益氣溫陽活血方對慢性心力衰竭心室重塑大鼠β3-腎上腺素能受體、血清Ⅰ型前膠原羧基端肽和Ⅲ型前膠原氨基端肽的影響

楊冬花 顧廣富 羅建華

(貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州 貴陽 550002)

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益氣溫陽活血方對慢性心力衰竭心室重塑大鼠β3-腎上腺素能受體、血清Ⅰ型前膠原羧基端肽和Ⅲ型前膠原氨基端肽的影響

楊冬花 顧廣富1羅建華

(貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州 貴陽 550002)

目的 探討益氣溫陽活血方對慢性心力衰竭心室重塑大鼠β3-腎上腺素能受體(β3-AR)、血清Ⅰ型前膠原羧基端肽(PⅠCP) 和Ⅲ型前膠原氨基端肽(PⅢNP)的影響。方法 通過異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)慢性心力衰竭動物模型。計算左、右心室心肌的心臟指數(shù)(LVMI、 RVMI)，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清PⅠCP和PⅢNP含量，以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法以及Western印跡法檢測β3-AR mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果 與正常組比較，模型組LVMI 〔(2.987±0.318 vs 2.350±0.468)mg/g〕、血清PⅠCP〔(16.357±3.650 vs 12.843±3.124)pg/ml〕、PⅢNP〔(64.984±17.477 vs 21.245±5.354)pg/ml〕含量及β3-AR mRNA(0.888±0.064 vs 0.743±0.086)與蛋白質(zhì)(4.413±0.729 vs 2.312±0.394)的表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05)；益氣溫陽活血方能夠明顯降低慢性心力衰竭大鼠LVMI，減少PⅠCP和PⅢNP含量，抑制β3-AR mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)水平的升高，與正常組比較〔(2.557±0.379 vs 2.350±0.468)mg/g〕、血清PⅠCP〔(13.111±2.758 vs 12.843±3.124)pg/ml〕和PⅢNP〔(25.967±9.659 vs 21.245±5.354)pg/ml〕含量及β3-AR mRNA(0.781±0.067 vs 0.743±0.086)與蛋白質(zhì)(2.484±0.642 vs 2.312±0.394)，均無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論 益氣溫陽活血方可能通過抑制β3-AR的表達(dá)減少PⅠCP和PⅢNP含量逆轉(zhuǎn)心室重塑，改善心臟功能。

慢性心力衰竭；心室重塑；β3-腎上腺素能受體； PICP；PⅢNP；益氣溫陽活血方

心室重塑和神經(jīng)激素-細(xì)胞因子之間的惡性循環(huán)是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本機制，是導(dǎo)致心力衰竭不斷進(jìn)展的病理生理學(xué)基礎(chǔ)〔1〕。β3-腎上腺素能受體(β3-AR)是新近發(fā)現(xiàn)的β腎上腺受體(β-AR)，在心力衰竭晚期可產(chǎn)生持續(xù)的負(fù)性肌力作用，導(dǎo)致心肌抑制，加重心力衰竭〔2〕。既往研究發(fā)現(xiàn)，益氣溫陽活血方在心力衰竭早期可通過過氧化物酶體增殖物活化物受體(PPAR)γ信號通路調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ、醛固酮的表達(dá)，防止心室重塑，改善心臟功能〔3〕，但是否能通過抑制心力衰竭持續(xù)高表達(dá)的β3-AR水平防止心室重塑，目前尚不清楚。本研究通過觀察益氣溫陽活血方對慢性心衰心室重塑大鼠β3-AR表達(dá)水平的影響研究，為進(jìn)一步臨床運用提供理論依據(jù)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康Wistar雄性大鼠40只，清潔級，鼠齡5～6個月，體重(250±10)g，由貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供，合格證號：SYSK(黔)2002-0001。

1.2 益氣溫陽活血方主要成分 人參、黃芪、丹參、益母草各30 g，白術(shù)、茯苓各15 g，桂枝9 g等11味中藥。藥材從貴州省人民醫(yī)院中藥房一次性選購，生藥按比例取好，加水浸泡1 h，第一遍煮沸40 min，濾渣取汁；再加水煮沸15 min，濾渣取汁，合并2次煎液，在水浴中濃縮至每毫升煎液含生藥4 g，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器 異丙腎上腺素(Sigma公司)，卡維地洛(齊魯制藥有限公司，批號：H20000100)，Trizol(Invitrogen公司)， Rnasin(Promega公司)，M-MLV(Promega公司)，引物由上海生物工程公司合成，大鼠抗-β3-AR抗體(Abcam公司)，ECL顯影試劑盒(Santa Cruz 公司)，Ⅰ型前膠原羧基端肽(PⅠCP)和Ⅲ型前膠原氨基端肽(PCⅢNP)檢測試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)，制膠、電泳及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)，PCR儀(Eppendorf 公司)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1 心力衰竭的模型制備〔4〕及分組 采用異丙腎上腺素腹腔注射(3 mg·kg-1·d-1)誘導(dǎo)慢性心力衰竭模型。選用Wistar雄性大鼠，隨機分組為正常組，模型組，中藥組(益氣溫陽活血方治療組)，西藥組(卡維地洛治療組)，每組10只，模型組、中藥組及西藥組根據(jù)上述方法制備慢性心力衰竭動物模型。造模后第1天中藥組及西藥組即分別給予益氣溫陽活血方(8 ml/kg)和卡維地洛(50 mg/kg)灌胃治療，2次/d，正常組及模型組則以蒸餾水等量灌胃，共治療8 w。

1.4.2 左、右心室心肌的心臟指數(shù)(LVMI、RVMI) 試驗結(jié)束后，開胸取出心臟，灌洗后分別稱取左心室、右心室濕質(zhì)量。以左心室濕質(zhì)量/體質(zhì)量和右心室濕質(zhì)量/體質(zhì)量，分別代表LVMI、RVMI，可反映心室重塑情況。

1.4.3 血清PⅠCP和PⅢNP檢測 4組動物相應(yīng)時間處死后，采集頸動脈血分離血清，以ELISA法檢測上述指標(biāo)，操作過程參照試劑盒說明進(jìn)行。

1.4.4 心肌組織β3-AR mRNA的表達(dá) β3-AR (444 bp)上游5′-AGTGGGACTCCTCGTAATG-3′，下游5′-CGCTTAGCTAC GACGAAC-3′。GAPDH (187 bp):上游5′-GACAACGGCTCCGGCATGTG-3′，下游5′-TGAGGATGCCTCTCTTGC-3′。按Trizol試劑說明書提取左室心肌組織總RNA，參照第一鏈cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物5 μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、照相，利用UVP凝膠掃描儀測定條帶的吸光度(A)值，以目的基因與GAPDH條帶的吸光度(A)值的比值代表其表達(dá)的相對量。

1.4.5 心肌組織β3-AR蛋白質(zhì)的表達(dá) 提取左心室組織蛋白質(zhì)，制備聚丙烯酰胺凝膠、蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜。一抗?jié)舛染鶠?∶1 000，二抗?jié)舛葹?∶2 000，化學(xué)發(fā)光試劑法曝光、顯影和定影，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行密度掃描并分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心室重塑指標(biāo)、血清PⅠCP和PⅢNP含量的變化 模型組大鼠LVMI、血清PⅠCP和PⅢNP含量與正常組、中藥組、西藥組比較均明顯升高(P<0.05)。中藥組、西藥組大鼠LVMI、血清PⅠCP和PⅢNP含量與正常組比較，無顯著差異(P>0.05)。中藥組大鼠LVMI、血清PⅠCP和PⅢNP含量與西藥組比較，無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組心室重塑指標(biāo)、血清PⅠCP和PⅢNP含量、β3-AR mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量的比較

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

1：分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：正常組；3：模型組；4：中藥組；5：西藥組圖1 β3-AR mRNA的表達(dá)

1：正常組；2：模型組；3：中藥組；4：西藥組圖2 β3-AR 蛋白質(zhì)的表達(dá)

2.2 各組心肌組織β3-AR mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平 圖1，圖2可見，模型組大鼠心肌組織β3-AR mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與正常組、中藥組、西藥組比較均明顯升高(均P<0.05)。中藥組、西藥組心肌組織β3-AR mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與正常組比較，無顯著差異(均P>0.05)。中藥組心肌組織β3-AR mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與西藥組比較，無顯著差異(均P>0.05)。

3 討 論

β-AR是一類膜表面糖蛋白，可識別并與兒茶酚胺特異性結(jié)合，激活胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng)〔5〕。根據(jù)各亞型對特異性配體的親和性、生物學(xué)效應(yīng)、基因結(jié)構(gòu)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，β-AR主要分為β1-AR、β2-AR、和β3-AR〔6〕。β1-AR激動后可增強心肌收縮力，但持續(xù)活化可引起心肌肥厚、間質(zhì)纖維化和心肌細(xì)胞凋亡等心室重塑慢性效應(yīng)〔7〕，β2-AR則不但具有抗凋亡的作用，還輕度增加心肌收縮力，對心臟具有保護作用〔8〕。Gauthier等〔9〕首先發(fā)現(xiàn)人類心室肌組織存在介導(dǎo)負(fù)性變力效應(yīng)的β3 -AR。β3-AR介導(dǎo)負(fù)性肌力作用，在心力衰竭早期，β3-AR上調(diào)可保護心臟免于高水平兒茶酚胺所致的心臟損傷，但當(dāng)心力衰竭進(jìn)展到終末階段時，持續(xù)激活的β3-AR的負(fù)性變力效應(yīng)可抑制心肌收縮，導(dǎo)致心功能惡化〔2〕，在大鼠終末期衰竭心臟，β3-AR激動劑可明顯惡化心功能并可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡〔10〕。同時還能通過β3-AR信號通路級聯(lián)放大效應(yīng)，通過相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而活化多種心肌肥大相關(guān)基因，如腫瘤壞死因子α、內(nèi)皮素-1、血管緊張素Ⅱ等的表達(dá)促進(jìn)心室重塑〔11〕。

心肌細(xì)胞外間質(zhì)的主要成分是膠原纖維，其中以Ⅰ型與Ⅲ型膠原為主，心室重塑時，心肌總膠原含量增加，或者Ⅰ/Ⅲ型膠原比例增加將導(dǎo)致心肌僵硬度增加、 心肌舒張功能受損〔12〕。PⅠCP和PⅢNP是在特殊肽鏈內(nèi)切酶的作用下脫離前膠原以游離形式被釋放入血的肽段，其釋放與膠原纖維的生成是1∶1的關(guān)系，所以兩者隨著膠原合成增多其釋放增加，它們被認(rèn)為是體內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原合成的間接標(biāo)志，可作為反映心臟膠原重塑的指標(biāo)〔13〕。

目前心力衰竭的治療目標(biāo)不僅是要改善患者的癥狀、提高生活質(zhì)量，更重要的是修復(fù)衰竭心肌的生物學(xué)性質(zhì)，阻斷神經(jīng)內(nèi)分泌、細(xì)胞因子的激活和心室重塑之間的惡性循環(huán)〔14〕。慢性心力衰竭的治療通過阻斷β受體策略不斷得到大規(guī)模臨床實驗的印證，β受體阻滯劑防止心室重塑已經(jīng)成為心力衰竭治療的基石?？ňS地洛是一種具有多種附加作用的第三代β受體阻滯藥，是非選擇性地阻滯β受體及選擇性地阻滯α1受體，對心力衰竭具有明顯的治療效果和良好的安全性，卡維地洛已被美國FDA批準(zhǔn)為治療心力衰竭的首選β受體阻滯劑。研究發(fā)現(xiàn)，異丙腎上腺素灌流離體大鼠心臟，心衰組用卡維地洛后心功能指標(biāo)明顯改善，與特異性的β3-AR抑制劑SR59230A作用于離體大鼠心臟后心功能指標(biāo)的變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義〔15〕；而且卡維地洛還能使大鼠衰竭心室β3-AR mRNA表達(dá)明顯降低、減輕心室重塑〔16〕。從而可以推斷卡維地洛可通過阻斷β3-AR發(fā)揮治療心力衰竭的作用。

益氣溫陽活血方是一組針對心力衰竭病機所組成的臨床有效方劑，方中主要成分人參、黃芪、丹參、益母草、白術(shù)、茯苓、桂枝等11味中藥，具有益氣溫陽、活血利水之功效。本研究結(jié)果顯示，益氣溫陽活血方與卡維地洛一樣，可以改善心力衰竭大鼠心臟功能，減輕左心室濕質(zhì)量/體質(zhì)量的比值，同時還能抑制β3-AR mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，減少血清PⅠCP和PⅢNP的含量，防止心室重塑。初步可以推論，益氣溫陽活血方通過阻斷心力衰竭時過分激活的β3-AR，減少血清PⅠCP和PⅢNP血清含量，抑制膠原產(chǎn)生，逆轉(zhuǎn)心室重塑，從而改善心臟的收縮和舒張功能，具體作用機制有待于進(jìn)一步研究證實。

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〔2015-04-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

貴州省社會公關(guān)項目(黔科合SY字〔2011〕3055)；貴州省科技聯(lián)合基金(黔科合SY〔2010〕3121號)

1 貴陽中醫(yī)學(xué)院2012級研究生

楊冬花(1971-)，女，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事心力衰竭的臨床與基礎(chǔ)研究。

R286

A

1005-9202(2016)19-4678-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.003