吡非尼酮對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的影響*

肖 敏, 屈小虎, 呂聚坪, 史 楊, 李長西, 謝克儉

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 溫州 325035)

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吡非尼酮對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的影響*

肖 敏, 屈小虎, 呂聚坪, 史 楊, 李長西, 謝克儉△

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 溫州 325035)

目的：研究吡非尼酮對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的影響。方法：選用8 周健康雄性SPF級ICR小鼠40只，隨機(jī)分為4組(n=10)：肝纖維化模型組(CCL4組)、吡非尼酮低劑量組(PFD-L組)、吡非尼酮高劑量組(PFD-H組)及正常對照組。CCL4肝纖維化模型采用0.4 ml/只10%的CCL4大豆油溶液進(jìn)行小鼠腹腔注射制備，低劑量、高劑量吡非尼酮干預(yù)組在造模后采用120 mg/kg、240 mg/kg吡非尼酮(PFD)灌胃，正常對照組采用與前三組等量的生理鹽水腹腔注射的方法。全自動(dòng)生化儀檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)；取肝臟組織HE染色觀察組織的病理學(xué)變化；熒光定量PCR法測定肝臟中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)相關(guān)基因的表達(dá)，酶聯(lián)反應(yīng)法檢測肝纖維化指標(biāo)透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(IV-C)。結(jié)果：與正常組相比，CCL4組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，膠原纖維沉積明顯，可見假小葉形成；血清ALT、AST、ALP均顯著升高(P<0.05)；血清肝纖維化指標(biāo)HA、LN、IV-C均顯著升高(P<0.05)；α-SMA基因的表達(dá)水平也顯著升高(P<0.05)。PFD-L組和PFD-H組小鼠AST、ALT、ALP相較于CCL4組明顯降低，PFD-L組和PFD-H組小鼠血清肝纖維化指標(biāo)HA、LN、IV-C相較于CCL4組明顯降低，α-SMA基因的表達(dá)也受到抑制(P<0.05)。病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，PFD-L組小鼠的肝纖維化程度減輕，膠原纖維減少，僅見少量假小葉；PFD-H組小鼠細(xì)胞排列恢復(fù)，小葉結(jié)構(gòu)輕度紊亂，未見明顯假小葉，恢復(fù)效果比PFD-L組好。結(jié)論：吡非尼酮對于肝纖維化有一定的治療作用，其可成為肝纖維化早期干預(yù)的新藥物。

吡非尼酮；四氯化碳；肝纖維化；肝星狀細(xì)胞；小鼠

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.023

肝纖維化是各種慢性肝病損傷的共同結(jié)果，由于肝內(nèi)纖維生成和降解失衡導(dǎo)致過多膠原在肝內(nèi)沉積，最終可發(fā)展為肝硬化。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過多產(chǎn)生和沉積是肝纖維化的核心表現(xiàn)，活化的肝星狀細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞來源。故肝星狀細(xì)胞(HSC)活化致使細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡，是導(dǎo)致肝纖維化的中心環(huán)節(jié)[1]。盡管肝硬化的病理改變具有不可逆性，但是研究表明肝纖維化是一個(gè)相對可以逆轉(zhuǎn)的過程。在肝纖維化階段進(jìn)行干預(yù)可能是防止肝硬化的有效途徑[2]。為此阻斷肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展對于肝硬化和慢性肝病具有極為重要的意義，尋找安全有效的抗肝纖維化藥物是抗肝纖維化的當(dāng)務(wù)之急。

吡非尼酮(pirfenidone,PFD)是新近發(fā)現(xiàn)的具有抗纖維化作用的化合物，其在抑制肺、心、腎等纖維化方面的作用，目前國外已有不少報(bào)道[3-4]，而其對肝纖維化的影響尚缺少足夠研究。本研究旨利用CCL4所致的肝纖維化小鼠模型，探討吡非尼酮對肝纖維化的防治作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

CCL4溶液購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，99.9%分析純；CMC-Na購于廣東汕頭市西隴化工；大豆油采用金龍魚大豆油，購于超市；吡非尼酮購于上海恩美生物科技有限公司；Trizol試劑購于invitrogen；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 購于寶生物工程(大連)有限公司；SYBR Green購于Bio-Rad；α-SMA引物，actin Primers 均購于生工生物工程(上海)股份有限公司。肝纖維化試劑盒購于上海博舜生物科技有限公司

1.2 儀器

全自動(dòng)生化分析儀C800型(美國雅培公司)；石蠟切片機(jī)(北京中儀光科科技發(fā)展有限公司)；低溫高速離心機(jī)(Eppendorf 公司)；-80℃低溫冰箱(日本SANYO公司)；NanoDrop 2000 核酸蛋白分析儀(Thermo Fisher Scientific)；S1000TMThermal Cycler梯度PCR 儀(Bio-Rad)；Multifuge XIR 臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific)；CFX ConnectTM熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.3 動(dòng)物模型制備

8周齡健康雄性SPF級ICR小鼠(購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)40只，體重25～30 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。小鼠隨機(jī)分為4組(n=10)：肝纖維化模型組(CCL4組)：腹腔注射0.4 ml/只10%CCL4(四氯化碳)大豆油溶液，2周注射1次，共42 d(6周)；吡非尼酮低劑量組(PFD-L組)：前2周只腹腔注射1次0.4 ml/只10%CCL4，后4周腹腔注射10%CCL4大豆油溶液(每2周1次)同時(shí)給予120 mg/kg的PFD溶液灌胃，1天1次，共 42 d(6周)；吡非尼酮高劑量組(PFD-H組)：前2周只腹腔注射1次CCL4，后4周腹腔注射10%CCL4大豆油溶液(每2周1次)同時(shí)給予240 mg/kg的PFD溶液灌胃，1天1次，共42 d(6周)；正常對照組，正常喂養(yǎng)42 d。各組小鼠均在實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，自由攝取食物和水。各組小鼠造模42 d后處死，留取血清，迅速取肝組織于-80℃保存留作實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。

1.4 病理組織學(xué)檢查

肝臟組織采用4%多聚甲醛固定，經(jīng)梯度脫水后在二甲苯中透明，浸蠟，進(jìn)行石蠟包埋處理后制成3 μm切片，通過蘇木精—伊紅染色，用ECTIPSE50I顯微圖像處理系統(tǒng)觀察并收集圖片，比較各組肝臟組織形態(tài)變化。

1.5 肝功能生化檢測

小鼠取血后室溫靜置1 h, 3 000 r/min, 離心15 min，分離血清。用美國雅培C800型全自動(dòng)生化分析儀測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase， ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase， AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)。

1.6 肝纖維化指標(biāo)檢測

小鼠取血后室溫靜置1 h, 3 000 r/min, 離心15 min，分離血清。采用放射免疫分析法檢測肝纖維化指標(biāo)透明質(zhì)酸(hyaluronic acids，HA)、層粘連蛋白(laminin，LN)、Ⅳ型膠原(collagentype IV，Ⅳ-C),嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.7 肝組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(smooth muscle actin-alpha，α-SMA)基因表達(dá)檢測

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。采用Trizol一步法提取小鼠肝組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,操作按照試劑盒說明書。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參，α-SMA引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。α-SMA上游引物:5’—AGC GGG CAT CCA CGA AAC—3’；下游引物:5’—TGA TCT TCA TGG TGC TGG GTG—3’。β-actin上游引物:5’—AAC AGT CCG CCT AGA AGC AC—3’；下游引物:5’—CAT TGA CAT CCG TAA AGA CC—3’。Real-time PCR反應(yīng)體系為20 μl，其中cDNA 1 μl，SYBR Green 10 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，ddH2O 8 μl，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min,94℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s,共反應(yīng)45個(gè)循環(huán)。72℃延伸5 min。用SDS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用比較Ct值(循環(huán)閾值)的方法分析結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體重情況

研究發(fā)現(xiàn)，4組小鼠體重總體均呈增長狀態(tài)。其中CCL4組、PFD-L組和PFD-H組小鼠體重呈先下降后上升趨勢。從增長曲線上可以看出在第28天后PFD-H組增長最快，CCL4組增長趨勢在四組中是最慢的。在體重上正常組始終高于其余三組。據(jù)圖可以推測PFD在后期開始發(fā)揮作用，對于肝纖維化的治療有作用(圖1)。

Fig. 1 The body weight of the mice

2.2 肝病理改變

通過HE染色觀察4組模型的病理變化(圖2)，結(jié)果顯示：正常對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞多呈單核，偶有雙核，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，無膠原纖維增生；肝纖維化模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，有大量的炎性細(xì)胞浸潤，產(chǎn)生條形絮狀物。纖維組織增生并向肝小葉延伸形成假小葉。部分肝細(xì)胞腫脹，成纖維細(xì)胞增生活躍，并出現(xiàn)脂肪變性；吡非尼酮低劑量組小鼠的肝小葉情況雖然較為紊亂，但相較于肝纖維模型組小鼠，其纖維化程度明顯減輕，膠原纖維減少，纖維間隔變細(xì)，假小葉的數(shù)目也有所減少?？梢钥吹礁胃]擴(kuò)張，有炎性細(xì)胞浸潤，同時(shí)可以看到少量的假小葉；吡非尼酮高劑量組的肝組織病變明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)輕度紊亂，肝細(xì)胞散在點(diǎn)狀壞死，排列恢復(fù)。肝竇擴(kuò)張不明顯，僅見少量炎性細(xì)胞浸潤，膠原纖維著色減少，未見明顯假小葉。

Fig. 2 Comparison of hematoxylin-eosin (HE) staining on liver tissue among four groups( ×400)

A: CCL4group; B: PFD-L group; C: PFD-H group; D: NC group

2.3 各組小鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的變化

血清生化學(xué)結(jié)果顯示(表1)，肝纖維化模型組(CCL4組)ALT、AST、ALP均較正常對照組顯著升高(P<0.05)；吡非尼酮低劑量組(PFD-L組)和吡非尼酮高劑量組(PFD-H組)與肝纖維化模型組相比ALT、AST、ALP值明顯下降，存在顯著性差異(P<0.05)；吡非尼酮高劑量組和吡非尼酮低劑量組的血清生化值相比雖然低但不存在根本性差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

GroupHALNIV?CNC1．7099±0．02740．3142±0．01960．1965±0．0062CCL41．8357±0．0078?0．4026±0．1622?0．3124±0．0031?PFD?L1．7498±0．0641#0．3746±0．0155#0．2937±0．0067#PFD?H1．7229±0．0283##△0．3411±0．0309##△0．2750±0．0049##△

NC: Normal control; CCL4: Liver fibrosis group; PFD-L: High doses of pirfenidone group; PFD-L: Low doses of pirfenidone group; ALT: Alanine aminotransferase; AST: Aspartate aminotransferase; ALP: Alkaline phosphatase

*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsCCL4group

2.4 各組小鼠血清纖維化指標(biāo)的變化

血清纖維化指標(biāo)結(jié)果顯示(表2)，肝纖維化模型組(CCL4組)HA、LN、IV-C均較正常對照組顯著升高(P<0.05)；吡非尼酮低劑量組(PFD-L組)與肝纖維化模型組相比HA、LN、IV-C值明顯下降，存在顯著性差異(P<0.05)；吡非尼酮高劑量組(PFD-H組)與肝纖維化模型組相比HA、LN、IV-C值明顯下降，存在顯著性差異(P<0.01)；吡非尼酮高劑量組(PFD-L組)和吡非尼酮低劑量組(PFD-H組)的血清纖維化指標(biāo)相比存在顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

NC: Normal control; CCL4: Liver fibrosis group; PFD-L: High doses of pirfenidone group; PFD-L: Low doses of pirfenidone group; HA: Hyaluronic acids; LN: Laminin； IV-C: Collagentype IV

*P<0.05vsNC group；#P<0.05,##P<0.01vsCCL4group；△P<0.05vsPFD-L group

2.5 肝組織α-SMA基因的mRNA表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析小鼠肝組織中肝纖維化的標(biāo)志物α-SMA基因含量變化情況。結(jié)果顯示，四組中與正常對照組相比，肝纖維化模型組的α-SMA基因的表達(dá)水平顯著高于其他各組，同時(shí)顯著性差異明顯(表3，P<0.05)，說明肝纖維化造模成功。與肝纖維化模型組(CCL4組)相比，吡非尼酮低劑量組(PFD-L組)和吡非尼酮高劑量組(PFD-H組)的α-SMA基因的表達(dá)水平下降明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與吡非尼酮低劑量組(PFD-L組)相比，高劑量組的表達(dá)水平更為低，同時(shí)也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3，P<0.05)。

Groupα?SMA NC0．78±0．22?CCL40．56±0．09?PFD?L0．44±0．10#PFD?H0．43±0．09?△

NC: Normal control； CCL4: Liver fibrosis group; PFD-L: High doses of pirfenidone group; PFD-L: Low doses of pirfenidone group; α-SMA: Smooth muscle actinalpha

*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsCCL4group；△P<0.05vsPFD-L group

3 討論

肝纖維化是肝硬化乃至肝功能衰竭的共同病理基礎(chǔ)和必經(jīng)階段[5]。肝硬化是全球第14位成人致死疾病，有極高的風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展為肝癌，是全球重大的健康問題[6]。肝纖維化[7]是慢性肝損傷后組織修復(fù)過程的代償反應(yīng)，主要表現(xiàn)為肝星狀細(xì)胞的增殖活化，活化的肝星狀細(xì)胞增殖分化收縮粘附能力均增強(qiáng)，膠原分泌增多，使細(xì)胞外基質(zhì)的沉積與降解失衡，肝臟功能受到破壞，因此對肝纖維化的預(yù)防和早期干預(yù)是穩(wěn)定病情、阻止肝纖維化向肝硬化和肝癌發(fā)展的最佳措施。而要成功逆轉(zhuǎn)肝纖維化就要降解過多的膠原沉積，降解過度疤痕以及協(xié)助損傷肝組織恢復(fù)到正常。吡非尼酮在抗纖維化方面已被證實(shí)有一定作用。

本實(shí)驗(yàn)采用CCL4制備小鼠肝纖維化模型研究PFD對肝纖維化的作用及其機(jī)制。CCL4制備的模型具有耗時(shí)短，病變典型的特點(diǎn)[8]。造模成功后可以發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞細(xì)胞膜發(fā)生顯著變化，血清中AST、ALT、ALP外漏入血使AST、ALT、ALP含量比正常對照組顯著升高，反映了肝的損傷程度。使用吡非尼酮后可以發(fā)現(xiàn)AST、ALT、ALP在血清中的含量顯著降低，提示PFD具有減輕肝組織炎癥、壞死，促進(jìn)肝功能恢復(fù)的作用。

肝纖維化是以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分合成增多,降解相對不足,在肝內(nèi)過多沉積而形成。肝纖維化血清指標(biāo)HA、LN、IV-C在肝纖維化時(shí)水平明顯升高并與肝纖維化程度呈正相關(guān),可以用來監(jiān)測肝纖維化的發(fā)展過程和判斷抗纖維化的療效[9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用吡非尼酮后可以發(fā)現(xiàn)HA、LN、IV-C在血清中的含量顯著降低，提示PFD具有減輕肝組織炎癥、壞死，促進(jìn)肝功能恢復(fù)的作用。聯(lián)合檢測血清中HA、LN、IV-C的含量,雖然對于診斷肝纖維化及評價(jià)抗肝纖維化藥物療效有重要意義,但是還應(yīng)結(jié)合病理檢查,因?yàn)樵u價(jià)抗肝纖維化療效的金標(biāo)準(zhǔn)是肝臟病理組織學(xué)的檢查。肝臟病理組織學(xué)觀察顯示模型組肝細(xì)胞發(fā)生脂肪性變性、匯管區(qū)膠原纖維沉積，形成假小葉；而使用PFD的兩組小鼠的肝纖維化程度減輕，對比發(fā)現(xiàn)PFD能有效減輕肝炎性細(xì)胞浸潤，改善脂肪病變有利于肝細(xì)胞和肝組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)恢復(fù)正常。

HSC是ECM的主要來源，在慢性肝病的形成過程中，HSC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MyoF)，分泌大量的細(xì)胞因子導(dǎo)致膠原過度積累[10]。表型發(fā)生轉(zhuǎn)化的HSC會(huì)特異性表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)[11,12]。研究已證實(shí)，α-SMA是HSC增殖、活化的標(biāo)志[11]。實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)表明肝纖維化模型的α-SMA基因表達(dá)活躍，使用吡非尼酮的兩組實(shí)驗(yàn)組的α-SMA基因的表達(dá)水平顯著降低，抑制了HSC表達(dá)，降低ECM的產(chǎn)生,表明吡非尼酮能通過靶向抑制HSC活化達(dá)到抗肝纖維化的作用。

綜上所述，吡非尼酮(PFD)有明顯的防治肝纖維化作用，其作用機(jī)制可能與其保護(hù)肝細(xì)胞、減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)膠原降解而減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成、降低α-SMA基因表達(dá)、阻斷肝星狀細(xì)胞激活、抑制膠原纖維增加有關(guān)。提示PFD可成為早期防治肝纖維化的新藥物。

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Effects of pirfenidone on hepatic fibrosis in mice induced by carbon tetrachloride

XIAO Min, QU Xiao-hu, LV Jv-ping, SHI Yang, LI Chang-xi, XIE Ke-jian△

(Department of Biology, School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China)

Objective: To investigate the effects of pirfenidone on CCl4-induced liver fibrosis in mice. Methods: After 8-week feeding, 40 healthy male SPF ICR mice were randomly divided into 4 groups: liver fibrosis group (CCL4group), low doses of Pirfenidone group (PFD-L group), high doses of Pirfenidone group (PFD-H group) and control group. The mice in CCL4group, low doses of Pirfenidone group (PFD-L group), high doses of Pirfenidone group (PFD-H group) were injected intraperitoneally with 0.4 ml 10% CCL4solution dissolved in soybean oil. Then the PFD-L and PFD-H groups were treated with 120 mg and 240 mg PFDviagastric gavage, respectively. Control group was injected with same volume of saline. Alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST), alkaline phosphatase(ALP) in serum were tested with automatic biochemistry analyzer and the pathologic changes of liver tissue were examined by HE staining. Furthermore, we identified hyaluronic acids(HA), laminin(LN), collagentype IV(IV-C) in serum using radioimmunoassay and the expression of smooth muscle actinalpha(α-SMA) related gene in liver was tested by real-time fluorescence quantitative PCR. Results: Compared with control group, hepatic lobules in CCL4mice were damaged significantly, collagenous fiber was deposited obviously, and counterfeit hepatic lobules formed. The serum levels of ALT, AST, ALP were increased obviously (P<0.05) with the enhancement of HA, LN, IV-C in serum (P<0.05) and the expression of α-SMA related gene (P<0.05). Compared to CCL4-treated mice, the serum levels of ALT, AST, ALP in PFD-L and PFD-H groups were decreased, HA, LN, IV-C in PFD-L and PFD-H mice went down obviously，and the expression of α-SMA related gene was controlled (P<0.05). From pathological observation, we found the degree of liver fibrosis in PFD-L mice was reduced and collagenous fiber was decreased, only a little counterfeit hepatic lobule could be found. Cell arrangement in PFD-H mice recovered, the structural of hepatic lobules disordered and no obvious counterfeit hepatic lobules were found. Therefore, the recovery of PFD-H group was better than PFD-L group. Conclusion: Pirfenidone has a protective role in improving the outcome of the liver fibrosis and it may become a new direction of early intervention in liver fibrosis.

pirfenidone； carbon tetrachloride； hepatic fibrosis； hepatic stellate cells; mice

2015年度浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)項(xiàng)目(2015C37099)

2015-12-29

2016-04-19

R587.1

A

1000-6834(2016)04-378-05

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