阻斷孕鼠子宮動脈后宮內(nèi)窘迫胎鼠海馬組織內(nèi)谷氨酸濃度的變化

任杰 戴曉怡 李利彪 吳凡 郭春燕

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心外科，內(nèi)蒙古呼和浩特010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，

內(nèi)蒙古呼和浩特010050；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院麻醉科，內(nèi)蒙古呼和浩特010050

阻斷孕鼠子宮動脈后宮內(nèi)窘迫胎鼠海馬組織內(nèi)谷氨酸濃度的變化

任杰1戴曉怡2李利彪3吳凡3郭春燕3

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心外科，內(nèi)蒙古呼和浩特010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，

內(nèi)蒙古呼和浩特010050；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院麻醉科，內(nèi)蒙古呼和浩特010050

目的觀察阻斷孕鼠子宮動脈后宮內(nèi)窘迫胎鼠海馬組織內(nèi)谷氨酸（Glu）濃度的變化。方法隨機將72只SD孕鼠采用3伊3析因設計方法[阻斷子宮動脈的程度（3水平院輕度阻斷、中度阻斷、完全阻斷）和阻斷時間（3水平院5、10、15min）]，分為9組（n=8），建立宮內(nèi)窘迫的大鼠模型。全部胎兒宮內(nèi)窘迫制模結(jié)束后，剖宮取出胎鼠，留取海馬，采用高效液相色譜法檢測受試胎鼠海馬組織中Glu含量。結(jié)果阻斷孕鼠子宮動脈后宮內(nèi)窘迫可以誘發(fā)胎鼠海馬組織Glu濃度升高，輕度阻斷（5、10、15 min）分別為（50.20依7.67）、（54.67依7.52）、（65.40依7.61）滋mol/gprot，中度阻斷（5、10、15 min）分別為（69.17依12.08）、（90.53依18.95）、（121.84依22.62）滋mol/gprot，完全阻斷（5、10、15min）分別為（137.81依29.78）、（170.93依18.77）、（184.39依20.86）滋mol/gprot；在相同阻斷時間下，隨阻斷子宮動脈的程度加大，可增加受試胎鼠海馬組織內(nèi)Glu濃度（F=46.699、110.803、84.633，P<0.01）；在相同阻斷程度下，隨阻斷時間增加，Glu在胎鼠海馬組織內(nèi)的濃度亦增加（F=8.448、16.562、8.240，P<0.01）；且阻斷時間和阻斷程度對Glu的影響呈相互增加效果（F=3.088，P<0.05）。結(jié)論阻斷子宮動脈后宮內(nèi)窘迫可以誘發(fā)胎鼠海馬組織內(nèi)Glu濃度明顯升高，而且海馬組織中Glu濃度隨阻斷子宮動脈的程度和阻斷時間而增加。

谷氨酸；胎兒宮內(nèi)窘迫；高效液相色譜法；海馬

胎兒宮內(nèi)窘迫主要是由宮內(nèi)胎兒的血供絕對或相對下降引起的，造成胎兒出生后學習和記憶等腦功能下降，但其具體的發(fā)病機制不明，可能與中樞神經(jīng)谷氨酸（Glu）信息傳遞系統(tǒng)出現(xiàn)功能異常有一定關系。研究者的首要疑問是，胎兒宮內(nèi)窘迫后的缺血缺氧強應激誘發(fā)的神經(jīng)組織內(nèi)Glu濃度升高是否可以通過制作動物模型、以動物實驗來得到實際驗證鑰不同程度和時間阻斷子宮動脈會對胎鼠海馬組織中的Glu含量是否有不同的影響鑰為此設計本實驗，研究不同程度和時間阻斷子宮動脈的宮內(nèi)窘迫模型的制作和其誘發(fā)的缺血缺氧強應激對胎鼠海馬組織內(nèi)Glu含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇無特定病源體級（SPF）SD大鼠，鼠齡24周，體重為275~300 g，雌雄各80只，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學動物實驗部提供（動物合格批準文號院內(nèi)醫(yī)動-第013號）。雌雄大鼠合籠飼養(yǎng)之后，研究者需要每天使用棉簽擦拭雌鼠陰道，進行陰道精液涂片檢測，若為陽性則將該日記錄為雌鼠受孕的第1天，并且換用高營養(yǎng)的飼料進行喂養(yǎng)。此后，實驗人員應每日觀察該雌鼠的腹部是否有膨隆的懷孕表現(xiàn)，如果連續(xù)10 d均無子宮膨隆現(xiàn)象，則可以認定為該雌鼠受孕過程失敗。本實驗實施方案經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學倫理審查委員會和內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理審查委員會審查批準，并且全部操作均按照動物實驗相關經(jīng)典指南嚴格執(zhí)行。所有實驗都嚴格遵循標準的動物實驗原則，即隨機、對照、雙盲的實驗原則。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

選取72只受孕18 d大鼠作為試驗對象，采用3伊3析因設計院阻斷子宮動脈的程度（3水平院輕微阻斷、中度阻斷、完全阻斷）和阻斷時間（3水平院5、10、15min），隨機分為9組（n=8）。

1.2.2 大鼠子宮動脈夾閉模型的制作及取材

選擇符合實驗要求的SD大鼠雌、雄合籠飼養(yǎng)受孕。受孕18 d時按照參考文獻[1]制作大鼠子宮動脈夾閉模型（宮內(nèi)窘迫大鼠模型），方法為院充分暴露大鼠子宮動脈后，用硅酮血管阻斷帶緊繞動脈，實驗開始時以一把血管鉗夾血管阻斷帶交匯處為輕微阻斷；兩把血管鉗并列夾為中度阻斷；完全阻斷動脈血流為完全阻斷。子宮動脈夾閉模型制模結(jié)束后，剖宮取出胎鼠，麻醉下斷頭取腦、分離獲取胎鼠海馬，組織進行稱重后，加甲醇-水配制的離心液1mL，在低溫下勻漿處理，繼而取出一部分的勻漿液置于4益，以12 000 r/min的條件，進行15 min離心處理，最后取出上清液，再經(jīng)濾膜過濾處理之后，將其放置在-80益冰箱之內(nèi)保存，待測Glu具體含量。

1.2.3 高效液相色譜法（HPLC）檢測Gl u在胎鼠海馬中的含量［2］

1.2.3.1 檢測樣品處理好的胎鼠右側(cè)海馬勻漿上清液。

1.2.3.2 試劑Glu標準品（Sigma公司、L-Glutamic acid ReagentPlusR，批號2013000312），鄰苯二甲醛（上海碧云天生物有限公司，批號201200431），茁-巰基乙醇（Gibco公司，2-Mercaptoethanol-1000X，批號20140000545），色譜級甲醇（上海碧云天生物有限公司，批號201200652）。

1.2.3.3 儀器及色譜條件低溫高速離心機（Centrifuge 5810R，HPLC色譜系統(tǒng)（Shimadzu/島津，型號LC-10AD VP），包括600泵、熒光2475檢測器、Empower色譜工作站；18-ODS色譜柱，柱溫35益；流動相A院0.1 mol/L醋酸鉀，流動相B院甲醇；進行二元梯度洗脫，梯度洗脫程序院（T，B%）（0，45%）（1，65%）（6，75%）（20，45%）。T指時間（min），B%指B流動相所占比例。流動相經(jīng)0.45滋m微孔濾膜過濾，超聲脫氣。流速1.0 mL/min、激發(fā)波長250 nm，發(fā)射波長410 nm，以Glu的峰面積定量。

1.2.3.4 衍生化試劑的配制將20mg OPA溶于500滋L色譜級的甲醇中，進行超聲溶解，再加入茁-巰基乙醇500滋L，加入9 mL pH 10.0的硼酸緩沖液，避光密封后置于0~4益冰箱保存。

1.2.3.5 氨基酸標準液的配制Glu標準品配成100滋mol/L的標準溶液，檢測之前進行稀釋。

1.2.3.6 衍生及分析取100滋L標準液或者組織樣品液和Eppendorf 3810型微量離心管（簡稱EP管），加入100滋L衍生化試劑反應2min后進樣20滋L。

1.2.3.7 Glu標準曲線的建立配制濃度分別為0.15、0.30、0.735、1.47、2.94、3.675、5.88mg/L的Glu標準溶液，衍生化處理后測定。應用外標法進行定量分析，以其峰面積（Y）對其濃度（X）進行直線回歸，得到線性方程。

1.2.3.8 海馬組織內(nèi)Glu含量的測定對海馬組織的勻漿上清液進行解凍，置入玻璃勻漿器，加冰凍的甲酸（1 mol/L，2 mL），冰浴下手動充分勻漿。將勻漿液于4益7000 r/min離心30 min。取上清液置-20益保存。每1毫升勻漿上清液加0.75 mL 4%的碳酸氫鈉溶液混勻，4益3000 r/min離心5 min，取上清液過0.45滋m濾膜，分裝。取分裝液24滋L，在進樣瓶中加衍生試劑12滋L，四硼酸鈉緩沖液（pH 9.18）960滋L，混勻，20益下靜置3 min后再依次進樣，繼而梯度洗脫，測定海馬組織的Glu含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)依標準差（x±s）表示，首先對各組樣本行方差齊性的檢驗，若經(jīng)過檢驗證明方差齊，則采用析因設計方差分析，分析各因素的交互效應和主效應；各因素的單獨效應采用單因素方差分析。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

隨阻斷子宮動脈的程度加大，相同阻斷時間的胎鼠海馬組織內(nèi)Glu濃度逐漸增加（F=46.699、110.803、84.633，P<0.01）；隨阻斷時間增加，相同阻斷程度的受試胎鼠海馬組織內(nèi)Glu濃度亦逐漸增加（F=8.448、16.562、8.240，P<0.01）；阻斷時間和阻斷程度對胎鼠海馬組織Glu的影響呈相互增加效果（F= 3.088，P<0.05）。見表1。

表1 不同時間和程度阻斷子宮動脈后胎鼠海馬組織Glu含量（滋mol/gprot，，n=8）

表1 不同時間和程度阻斷子宮動脈后胎鼠海馬組織Glu含量（滋mol/gprot，，n=8）

項目5 min 10 min 15 min F值P值輕度阻斷中度阻斷完全阻斷F值P值50.20依7.67 69.17依12.08 137.81依29.78 46.699 0.000 54.67依7.52 90.53依18.95 170.93依18.77 110.803 0.000 65.40依7.61 121.84依22.62 184.39依20.86 84.633 0.000 8.448 16.562 8.240 0.002 0.000 0.002 F=3.088，P=0.022

3 討論

本研究選用SD大鼠，通過雌性和雄性大鼠合籠，以促使雌鼠受孕。通過不同程度阻斷受孕鼠的子宮動脈造成胎盤循環(huán)障礙誘發(fā)胎鼠宮內(nèi)窘迫，達到所需時間后以制作胎兒宮內(nèi)窘迫的大鼠模型，來測定胎鼠海馬組織中Glu的含量。Glu在人腦中的含量為8.4滋mol/g，哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸的神經(jīng)遞質(zhì)大約40%為Glu[3-5]，是最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。Glu作為神經(jīng)遞質(zhì)，其對神經(jīng)細胞的作用具雙向性[6-8]院一是正常含量的Glu遞質(zhì)激動Glu受體以激動神經(jīng)細胞N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-d-aspartic acid，NMDA）受體是保持神經(jīng)細胞傳遞正常信息、保持信息傳導通路暢通所必須的；二是如果腦內(nèi)過度大量釋放Glu，會過度激動膜電位依賴式Glu受體，會引起Cl-、Na+、H2O和Ca2+大量內(nèi)流，導致神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+超載，通過磷酸肌醇環(huán)路的激活破壞神經(jīng)細胞的超微結(jié)構，最終神經(jīng)細胞溶解、凋亡或壞死，造成機體學習記憶等腦功能障礙?；贕lu及NMDA受體的相關研究表明，強應激能夠使Glu在受試動物腦內(nèi)海馬組織中的表達水平明顯增加，過高表達的Glu使得NMDA受體過度激活，引起Cl-、Na+、H2O和Ca2+大量內(nèi)流，導致神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+超載等興奮性神經(jīng)細胞毒性反應[9-11]，其可以導致神經(jīng)細胞損傷[12-16]，造成學習記憶等腦功能障礙[17-20]。

宮內(nèi)窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激導致Glu介導的神經(jīng)細胞興奮性毒性反應[13]。本實驗發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激后胎鼠海馬組織內(nèi)Glu濃度明顯上升，結(jié)果提示宮內(nèi)窘迫可誘發(fā)Glu信息傳遞系統(tǒng)的異常興奮，可能會給胎鼠帶來Glu過度表達和過度激活相關的Glu受體，造成神經(jīng)細胞的興奮性毒性，使宮內(nèi)窘迫后胎鼠的腦內(nèi)神經(jīng)細胞受損，即宮內(nèi)窘迫造成的胎鼠缺血缺氧的強刺激可激活Glu介導的神經(jīng)傳遞系統(tǒng)的過度興奮。本研究還發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)窘迫誘發(fā)缺血缺氧強應激后引起Glu濃度在胎鼠腦內(nèi)海馬組織中的升高，具有量效性的特點和時效性的特點。實驗結(jié)果提示，阻斷孕鼠子宮動脈的時間越長和程度越重，Glu在胎鼠腦內(nèi)海馬組織內(nèi)中的表達越高，可以推斷宮內(nèi)窘迫的時間和宮內(nèi)窘迫的程度對胎鼠神經(jīng)系統(tǒng)的損害呈正相關。這為臨床治療和預防宮內(nèi)窘迫后胎兒學習記憶障礙提供了新的指導方向，即應充分改善子宮動脈的供血，可減輕胎兒宮內(nèi)窘迫誘發(fā)的缺血缺氧強應激后的胎兒機體神經(jīng)細胞損傷。

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Change of glutam ate in the hippocam pus of neonatal rats after fetal intrauterine distress by blocking uterine blood supp ly

REN Jie1DAIXiaoyi2LILibiao3WU Fan3GUOChunyan3
1.Department of Cardiovascular Surgery,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Au-tonomous Region,Huhhot 010050,China;2.Department of Gynaecology and Obstetrics,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Autonomous Region,Huhhot 010050,China;3.Department of Anesthe-siology,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Autonomous Region,Huhhot 010050,China

Objective To observe the changes of glutamate in the hippocampus of neonatal rats after fetal intrauterine distress by blocking uterine blood supply.M ethods 72 pregnant ratswere random ly divided into 9 experimental groups (n=8,in each group).As the analysis of variance of factorial design set up two intervention factorswhich were the de-gree of blocking uterine blood supply(three levels:mild blocked,moderate blocked,completely blocked)and the dura-tion of blocking uterine blood supply(three levels:5,10,15 min).After the fetal intrauterine distressmodel estab-lished,cut open the uterus to remove the fetal rats.The hippocampuses of fetal rats were removed,and the content of glutamate of fetal hippocampuses were detected by high performance liquid chromatography.Resu lts Fetal intrauterine distress can significantly up-regulated the content of glutamate,which of themild blocked(5,10,15min)was(50.20依7.67),(54.67依7.52),(65.40依7.61)滋mol/gprot respectively;moderate blocked(5,10,15min)was(69.17依12.08),(90.53依18.95),(121.84依22.62)滋mol/gprot respectively;completely blocked(5,10,15 min)was(137.81依29.78),(170.93依18.77),(184.39依20.86)滋mol/gprot respectively.The changeswere correlated with the degree and duration of blocking uterine blood supply of the fetal intrauterine distress(F=46.699,110.803,84.633,P<0.01;F=84.633,16.562,8.240, P<0.01),and both influenced present additive effect(F=3.088,P<0.05).Conclusion This results indicate that the content of glutamate are up-regulated by fetal intrauterine distress in the hippocampus of fetal rats,and its increased with the duration and degree of blocking uterine blood supply.

Glutamate;Fetal intrauterine distress; High performance liquid chromatography;Hippocam-pus

R364.4

A

1673-7210（2016）07（a）-0022-04

院2016-04-01本文編輯院程銘）

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學科技百萬工程項目（YKD2015KJBW022）。

李利彪（1975.11-），男，內(nèi)蒙古和林格爾人，醫(yī)學博士，副主任醫(yī)師；研究方向院麻醉與認知功能障礙。