豬谷氧還蛋白I（GLRX1）基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測方法的建立

馬改妮，劉　珂，郇貝麗，魏建超，邵東華，李蓓蓓，邱亞峰，石元元，馬志永

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

豬谷氧還蛋白I（GLRX1）基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測方法的建立

馬改妮，劉珂，郇貝麗，魏建超，邵東華，李蓓蓓，邱亞峰，石元元，馬志永

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

本研究針對豬GLRX1設(shè)計特異性引物，將PCR 擴(kuò)增片段分別連接至T-easy 載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)篩選、鑒定純化后，10倍梯度稀釋作為質(zhì)控樣品，用于實時熒光定量PCR中GLRX1標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建，并進(jìn)行反應(yīng)的靈敏性、特異性和重復(fù)性試驗。結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系R2值均在0.99 以上；特異性結(jié)果表明只能檢測到豬GLRX1擴(kuò)增曲線；組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于5%。本研究初步建立了檢測豬GLRX1基因的SYBR Green熒光定量RT-PCR的方法，為后續(xù)對豬傳染性疾病與豬GLRX1之間相互關(guān)系的研究提供了一種特異、靈敏的檢測方法。

豬谷氧還蛋白；SYBR GreenⅠ；實時熒光定量PCR

谷氧還蛋白（glutaredoxin，GLRX），普遍存在于細(xì)菌、病毒和哺乳動物體內(nèi)，其表達(dá)受干擾素（interferon，IFN）調(diào)控。人谷氧還蛋白有兩種類型GLRX1和GLRX2，其中GLRX1分子量為12 kDa，由106～107個氨基酸殘基組成，參與組成巰基-二硫鍵氧化還原酶家族，依靠谷胱甘肽（GSH）將氧化狀態(tài)的蛋白質(zhì)二硫鍵還原為巰基，從而對蛋白進(jìn)行修復(fù)。大量研究表明GLRX1是一種具有多種生物學(xué)功能的多效性細(xì)胞因子，與調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)、細(xì)胞生長和抑制凋亡有密切關(guān)系，與人類某些疾病，如AIDS和細(xì)菌感染等的發(fā)生、發(fā)展也相關(guān)。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)GLRX1可能是一種重要的抗病毒因子，但是其抗病毒作用的機(jī)制卻沒有相關(guān)報道。為進(jìn)一步研究GLRX1的抗病毒機(jī)制及其與豬傳染性疾病的相互關(guān)系，建立一種高效檢測GLRX1的方法非常必要。本研究針對豬GLRX1基因保守區(qū)設(shè)計1對引物，擬建立一種能夠穩(wěn)定精確檢測豬GLRX1基因表達(dá)的熒光定量RT-PCR方法，為針對GLRX1功能的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1豬組織樣品所有豬組織樣品均由上海奉賢區(qū)某豬場提供。

1.2主要試劑Trizol 試劑、反轉(zhuǎn)錄酶MLV、RNA 酶抑制劑、ExTaq DNA 聚合酶、SYBR Green Ex Taq II及快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自康寧Axygen；T-easy載體購自Promega公司；動物組織RNA試劑盒、大腸桿菌DH5α購自天根公司。

1.3引物利用Beacon Designer 7，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的豬GLRX1基因序列（登錄號：NM_ 214233.1），針對其保守區(qū)設(shè)計特異性引物。Sus scrofa GLRX r1：5′-AGCCTGGGAAGGTGG TAGTTT-3′，Sus scrofa GLRX r2：5′-CTCGTTGG TGTCACTGGTGG-3′；Sus scrofa GAPDH 1R：5′-TCTGGCAAAGTGGACATT-3′，Sus scrofa GAPDH 2R：5′-GGTGGAATCATACTGGAACA-3′。利用Primer Primier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計豬GLRX1擴(kuò)增引物。Sus scrofa GLRX 1a：5′-CCGGAATTCATGGCT CAAGCATTTGTGAACAGCA-3′，Sus scrofa GLRX 2a：5′-CCCAAGCTTTTTCAGAGCTCCAATTTGCT GCA-3′，全長為336 bp。引物均由上海Invitrogen公司合成。

1.4細(xì)胞和組織中總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄按照Qiagen總RNA提取試劑盒說明書提取豬組織總R N A。以2 μ L總R N A為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系（20 μL）包含：Random Primer 1μL隨機(jī)引物、5×反轉(zhuǎn)錄Buffer 4μL、DTT 2μL，dNTP mix(10 mmol/L) 1μL、1μL反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）、RNA RNase Inhibition（20U/μL） 1μL，混勻后于37℃水浴作用1.5 h，用于豬GLRX1擴(kuò)增實驗。細(xì)胞樣品按照Trizol法說明書提取總RNA，使用快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，總RNA為模板 2μL，DEPC水 6μL，RT Master Mix 2μL，反應(yīng)產(chǎn)物用于實時熒光定量實驗。

1.5陽性標(biāo)準(zhǔn)模板的建立以Sus scrofa GLRX 1a和Sus scrofa GLRX 2a為引物，擴(kuò)增豬GLRX1。反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性1 min，56℃退火15 s，72℃延伸10 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min?；厥占兓康钠?，與T-easy載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸埃希氏菌種，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和序列測定，挑選結(jié)果正確的質(zhì)粒并測定其濃度。

1.6SYBR Green｜實時熒光定量PCR檢測方法的建立

1.6.1SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板, 反應(yīng)體系為20μL，分別對引物、模板、SYBR GreenⅠmix的最佳使用量，以及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化并繪制熔解曲線。

1.6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將豬GLRX1標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋至10-4，并以系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，進(jìn)行實時熒光定量PCR。反應(yīng)體系包括2×SYBR Green Premix Ex Taq II 10μL、上下游引物各0.4μL（25 pmol/μL）、模板（質(zhì)粒或cDNA）1μL、ROX Reference Dye (50×)0.4μL、DEPC水7.8μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性5 s，60℃退火、延伸34 s，擴(kuò)增40 個循環(huán)。以Ct值為橫坐標(biāo)，以起始模板濃度的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7敏感性試驗對標(biāo)準(zhǔn)品以10倍梯度稀釋后進(jìn)行將熒光定量PCR，反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.8 重復(fù)性試驗對3份不同批次的陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗和批間重復(fù)試驗。

2　結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)品的制備將反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增獲得的豬GLRX1基因與T-easy載體連接，對構(gòu)建的重組載體進(jìn)行PCR鑒定，獲得約300 bp大小的DNA片段（圖1），與目的片段相符，經(jīng)測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中豬GLRX1基因相似度為99%，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。經(jīng)測定重組質(zhì)粒大小為336 bp。

圖1　豬GLRX基因的PCR擴(kuò)增Fig. 1　PCR-amplifi ed porcine GLRX gene

2.2SYBR Green I 實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立對陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋至10-4，作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL, 結(jié)果各濃度有很好的線性關(guān)系。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.601X+3.37；Efficiency：0.90；R2：0.999（圖2）。

2.3SYBR Green I 實時熒光定量PCR的熔解曲線根據(jù)參數(shù)95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 10 s繪制熔解曲線。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)樣品均出現(xiàn)了窄且尖的單峰，無雜峰出現(xiàn)，熔解溫度為（74±0.5）℃（圖3），表明該SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR反應(yīng)為特異性擴(kuò)增。

圖2　實時熒光定量RT-PCR檢測豬GLRX1的擴(kuò)增曲線(A)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)Fig. 2　Amplifi cation plots (A) and standard curve (B) of real time SYBR Green I fl uorescent quantitative RT-PCR

圖3　SYBR Green ｜實時熒光定量PCR檢測豬GLRX1標(biāo)準(zhǔn)品的熔解曲線Fig. 3　The melting curve of real time SYBR Green Ifl uorescence quantitative RT-PCR for porcine GLRX1　standard

2.4敏感性試驗結(jié)果實時熒光定量PCR檢測梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)樣品，在35個循環(huán)內(nèi)Ct 值＞ 0, 且相鄰稀釋梯度拷貝數(shù)呈10倍關(guān)系。PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖4），結(jié)果與實時熒光定量PCR結(jié)果相符。

圖4　豬GLRX1標(biāo)準(zhǔn)品實時熒光定量PCR產(chǎn)物檢測Fig. 4　qPCR detection for porcine GLRX1 standard

2.5SYBR Green｜實時熒光定量PCR的重復(fù)性對3份批次的豬GLRX1基因標(biāo)準(zhǔn)品分別做3個批內(nèi)重復(fù)和3個批間重復(fù)，組內(nèi)變異系數(shù)均小于1.5%，組間變異系數(shù)均小于5%（表1），重復(fù)性良好，進(jìn)一步證實該方法檢測豬GLRX1基因高效、可信。

表 1　熒光定量PCR組內(nèi)和組間重復(fù)試驗Table 1　Intra-and inter-assay repeatability of realtime SYBR Green I fl uorescent quantitative RT-PCR

3　討論

我國是世界第一養(yǎng)豬大國，改革開放以來，我國養(yǎng)豬業(yè)保持著持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)展，養(yǎng)豬業(yè)已經(jīng)成為我國農(nóng)業(yè)與農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)，是廣大養(yǎng)殖農(nóng)戶的主要經(jīng)濟(jì)來源。我國養(yǎng)豬業(yè)正在從數(shù)量速度型向質(zhì)量效益型轉(zhuǎn)變，從粗放經(jīng)營型走向集約經(jīng)營，并取得了許多成績。養(yǎng)豬業(yè)已成為我國農(nóng)村和國民經(jīng)濟(jì)中相對獨立的發(fā)展較快、產(chǎn)業(yè)化程度較高、經(jīng)濟(jì)效益較顯著、科技貢獻(xiàn)率較高的產(chǎn)業(yè)。但我國養(yǎng)豬業(yè)仍然存在許多問題，其中豬病流行尤為突出，每年造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，制約著我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。其中豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬瘟病毒、豬流感病毒以及豬偽狂犬病病毒等是引起我國豬病流行的重要病毒，我國畜牧獸醫(yī)科技工作者投入大量的時間、精力研究這些病毒與豬機(jī)體反應(yīng)的相互關(guān)系，為進(jìn)一步了解病毒致病機(jī)制取得新的突破。

GLRX1是機(jī)體內(nèi)特異、高效還原谷胱甘肽化蛋白的一種氧化還原酶相對分子質(zhì)量較小，GLRX1充當(dāng)電子供體調(diào)節(jié)著細(xì)胞中含巰基蛋白的氧化還原狀態(tài)，參與氧化脅迫、細(xì)胞凋亡、蛋白修飾和細(xì)胞分化等多種生物過程，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮十分重要的作用。同時，GLRX1與人類健康密切相關(guān)，與心血管疾病、腫瘤，AIDS和細(xì)菌感染等的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但GLRX1在動物病毒性感染中的作用研究目前還沒有報道。

本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，在豬感染PRRSV過程中，GLRX1發(fā)揮著重要的免疫作用，豬GLRX1能夠有效抑制PRRSV的復(fù)制。建立準(zhǔn)確、穩(wěn)定的GLRX1分子檢測方法是進(jìn)一步研究GLRX1在體內(nèi)抗感染機(jī)制的重要基礎(chǔ)。本研究建立的實時熒光定量RT-PCR檢測方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，對3份不同批次的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行3個批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)，變異系數(shù)均小于5%，可以定性和定量檢測豬GLRX1的表達(dá)，實時分析樣品中GLRX1基因的表達(dá)含量，也可以應(yīng)用于其他豬病相關(guān)研究，為深入研究豬GLRX1的功能和機(jī)制打下基礎(chǔ)。

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DESIGN AND VALIDATION OF REAL TIME FLUORESENCE QUANTITATIVE RT-PCR ASSAY FOR DETECTION OF PORCINE GLUTAREDOXIN

MA Gai-ni, LIU Ke, HUAN Bei-li, WEI Jian-chao, SHAO Dong-hua, LI Bei-bei, QIU Ya-feng, SHI Yuan-yuan, MA Zhi-yong

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The objective of the study is to establish a method for detecting porcine GLRX1 by SYBR GreenΙrelative fluorescence quantitative RT-PCR. Special primers based on porcine GLRX1 were designed. Then these amplifi ed fragments were cloned into T-easy. Using the recombinant plasmid as standard products, a real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed to construct the standard curves of porcine GLRX1 and detect the sensitivity, specifi city and repeatability. The results showed a precise linear relationship with a correlation coeffi cient of R2＞ 0.99. The amplifi cation curve showing a single peak could only been detected for porcine GLRX1. The variation coeffi cient was less than 0.5% by within and between the groups of repeatability tests. The developed real-time PCR assay was highly specifi c, sensitive and reproducible, and could be an available tool for monitoring the relationship between pig infectious diseases and porcine GLRX1.

Porcine glutaredoxin(GLRX); SYBR Green I; real-time quantitative PCR assay

S852.42

A

1674-6422（2016）03-0078-05

2015-02-22

973計劃（2014CB542700）

馬改妮，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

馬志永，E-mail：zhiyongma@shvri.ac.an