柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在DF-1細(xì)胞中的表達(dá)

朱雪龍，黃　兵,3，韓紅玉，趙其平，朱順海，李　聰，門啟斐,2，王自文，夏偉麗,2，董　輝

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2. 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；3. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009）

柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在DF-1細(xì)胞中的表達(dá)

朱雪龍1，黃兵1,3，韓紅玉1，趙其平1，朱順海1，李聰1，門啟斐1,2，王自文1，夏偉麗1,2，董輝1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2. 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；3. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009）

為了構(gòu)建柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Eimeria tenella serine/threonine protein kinase，EtSTK）基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并實(shí)現(xiàn)在DF-1細(xì)胞中的表達(dá)，以柔嫩艾美耳球蟲子孢子cDNA為模板，PCR擴(kuò)增EtSTK基因，將擴(kuò)展產(chǎn)物與真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-flag連接，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtSTK，測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，利用Western blot和間接免疫熒光（indirect immunofl uorescene assay，IFA）對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtSTK構(gòu)建成功。Western blot顯示在54 kDa處出現(xiàn)條帶；IFA檢測到特異性的綠色熒光，表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-fl ag-EtSTK成功地在DF-1中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。本研究結(jié)果為深入了解柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的功能及球蟲核酸疫苗提供了基礎(chǔ)。

柔嫩艾美耳球蟲；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；DF-1細(xì)胞；真核表達(dá)

雞球蟲病是一種全球性的原蟲病，在集約化養(yǎng)殖場中的發(fā)病率高達(dá)50%～70%，死亡率為20%～30%，嚴(yán)重時(shí)甚至可達(dá)80%，每年給全球養(yǎng)禽業(yè)造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)5億英鎊[1]。在公認(rèn)的7種雞球蟲中，柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）分布最廣，致病力最強(qiáng)[2]。目前，雞球蟲病的控制主要依賴抗球蟲藥物，但球蟲耐藥性的產(chǎn)生已嚴(yán)重影響了藥物防治的效果，至今，人們已從養(yǎng)雞場中分離出幾乎對(duì)所有使用過的抗球蟲藥有耐藥性的蟲株。相對(duì)于抗球蟲藥來說，球蟲疫苗是防治球蟲病更為理想的選擇，與傳統(tǒng)疫苗相比，核酸疫苗具有很多優(yōu)勢，是當(dāng)前球蟲疫苗研究的熱點(diǎn)[3]，因此，尋找新核酸疫苗候選分子意義重大。

柔嫩艾美耳球蟲隸屬于頂復(fù)器門，需要入侵宿主細(xì)胞并在其中發(fā)育繁殖以完成整個(gè)生活史。頂復(fù)器門原蟲均擁有由微線體（Microneme）、棒狀體（Rhoptry）和致密顆粒（Dense granules）等細(xì)胞器組成的頂復(fù)合體，這些細(xì)胞器所分泌的蛋白在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中扮演著重要的角色[4]。研究表明，在頂復(fù)器門原蟲入侵宿主細(xì)胞過程中，蟲體與細(xì)胞接觸時(shí)會(huì)形成運(yùn)動(dòng)連接環(huán)（moving junction，MJ），該結(jié)構(gòu)對(duì)蟲體成功入侵宿主細(xì)胞具有重要作用[5]。頂體膜抗原1（apical membrance antigen-1，AMA1）是一種由頂復(fù)器門原蟲微線體分泌的蛋白，能與棒狀體分泌的數(shù)個(gè)蛋白形成復(fù)合體，是運(yùn)動(dòng)連接環(huán)的主要成分[6]。為了研究EtAMA1及其相互作用分子在蟲體入侵過程中的具體作用，本實(shí)驗(yàn)室前期研究中利用酵母雙雜交技術(shù)（Yeast two hybrid），以EtAMA1為誘餌蛋白篩選柔嫩艾美耳球蟲子孢子cDNA文庫，獲得了一些與EtAMA1相互作用的潛在蛋白EST序列[7]，其中編號(hào)為56-2的EST序列與本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)的柔嫩艾美耳球蟲子孢子與未孢子化卵囊的差異表達(dá)基因ZB1-A08序列完全一致[8]。本研究對(duì)該序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其具有一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，STK）結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建其全長編碼框序列的真核表達(dá)質(zhì)粒，并實(shí)現(xiàn)了在DF-1細(xì)胞中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究STK功能奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1蟲株柔嫩艾美耳球蟲上海株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物原蟲病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存提供。

1.1.2載體、菌株與細(xì)胞pGEM-T-easy vector購自美國Promega公司；大腸桿菌TOP10購自上海天根生物技術(shù)有限公司；DF-1細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所丁鏟研究員饋贈(zèng)；真核表達(dá)載體pcDNA3.1-flag vector由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.1.3主要試劑與試劑盒Ex Taq、限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I、Trizol購自大連TaKaRa公司；DNA Marker（DL2000）、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、2 x Taq PCR MasterMix購自上海天根生物技術(shù)有限公司；T4 DNA連接酶購自美國Promega公司；opti-MEM、DMEM、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；Western及IP細(xì)胞裂解液、DAPI購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG購自Jackson Immuno Research公司；PageRulerTMPrestained protein ladder購自美國Themo scientific公司；LipofectamineTM2000、M-MLV Reverse Transcriptase購自美國Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1柔嫩艾美耳球蟲子孢子總RNA提取以保存的柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊接種2周齡無球蟲雞，收集感染后d7盲腸中的卵囊，孢子化后，參照索勛[9]、黃兵等[10]報(bào)道方法對(duì)卵囊進(jìn)行純化，并按宋翠萍等[11]報(bào)道方法提取子孢子。按照Trizol說明書步驟提取子孢子總RNA，并用核酸凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)檢測所提總RNA的濃度和純度，符合要求后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)柔嫩艾美耳球蟲子孢子與未孢子化卵囊的差異表達(dá)基因ZB1-A08基因序列（登錄號(hào)：EF552217.1）設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增該基因完整ORF序列，長度為1524 bp。其中，上游引物序列為：5′-CGGGATCCATGGCCGCTTCATTCAGTTC TCTTG-3′，下游引物序列為：5′-CGGAATTCTCA CGAATAGATCAGGACGCTATGC-3′，上下游引物中分別引入BamH I和EcoR I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)（下劃線處），引物由上海賽百盛生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3PCR擴(kuò)增與測序?qū)?.2.1中所制備的子孢子總RNA按M-MLV Reverse Transcriptase說明書提供的步驟反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以其作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：cDNA 2μL，上、下游引物各 1μL ，ddH2O 5μL，2 x Taq PCR MasterMix 10 μL，Ex Taq 1μL，總體積共20μL。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性3 min；95℃變化 45 s，58.5℃退火 45 s，72℃延伸 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。回收特異性PCR產(chǎn)物，與pGEM-T-easy vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入TOP10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂在含Amp+平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白斑菌落過夜培養(yǎng)后，以其為模板進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)鑒定分子量大小與預(yù)期一致的陽性菌落送上海桑尼生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4生物信息學(xué)分析利用在線工具ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析所獲得的序列，找出其開放閱讀框；利用ProtParam工具（http://cn.expasy.org/tools/protparam.html）分析編碼蛋白質(zhì)理論分子量大小、等電點(diǎn)、氨基酸組成等；利用TMHMM服務(wù)器（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM-2.0/）分析該編碼蛋白有無跨膜結(jié)構(gòu)；利用SignalP3.0在線分析軟件（www.cbs.dtu. dk/services/SignalP）分析編碼蛋白有無信號(hào)肽；使用motif_scan工具（http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/ motif_scan）尋找氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域，推測目的蛋白可能具備的功能；利用北京大學(xué)生物信息中心WebLab提供的Antigenic程序（http://weblab.cbi.pku. edu.cn/program.inputForm.do?program=antigenic）分析其抗原位點(diǎn)；利用CDD程序（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/structure/cdd/cdd.shtml）對(duì)氨基酸序列進(jìn)行功能保守功能域分析，判斷該蛋白是否具有完整的保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.5重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建按質(zhì)粒試劑盒說明書提供的步驟提取1.2.3中構(gòu)建的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I分別對(duì)pcDNA3.1-flag空載體以及重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物分別經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒回收目的片段，4℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入TOP10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂板，37℃培養(yǎng)8 h，挑取單克隆菌落于4 mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，進(jìn)行PCR鑒定。對(duì)鑒定為陽性的菌液，用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，以BamH I和EcoR I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，陽性克隆送上海桑尼生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.6DF-1細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)將凍存的DF-1細(xì)胞從液氮中取出，立即放入37℃溫水浴中，融化后將其轉(zhuǎn)入無菌EP管中，1500 r/min離心5 min，棄上清以除去凍存液中的DMSO等成份，用含10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5% CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天用倒置顯微鏡對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行觀察，每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶壁后及時(shí)分瓶，傳2～3代至細(xì)胞狀態(tài)良好后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7真核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞將裝有DF-1細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶移至超凈臺(tái)內(nèi)，棄去其中的培養(yǎng)液，用opti-MEM洗滌瓶中貼壁的DF-1細(xì)胞以除去殘留的FBS，加入0.25%的trypsin-EDTA ，37℃消化2 min。棄去trypsin-EDTA，加入適量DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以6×105個(gè)細(xì)胞/孔鋪被六孔板2塊，置于37℃、5% CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染步驟分別將pcDNA3.1-flag空質(zhì)粒和真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入DF-1細(xì)胞，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6 h后，更換為含2%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件不變。48 h后將1塊六孔板中的DF-1細(xì)胞用于間接免疫熒光檢測（indirect immunofluorescene assay，IFA），收集另1塊六孔板中的DF-1細(xì)胞，使用Western及IP細(xì)胞裂解液提取DF-1細(xì)胞蛋白后用于Western blot檢測。

1.2.8Western blot鑒定向1.2.7中所制備的1塊六孔板中每孔加入適量的Western及IP細(xì)胞裂解液裂解DF-1細(xì)胞，具體操作根據(jù)說明書進(jìn)行，4℃、12 000×g 離心5 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE。半干法電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂乳4℃封閉過夜；PBS洗滌5次，加入1:50稀釋的抗ZB1-A08蛋白兔血清，37℃孵育3 h；PBST洗滌5次，加入1:8000稀釋的近紅外熒光山羊抗兔IgG二抗，37℃避光孵育2 h；PBS洗滌5次后使用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)拍照，保存。

1.2.9間接免疫熒光（indirect immunofluorescene assay，IFA）檢測將1.2.7中所制備的另1塊六孔板取出，吸凈培養(yǎng)基，每孔用1 mL PBS輕柔洗滌3次，加入2 mL 2%多聚甲醛，室溫固定15 min；用1 mL PBS洗滌5次，加入2 mL 1%Triton X-100，室溫處理15 min；用1 mL PBS洗滌5次，加入2 mL 5%BSA，4℃封閉過夜；PBS洗滌5次，加入1:50稀釋的抗ZB1-A08蛋白兔血清，37℃孵育2 h；PBS洗滌5次，加入1:400稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗，避光孵育2 h；PBS洗滌5次，加入1:10 000稀釋的DAPI染核，避光孵育15 min；PBS洗滌5次，用鑷子輕輕取出飛片，倒蓋于滴有抗熒光淬滅劑的載玻片上，置于正置熒光顯微鏡下觀察，拍照。

2　結(jié)果

2.1基因的克隆以柔嫩艾美耳球蟲子孢子cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)在1500 bp左右有1條特異性的單一條帶，大小為1524 bp，與預(yù)期一致（圖1）。

圖1　EtSTK基因的PCR擴(kuò)增Fig. 1　PCR amplifi cation of EtSTK gene

2.2基因序列的生物信息學(xué)分析對(duì)構(gòu)建的重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序，并對(duì)所獲得的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因的核苷酸序列與柔嫩艾美耳球蟲子孢子與未孢子化卵囊的差異表達(dá)基因ZB1-A08基因100%同源，保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)其具有一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，STK）結(jié)構(gòu)域（圖2），故將其命名為柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Eimeria tenella serine/threonine protein kinase，EtSTK）。其ORF大小為1524 bp，編碼507個(gè)氨基酸，理論分子量為54 kDa，預(yù)測等電點(diǎn)為8.36。該基因編碼蛋白的1～56位氨基酸位于細(xì)胞內(nèi)部，80～507氨基酸位于細(xì)胞膜外，在57～79位氨基酸間形成一個(gè)典型的跨膜旋轉(zhuǎn)區(qū)；無信號(hào)肽；可能有24個(gè)抗原位點(diǎn)；不具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)；可能含有1個(gè)N端糖基化位點(diǎn)，1個(gè)cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，7個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)N-myristoylation位點(diǎn)以及7個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)。

圖2　EtSTK蛋白的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域Fig. 2　Serine / threonine protein kinase domain of the EtSTK protein

2.3真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建使用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I分別對(duì)pcDNA3.1-flag空載體以及鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，切膠純化，膠回收后連接，轉(zhuǎn)化入TOP10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂板挑菌、搖菌，抽提質(zhì)粒，構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒，命名為pcDNA3.1-flag-EtSTK，雙酶切產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)2個(gè)條帶（圖3）。序列測定顯示目的片段正確插入到質(zhì)粒當(dāng)中，無移碼和突變現(xiàn)象。

2.4Western blot鑒定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag-EtSTK重組真核表達(dá)質(zhì)粒的DF-1細(xì)胞在約54 kDa處有一條特異性的條帶，而轉(zhuǎn)染了pcDNA 3.1-flag空質(zhì)粒的DF-1細(xì)胞未檢測到相應(yīng)條帶（圖4）。

圖3　重組質(zhì)粒pcDNA3.1-fl ag-EtSTK雙酶切鑒定結(jié)果Fig. 3　Identifi cation of the recombinant plasmid pcDNA3.1-fl ag-EtSTK by restriction enzymes digestion

圖4　重組質(zhì)粒pcDNA3.1-fl ag-EtSTK 轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞的Western blot鑒定Fig. 4　Western blot identifi cation of DF-1 cells transfected with recombinant plasmid pcDNA3.1-fl ag-EtSTK

2.5間接免疫熒光檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了pcDNA 3.1-flag-EtSTK重組真核表達(dá)質(zhì)粒的DF-1細(xì)胞在綠色熒光通道中可以看到清晰、特異的綠色熒光（圖5A），DAPI染核后可以看到清晰、特異的有藍(lán)色熒光附著的細(xì)胞核（染核圖略）；而轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-flag空質(zhì)粒的DF-1細(xì)胞無綠色熒光（圖5B、圖5C），DAPI染核后也可看到清晰、特異的有藍(lán)色熒光附著的細(xì)胞核（染核圖略）。

圖5　重組質(zhì)粒pcDNA3.1-fl ag-EtSTK 轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞的間接免疫熒光檢測Fig. 5　IFA result of recombinant plasmid pcDNA 3.1-fl ag-EtSTK in DF-1 cells

3　討論

蛋白磷酸化是生物體調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)各種外界信號(hào)應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。蛋白激酶通過對(duì)底物蛋白的磷酸化修飾參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用的信號(hào)分子[12]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，STK）是一類能使特定底物蛋白中絲氨酸或蘇氨酸羥基磷酸化的蛋白激酶，通過催化多種功能蛋白（如酶、受體、運(yùn)輸?shù)鞍住⒄{(diào)節(jié)蛋白、核內(nèi)蛋白等）的磷酸化，STK可以改變功能蛋白的構(gòu)象，導(dǎo)致功能蛋白活性、性質(zhì)的變化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生命活動(dòng)過程。目前已在日本血吸蟲（Schistosoma japonicum）[13]、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）[14]、惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）[15]等寄生蟲中發(fā)現(xiàn)有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要功能，但至今該酶在球蟲中的作用尚不清楚。本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期研究中發(fā)現(xiàn)的可能與EtAMA1作用的一種蛋白的基因進(jìn)行了克隆，序列分析發(fā)現(xiàn)該基因是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其功能可能與蛋白磷酸化相關(guān)。由于該基因是潛在的EtAMA1作用蛋白，而AMA1在球蟲入侵宿主細(xì)胞中發(fā)揮重要功能[16]，因此推測該蛋白可能也參與了子孢子入侵宿主細(xì)胞的過程，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

用于蛋白表達(dá)的系統(tǒng)包括原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)，與前者相比，后者表達(dá)出的蛋白更接近于天然蛋白，有利于對(duì)天然蛋白功能進(jìn)一步的研究。常用于真核表達(dá)的載體有pEGFP[17]、pWPXLd[18]、pcDNA3.1（+）[19]等，其中以pcDNA3.1（+）最為常見。pcDNA3.1（+）全長5427 bp，帶有CMV、BGH、SV40等啟動(dòng)子，其中CMV啟動(dòng)子含有一段非常強(qiáng)力的增強(qiáng)子序列，表達(dá)外源基因時(shí)幾乎沒有細(xì)胞特異性，能在絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定高效表達(dá)[20]。此外，pcDNA3.1（+）還帶有一個(gè)Neo抗性基因便于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選，常用于融合表達(dá)外源基因蛋白和核酸疫苗的研究[21]。本研究中使用的pcDNA3.1-flag質(zhì)粒由pcDNA3.1（+）質(zhì)粒改造而成，主要是在該載體多克隆位點(diǎn)的N端添加一個(gè)flag標(biāo)簽，flag標(biāo)簽序列簡短，對(duì)目的蛋白的影響小，易加在目的蛋白的N端或C端并與之構(gòu)成融合蛋白，可用Anti-flag單克隆抗體對(duì)其檢測[22]。此外，flag標(biāo)簽還可用于免疫親和層析，在非變性條件下洗脫flag標(biāo)簽融合蛋白[23]。pcDNA3.1質(zhì)粒具有表達(dá)重組蛋白高效穩(wěn)定，易于純化等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、寄生蟲相關(guān)研究中，如羊痘病毒P32基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建[24]、嗜肺軍團(tuán)菌免疫原蛋白免疫保護(hù)力相關(guān)研究[25]、弓形蟲主要表面抗原P30復(fù)合基因疫苗的構(gòu)建[26]等。pcDNA3.1載體也被廣泛應(yīng)用于球蟲基因的真核表達(dá)以及DNA疫苗的研制中，例如盧軍霞[27]將堆型艾美耳球蟲第二代裂殖子表面抗原3-1E與pcDNA3.1質(zhì)粒連接，構(gòu)建了pcDNA3.1-3-1E真核表達(dá)質(zhì)粒。張麗娟[28]對(duì)其構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-3-1E真核表達(dá)質(zhì)粒能有效提高雛雞的細(xì)胞免疫和體液免疫水平，且安全無害。翟頎[29]構(gòu)建了柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白EtCHP559基因的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559，發(fā)現(xiàn)所獲重組蛋白的多克隆抗體對(duì)柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵宿主細(xì)胞有明顯的抑制作用。

對(duì)于真核重組質(zhì)粒蛋白表達(dá)細(xì)胞的選擇，常用的有293T[30]、HeLa[31]、BHK[32]、DF-1[33]等。DF-1是一種已商品化的穩(wěn)定的傳代細(xì)胞，來源于East lansing line（ELL-0）雞胚成纖維細(xì)胞，被廣泛應(yīng)用于病毒疫苗生產(chǎn)、重組病毒或蛋白的表達(dá)。姜連連等[34]首次以DF-1作為柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵宿主細(xì)胞，建立了球蟲DF-1細(xì)胞培養(yǎng)體系。本研究對(duì)象柔嫩艾美耳球蟲寄生于雞盲腸細(xì)胞內(nèi)，相比其他細(xì)胞，DF-1細(xì)胞更貼近柔嫩艾美耳球蟲的天然宿主細(xì)胞。Western blot和IFA均證實(shí)，本研究構(gòu)建的pcDNA3.1-flag-EtSTK真核表達(dá)質(zhì)粒在DF-1細(xì)胞中成功得到表達(dá)，這為進(jìn)一步研究柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的特性，研制球蟲核酸疫苗提供了基礎(chǔ)。

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CONSTRUCTION OF EUKARYOTIC EXPRESSION PLASMIDS OF EIMERIA TENELLA SERINE / THREONINE PROTEIN KINASE AND ITS EXPRESSION IN DF-1 CELLS

ZHU Xue-long1, HUANG Bing1,3, HAN Hong-yu1, ZHAO Qi-ping1, ZHU Shun-hai1, LI Cong1, MEN Qi-fei1,2, WANG Zi-wen1, XIA Wei-li1,2, DONG Hui1

(1. Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

In order to construct eukaryotic recombinant expression plasmids of Eimeria tenella serine/threonine protein kinase（EtSTK）gene and express it in DF-1 cells, the EtSTK gene was amplifi ed by PCR with the cDNAs of the sporozoite of E. tenella as template. The PCR products were subcloned to pcDNA3.1-fl ag vector. The recombinant plasmids were transfected into DF-1 cells. The expression of recombinant EtSTK protein in DF-1 cells was detected with Western blot and indirect immunofl uorescene assay（IFA）. A protein about 54 kDa which was in accordance with molecular weight of target protein was recognized by recombinant EtSTK antiserum in Western blot. Green fl uorescence was observed by IFA in DF-1 cells. These results indicated that the recombinant plasmids of pcDNA3.1-fl ag-EtSTK were successfully constructed and expressed in DF-1 cells, which laid a foundation for future research on biological functions of EtSTK and Eimeria DNA vaccine.

Eimeria tenella; serine/threonine protein kinase; DF-1 cell; eukaryotic expression

S852.723

A

1674-6422（2016）03-0048-07

2016-02-29

國家自然科學(xué)基金（31272557）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2015JB10）

朱雪龍，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

董輝，E-mail：donghui@shvri.ac.cn