日本血吸蟲(chóng)C1q結(jié)合蛋白基因的克隆表達(dá)及其免疫保護(hù)效果評(píng)估

賈秉光，洪　煬，韓　倩，呂　超，王　濤，柴淑梅，曹曉丹，陸　珂，宰金麗，馬　帥，林矯矯,2，傅志強(qiáng)

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2. 江蘇省動(dòng)物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

日本血吸蟲(chóng)C1q結(jié)合蛋白基因的克隆表達(dá)及其免疫保護(hù)效果評(píng)估

賈秉光1，洪煬1，韓倩1，呂超1，王濤1，柴淑梅1，曹曉丹1，陸珂1，宰金麗1，馬帥1，林矯矯1,2，傅志強(qiáng)1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2. 江蘇省動(dòng)物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

本研究利用PCR技術(shù)擴(kuò)增到日本血吸蟲(chóng)C1qBP基因，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-SjC1qBP，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。將重組蛋白免疫小鼠評(píng)估其免疫保護(hù)效果，采用Western blot檢測(cè)其免疫原性，ELISA檢測(cè)其特異性抗體水平，應(yīng)用補(bǔ)體溶血試驗(yàn)分析重組蛋白對(duì)補(bǔ)體溶血的抑制效果。結(jié)果顯示日本血吸蟲(chóng)C1qBP基因含729 bp的編碼序列，在大腸桿菌中BL21（DE3）中表達(dá)后，用His-Bind親和層析純化可獲得50 kDa的重組蛋白rSjC1qBP。應(yīng)用重組蛋白rSjC1qBP免疫BALB/c小鼠可產(chǎn)生較高水平的特異性IgG抗體，誘導(dǎo)36.08%的減蟲(chóng)率和43.45%的肝臟減卵率；補(bǔ)體溶血試驗(yàn)結(jié)果表明該重組蛋白能夠抑制補(bǔ)體溶血。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究日本血吸蟲(chóng)SjC1qBP的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

日本血吸蟲(chóng)；C1qBP基因；補(bǔ)體；重組蛋白

日本血吸蟲(chóng)病是由日本分體吸蟲(chóng)（又稱日本血吸蟲(chóng)，Schistosoma japonicum，Sj）感染引起一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)病[1]。血吸蟲(chóng)尾蚴通過(guò)皮膚感染哺乳動(dòng)物宿主后，在宿主體內(nèi)的移行、發(fā)育、寄生過(guò)程中始終遭受宿主的免疫攻擊，但相當(dāng)比例的蟲(chóng)體能夠逃避宿主的免疫攻擊且發(fā)育成熟。免疫逃避在血吸蟲(chóng)的發(fā)育和寄生過(guò)程中具有關(guān)鍵作用[2]。補(bǔ)體是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要效應(yīng)系統(tǒng)，可迅速標(biāo)記并清除入侵微生物或毒性成分，介導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫[3]。血吸蟲(chóng)尾蚴突破皮膚屏障后就受到宿主免疫應(yīng)答的攻擊，補(bǔ)體反應(yīng)是宿主最早開(kāi)始?xì)x(chóng)體的免疫應(yīng)答[4]。血吸蟲(chóng)在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中積累了應(yīng)對(duì)宿主補(bǔ)體系統(tǒng)的適應(yīng)性，對(duì)補(bǔ)體反應(yīng)的調(diào)節(jié)是其免疫逃避策略的重要組成部分[5]。血吸蟲(chóng)在尾蚴階段對(duì)血清補(bǔ)體是非常敏感的，但在尾蚴轉(zhuǎn)變?yōu)橥x(chóng)2～4 h后對(duì)血清補(bǔ)體殺傷的敏感性就開(kāi)始逐漸下降，這表明血吸蟲(chóng)在感染初期就對(duì)宿主補(bǔ)體反應(yīng)有調(diào)節(jié)作用，這種轉(zhuǎn)變可能和血吸蟲(chóng)膜結(jié)構(gòu)變化及體被膜上的分子有關(guān)[6]。

C1q是補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑的重要識(shí)別分子，能夠啟動(dòng)經(jīng)典途徑，并且在天然免疫和特異性免疫之間發(fā)揮重要的連接作用[7]。C1q結(jié)合蛋白（Clg binding protein C1qBP）能夠與C1q結(jié)合，抑制補(bǔ)體激活途徑。我們檢索了日本血吸蟲(chóng)基因組和轉(zhuǎn)錄組資料，并進(jìn)行功能區(qū)和基因功能分析，發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲(chóng)具有C1qBP蛋白（SjC1qBP）。本研究應(yīng)用RTPCR克隆得到SjC1qBP編碼基因，在大腸桿菌中表達(dá)制備重組融合蛋白，評(píng)估重組蛋白在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中誘導(dǎo)的免疫保護(hù)，同時(shí)采用補(bǔ)體溶血試驗(yàn)驗(yàn)證該重組蛋白的C1q結(jié)合作用。

1　材料和方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株尾蚴由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供；質(zhì)粒pMD19-T購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；宿主菌DH5α、BL21（DE3）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；表達(dá)質(zhì)粒pET-32a（+）由上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物血吸蟲(chóng)病研究室保存；雄性新西蘭白兔（3.5 kg）購(gòu)自羅涇飛達(dá)上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心；雄性BALB/c小鼠（6周齡）購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；綿羊紅細(xì)胞（EA，2×108個(gè)/mL）購(gòu)自上海榕柏生物技術(shù)有限公司。

1.2主要試劑Trizol Reagent、M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；Ex Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I、Xho I、T4 DNA 連接酶、DNA-T-Tailing 等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；DNA Marker （DL2000）、DNA Marker （DL5000）、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、IPTG、DAB顯色試劑盒等購(gòu)自上海天根生物科技有限公司；羊抗小鼠IgG-HRP購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；A型DNA快速純化試劑盒、B型質(zhì)粒小量快速提取試劑盒等購(gòu)自北京博大泰恒生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Axyprep DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；Ni-NTA HisBind Resin（Merck-Novagen）購(gòu)自中科新生命生物科技有限公司。

1.3RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄取出保存在液氮中的42 d日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體，按Trizol試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行總RNA提取及純化，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，產(chǎn)物保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4日本血吸蟲(chóng)C1qBP基因的克隆以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中日本血吸蟲(chóng)（SeqID：FN315565）的序列作為參考設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物：5′-CGCGAATTCTTA CGGCGTGAAATGTCT-3′含EcoR I酶切位點(diǎn)；下游引物：5′-GCGCTCGAGCAGTCTTTAAGGATTGTG CA-3′含Xho I酶切位點(diǎn)。以1.3中所得產(chǎn)物為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸15 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。純化回收后，將回收產(chǎn)物與載體pMD19-T連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，挑選單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)10 h后以菌液為模板，進(jìn)行PCR鑒定，選擇陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒后由上海華津生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.5日本血吸蟲(chóng)SjC1qBP基因的生物信息學(xué)分析利用DNAStar分析軟件查找日本血吸蟲(chóng)SjC1qBP基因的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），并對(duì)氨基酸殘基數(shù)目、組成、編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等參數(shù)進(jìn)行分析；將SjC1qBP基因測(cè)序結(jié)果用DNAStar、BLAST等進(jìn)行同源性分析；利用TMHMM分析軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/ T MHMM/）預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SignalP軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）作信號(hào)肽分析；利用Protscale軟件分析其疏水性；利用GOR IV軟件分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)（http://npsa-pbil.ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）。

1.6重組蛋白rSjC1qBP的表達(dá)與純化將1.4中測(cè)序正確的重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I、Xho I進(jìn)行雙酶切，純化回收目的片段亞克隆于pET-32a（+）載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a（+）-SjC1qBP，對(duì)其進(jìn)行菌液PCR鑒定及序列測(cè)定。將含測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒的5 mL菌液接種于500 mL含100 μg/mL 氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min震蕩培養(yǎng)，至細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期（OD600≈0.6），加入終濃度為1 mmol/ L的IPGT誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，觀察最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間和表達(dá)形式。采用His·resin Bind樹(shù)脂柱層析方法純化目的蛋白，純化后的重組蛋白裝在透析帶中，依次在6、5、4、3、2、1 mol/L尿素及PBS溶液中透析復(fù)性，收集復(fù)性后的重組蛋白，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7重組蛋白rSjC1qBP的抗原性分析將純化復(fù)性的重組蛋白rSjC1qBP進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并將重組蛋白rSjC1qBP電轉(zhuǎn)移至NC膜上；以rSjC1qBP三免血清（1:200稀釋）為一抗4℃孵育過(guò)夜，同時(shí)以小鼠陰性血清和pET-32a(+)空載體標(biāo)簽蛋白免疫小鼠血清作對(duì)照；以羊抗鼠IgG-HRP（1:2500稀釋）為二抗孵育1.5 h，最后使用DAB顯色，進(jìn)行抗原性分析。

1.8動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)將純化的重組蛋白rSjC1qBP結(jié)合ISA206佐劑免疫 BALB/c小鼠，每隔2周加強(qiáng)免疫，共免疫3次；對(duì)照組注射PBS或ISA206。3免后第2周，采用腹部貼片方法感染小鼠（40±2）條日本血吸蟲(chóng)尾蚴。感染后d42剖殺小鼠，采用肝門靜脈沖洗法收集蟲(chóng)體，按以下公式計(jì)算減蟲(chóng)率：減蟲(chóng)率＝（對(duì)照組平均蟲(chóng)荷數(shù)－試驗(yàn)組平均蟲(chóng)荷數(shù)）/對(duì)照組平均蟲(chóng)荷數(shù)。同時(shí)收集每只小鼠的肝臟稱重，消化后蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)，并計(jì)算肝臟減卵率：減卵率＝（對(duì)照組平均蟲(chóng)卵數(shù)－試驗(yàn)組平均蟲(chóng)卵數(shù)）/對(duì)照組平均蟲(chóng)卵數(shù)。

1.9ELISA檢測(cè)特異性抗體水平動(dòng)物免疫過(guò)程中每次免疫7 d后采集小鼠的血清，通過(guò)間接ELISA法測(cè)定其特異性IgG抗體水平。以重組蛋白rSjC1qBP（10 μg/mL）為抗原，4℃包被過(guò)夜；PBST洗滌3次，加入1.5%BSA（150 μL/孔），37℃封閉1 h；將各組待檢血清1:100稀釋為一抗，每份血清重復(fù)3孔，37℃孵育1 h；洗滌3次后以羊抗鼠IgG-HRP（1:2500稀釋）為二抗孵育1 h，最后用可溶型TMB避光顯色，室溫作用后使用2 mol/L硫酸終止反應(yīng)（50 μL/孔），在450 nm波長(zhǎng)處讀取每孔的OD值。

1.10綿羊紅細(xì)胞溶血抑制試驗(yàn)將重組蛋白rSjC1qBP、pET-32a標(biāo)簽蛋白和BSA各20 μg，用100 μL正常豚鼠血清37℃孵育30 min，加入50 μL抗體致敏的綿羊紅細(xì)胞（EA，2×108個(gè)/mL），均勻混合后在37℃下水浴30 min并進(jìn)行離心（500×g，1 min），各組溶血程度（釋放的血紅蛋白）由上清液的OD412值來(lái)確定。

2　結(jié)果

2.1日本血吸蟲(chóng)SjC1qBP的克隆根據(jù)日本血吸蟲(chóng)C1qBP基因的參考序列（FN315565）設(shè)計(jì)引物，以日本血吸蟲(chóng)42 d成蟲(chóng)cDNA為模板，PCR擴(kuò)增到大小為729 bp的DNA片段（圖 1），與預(yù)期目的片段大小相符，測(cè)序結(jié)果顯示與參考序列相比，存在 2個(gè)堿基變異面，編碼氨基酸序列與參考順序編碼的一致。

圖1　SjClqBP基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 1　PCR product of SjC1qBP gene

2.2日本血吸蟲(chóng)SjC1qBP生物信息學(xué)分析對(duì)克隆

獲得的SjC1qBP基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，SjC1qBP含729個(gè)核苷酸，編碼242個(gè)氨基酸，理論分子量為27.58 kDa，理論等電點(diǎn)為4.728；利用TMHMM、SignalP等軟件分析編碼多肽，結(jié)果顯示SjC1qBP沒(méi)有跨膜區(qū)和信號(hào)肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主；氨基酸序列同源性分析表明，SjC1qBP與Schistosoma haematobium C1qBP（ShC1qBP，XP_012800748.1）、Lepeophtheirus salmonis C1qBP（LsC1qBP，ACO12436.1）、 Echinococcus granulosus C1qBP（EgC1qBP，EUB56334.1）和Schistosoma mansoni C1qBP（SmC1qBP，CCD59219.1）的氨基酸都有較高的相似性；SMART軟件分析該蛋白氨基酸序列結(jié)果顯示其屬于Ffam家族蛋白含有MAM33結(jié)構(gòu)域，具有補(bǔ)體蛋白C1q結(jié)合位點(diǎn)。

2.3重組蛋白rSjC1qBP的表達(dá)與純化將構(gòu)建正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a（+）-SjC1qBP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示在50 kDa處可見(jiàn)特異的重組蛋白分子，并且誘導(dǎo)時(shí)間與該蛋白的表達(dá)量呈正比，誘導(dǎo)5 h后表達(dá)量較高?；厥站w蛋白進(jìn)行溶解試驗(yàn)，結(jié)果表明重組蛋白以包涵體形式存在，但可溶解于8 mol/L尿素溶液中。在變性條件下經(jīng)過(guò)Ni-NTA His·resin Bind樹(shù)脂純化后，可以獲得較純的重組蛋白（圖2）。將純化的重組蛋白用含不同濃度梯度尿素/PBS溶液透析復(fù)性，重組蛋白rSjC1qBP能夠復(fù)性，最終的純化產(chǎn)量約為5 mg/L。

圖2　重組蛋白rSjC1qBP的純化Fig. 2　Purifi cation of recombinant protein rSjC1qBP

2.4重組蛋白rSjC1qBP的抗原性分析以復(fù)性的重組蛋白rSjC1qBP為抗原，分別以BALB/c小鼠的陰性血清（A）、重組蛋白rSjC1qBP免疫BALB/c小鼠的三免血清（B）、pET-32a（+）空載體標(biāo)簽蛋白免疫BALB/c小鼠的三免血清（C）為一抗進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示該重組蛋白能被免疫血清識(shí)別，表明重組蛋白rSjC1qBP具有較好的免疫原性（圖3）。

圖3　重組蛋白rSjC1qBP的免疫原性分析Fig. 3　Western blot analysis of the antigenicity of rSjC1qBP

2.5重組蛋白rSjC1qBP的免疫保護(hù)效果評(píng)估動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，重組蛋白rSjC1qBP誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生了顯著的免疫保護(hù)效果。與ISA206佐劑組相比，重組蛋白rSjC1qBP誘導(dǎo)產(chǎn)生了36.08%的減蟲(chóng)率（P＜0.05）以及43.45%的減卵率（P＜0.01）（表1）。間接ELISA方法檢測(cè)各組小鼠免疫前后特異性抗體IgG水平，結(jié)果表明首次免疫重組蛋白rSjC1qBP后小鼠體內(nèi)特異性IgG抗體水平即顯著升高，第二次免疫后快速升高，第三次免疫后抗體達(dá)到最高水平，至感染6周后剖殺，抗體仍維持在較高水平。而佐劑對(duì)照組小鼠體內(nèi)的IgG抗體始終維持在較低的水平（圖4）。

表1　rSjC1qBP免疫保護(hù)效果評(píng)估Table 1　Evaluation of the protective effi cacy induced by rSjC1qBP

圖4　重組蛋白rSjC1qBP誘導(dǎo)的小鼠抗rSjC1qBP特異性抗體水平(***P＜0.01)Fig. 4　Kinetics of specifi c anti-rSjC1qBP IgG induced with rSjC1qBP in mice(***P＜0.01)

2.6重組蛋白rSjC1qBP的補(bǔ)體結(jié)合活性分析以牛血清白蛋白作為對(duì)照，重組蛋白對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的綿羊紅細(xì)胞溶血抑制效果見(jiàn)圖5。牛血清白蛋白不能抑制補(bǔ)體溶血，而重組蛋白rSjC1qBP能夠抑制補(bǔ)體溶血，溶血抑制率達(dá)30%以上。

圖5　重組蛋白rSjC1qBP溶血試驗(yàn)Fig. 5　Hemolytic assays of recombinant protein rSjC1qBP

3　討論

我國(guó)是日本血吸蟲(chóng)病流行較嚴(yán)重的國(guó)家，至2013年仍有血吸蟲(chóng)病人18萬(wàn)，釘螺滋生面積365 468.00 hm2，疫區(qū)病牛的推測(cè)感染率約為0.12%[8]?；瘜W(xué)藥物吡喹酮在疫情控制與治療中依然占有關(guān)鍵地位，但是吡喹酮治療不能解決重復(fù)感染的問(wèn)題。由于該藥的使用已經(jīng)有30多年的歷史，對(duì)其產(chǎn)生抗藥性的擔(dān)憂是存在的[9]。血吸蟲(chóng)免疫預(yù)防疫苗是預(yù)防技術(shù)的發(fā)展方向之一[10,11]，但目前研究進(jìn)展相當(dāng)緩慢[12]。許多寄生蟲(chóng)學(xué)者認(rèn)為血吸蟲(chóng)免疫逃避是非常值得重視的現(xiàn)象。免疫逃避不僅是血吸蟲(chóng)預(yù)防疫苗研究的阻礙，更是寄生蟲(chóng)與宿主相互作用的重要組成部分，因此，研究血吸蟲(chóng)免疫逃避現(xiàn)象及其機(jī)制具有重要意義[13-15]。

補(bǔ)體系統(tǒng)是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。補(bǔ)體反應(yīng)是非常迅速、級(jí)聯(lián)放大的免疫防御機(jī)制，是宿主殺傷血液內(nèi)寄生蟲(chóng)的重要途徑[4]，研究表明補(bǔ)體反應(yīng)是宿主殺傷克氏錐蟲(chóng)的重要效應(yīng)機(jī)制[16]。早期免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明補(bǔ)體結(jié)合蛋白質(zhì)存在于血吸蟲(chóng)的表面[17]，至今已發(fā)現(xiàn)多個(gè)血吸蟲(chóng)分子可能和調(diào)節(jié)宿主補(bǔ)體反應(yīng)相關(guān)，作用于補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的多個(gè)節(jié)點(diǎn)[5]。其中血吸蟲(chóng)副肌球蛋白（paramyosin）調(diào)節(jié)補(bǔ)體反應(yīng)的機(jī)制已有較詳細(xì)的研究報(bào)道[14]。

血吸蟲(chóng)在宿主的血管系統(tǒng)中，C2BP、C3BP、C8BP、C9BP（C2-binding protein，C3-binding protein, and C8-binding protein, C9-binding protein）已經(jīng)被研究發(fā)現(xiàn)存在于血吸蟲(chóng)體表。有研究表明血吸蟲(chóng)可通過(guò)與補(bǔ)體C1q結(jié)合和抑制膜攻擊復(fù)合物形成等途徑來(lái)調(diào)節(jié)宿主補(bǔ)體反應(yīng)[18,19]。Liu等[20]在日本血吸蟲(chóng)蛋白質(zhì)組研究中發(fā)現(xiàn)SjC1qBP分子與C1q結(jié)合蛋白相似。本實(shí)驗(yàn)室前期在日本血吸蟲(chóng)體被表膜蛋白質(zhì)組中也鑒定到SjC1qBP分子，據(jù)此擴(kuò)增編碼SjC1qBP的基因序列，分析結(jié)果表明該序列與參考序列（FN315565）有2個(gè)堿基差異，但編碼氨基酸序列一致，而且含有MAM33結(jié)構(gòu)域?qū)儆赑fam家族蛋白，具有補(bǔ)體蛋白C1q結(jié)合位點(diǎn)，因此推測(cè)其具有結(jié)合補(bǔ)體C1q并影響經(jīng)典補(bǔ)體途徑的能力。

本研究將SjC1qBP基因在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)，結(jié)果能純化到復(fù)性的重組蛋白，而且具有較好的抗原性。在免疫保護(hù)效果評(píng)估試驗(yàn)中，重組蛋白rSjC1qBP誘導(dǎo)了較高的的減蟲(chóng)率及肝臟減卵率，同時(shí)ELISA結(jié)果表明重組蛋白rSjC1qBP能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性IgG抗體，這些研究結(jié)果表明SjC1qBP是一種有潛力的抗血吸蟲(chóng)疫苗候選分子。在綿羊紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)中，與對(duì)照的載體蛋白和BSA相比，該重組蛋白能抑制補(bǔ)體溶血。結(jié)果表明SjC1qBP可能通過(guò)結(jié)合C1q而抑制經(jīng)典途徑的補(bǔ)體溶血效應(yīng)。因此我們推測(cè)SjC1qBP在血吸蟲(chóng)中可能也通過(guò)結(jié)合補(bǔ)體成分C1q而影響宿主的補(bǔ)體殺傷效應(yīng)，從而發(fā)揮免疫逃避作用。對(duì) C1qBP 基因功能的深入研究，有助于解釋血吸蟲(chóng)免疫逃避現(xiàn)象，對(duì)揭示蟲(chóng)體與宿主之間相互作用具有重要理論意義。

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CLONING AND EXPRESSION OF C1Q BINDING PROTEIN GENE OF SCHISTOSOMA JAPONICUM AND ASSESSMENT OF ITS IMMUNE PROTECTION

JIA Bing-guang1, HONG Yang1, HAN Qian1, LV Chao1, WANG Tao1, CHAI Shu-mei1, CAO Xiao-dan1, LU Ke1, ZAI Jin-li1, MA Shuai1, LIN Jiao-jiao1,2, FU Zhi-qiang1

(1. Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

The C1qBP gene of S.japonicum (SjC1qBP) was cloned, expressed and characterized in the present study. The open reading frame (ORF) of SjC1qBP consisting of 729 bp encoding 242 amino acids was successfully expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The Ni-NTA purifi cation system was applied to purify the recombinant protein and a 50 kDa purifi ed protein was obtained. Immunization with the purifi ed rSjC1qBP emulsifi ed ISA206 adjuvant induced a higher level of specifi c IgG and signifi cant reductions in worms burden (36.08%) and liver eggs number (43.45%). Hemolytic testing indicated that rSjC1qBP inhibited the process of complement hemolysis. These fi ndings suggested that SjC1qBP might be a potential vaccine candidate against S. japonicum and laid a path for further research on its biological function.

Schistosoma japonicum; C1q binding protein gene; complement; recombinant protein

S852.735

A

1674-6422（2016）03-0066-06

2016-03-15

國(guó)家自然科學(xué)基金（31472188）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2015BAI09B04）；上海市領(lǐng)軍人才后備隊(duì)計(jì)劃（201442）

賈秉光，男，碩士研究生，獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

傅志強(qiáng)，E-mail：fuzhiqiang@shvri.ac.cn