激條件〔11～13〕，均可通過Nrf2啟動(dòng)HO-1的表達(dá)從而發(fā)揮抗氧化作用。本研究用高糖處理后，腎小管上皮細(xì)胞Nrf2表達(dá)下調(diào)，而且Nrf2表達(dá)降低與腎小管上皮細(xì)胞的凋亡增多一致。由此推測(cè)Nrf2可能是一種保護(hù)性的信號(hào)蛋白，在DN誘導(dǎo)的腎小管損傷中發(fā)揮了作用，但是其具體的致病機(jī)制、表達(dá)的調(diào)控以及參與調(diào)控誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)，有待進(jìn)一步探討。白藜蘆醇是一種天然的多酚醇類化合物，廣泛存在于葡萄籽，花生，虎杖等多種植物中，白藜蘆醇對(duì)心血管〔14〕、腫瘤〔15〕、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎〔16,17〕等多種疾病有保護(hù)作用，并且能夠通過抗氧化應(yīng)激和炎癥保護(hù)糖尿病大鼠的腎臟，具體機(jī)制為激活Nrf2-Keap1信號(hào)通路〔18〕，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)白藜蘆醇能通過活化Nrf2/ARE信號(hào)通路抑制腎臟系膜細(xì)胞的增殖〔19〕，白藜蘆醇還可以通過下調(diào)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶改善早期大鼠腎功能〔20〕。同樣我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，白藜蘆醇能上調(diào)高糖處理后Nrf2的表達(dá)，減少ROS的生成，從而減少腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。但目前白藜蘆醇抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制及信號(hào)途徑尚未完全闡明，而且對(duì)腎臟病模型動(dòng)物及患者的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用也不明確，需進(jìn)一步探討。

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〔2014-12-09修回〕

(編輯 安冉冉/曹夢(mèng)園)

1 衡陽市第一人民醫(yī)院

謝紅萍(1964-)，女，主任醫(yī)師，碩士，碩士生導(dǎo)師，主要從事腎內(nèi)科疾病診治研究。

宋碧輝(1985-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腎內(nèi)科疾病診治研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)19-4686-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.006