弓形蟲卵囊壁蛋白OWP1的重組表達和特異性單克隆抗體制備

白　宇，李培德，胡景炎，何　杰，陳歡利，吳春琴，金俊杰

（溫州科技職業(yè)學(xué)院，溫州 325006）

弓形蟲卵囊壁蛋白OWP1的重組表達和特異性單克隆抗體制備

白宇，李培德，胡景炎，何杰，陳歡利，吳春琴，金俊杰

（溫州科技職業(yè)學(xué)院，溫州 325006）

為研究制備弓形蟲卵囊壁蛋白和特異性單克隆抗體，以弓形蟲弱毒株ME49株DNA為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴增卵囊壁蛋白OWP1基因，將其克隆至原核表達載體構(gòu)建重組表達質(zhì)粒 pET-28a-OWP1，經(jīng)過IPTG 誘導(dǎo)表達和His純化樹脂純化重組蛋白His-OWP1。重組蛋白His-OWP1作為免疫原，免疫7周齡雌性BALB/c小鼠，重組蛋白GST-OWP1作為檢測篩選抗原，應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備弓形蟲卵囊壁蛋白OWP1的單克隆抗體。結(jié)果表明，獲得2株穩(wěn)定分泌抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株（4A2和2C10）。Western blot結(jié)果表明研究制備的單克隆抗體能夠識別重組表達蛋白。制備獲得的2株穩(wěn)定性好、效價高的單克隆抗體，可為今后研究特異敏感的弓形蟲病血清學(xué)檢測方法提供材料。

弓形蟲；卵囊壁蛋白1；重組表達；單克隆抗體

弓形蟲?。═oxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）引起的一種呈世界性分布的人畜共患寄生蟲病。弓形蟲屬頂端復(fù)合物亞門、孢子蟲綱、真球蟲目的細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲。在其生活史中總共分為滋養(yǎng)體、包囊、裂殖體、配子體和卵囊5種形態(tài)，在終宿主（貓與貓科動物）體內(nèi)，上述5種形態(tài)俱存[1]。人類弓形蟲感染率極高，全球有20%～50%的人感染弓形蟲[2]。我國平均弓形蟲陽性率為7.88%，部分地區(qū)有逐漸升高的趨勢[3]。弓形蟲對于免疫抑制或免疫功能低下人群可引起嚴(yán)重的疾病。此外，弓形蟲可引起孕婦流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和畸胎等[4,5]。在動物方面，人、畜、禽和魚類等其他動物為其中間宿主[6,7]，貓科動物為其終末宿主，貓吃了含有弓形蟲包囊的動物組織和發(fā)育成熟的卵囊后，進入貓的消化道，侵入腸上皮細(xì)胞，通過裂殖體生出大量的裂殖子，部分裂殖子進行配子生殖轉(zhuǎn)化為配子體及大小配子，最后形成卵囊。卵囊會隨貓的糞便排到體外，在外界適宜環(huán)境中，經(jīng)過孢子增殖發(fā)育為含有兩個孢子囊的感染性卵囊。污染水源與食物等外界環(huán)境，引起人和動物弓形蟲感染[8]。動物是弓形蟲病流行的主要傳播者，尤其是與人類關(guān)系緊密接觸的貓在弓形蟲病的傳播過程中起著非常重要的作用，充分了解貓的弓形蟲發(fā)病及其感染情況具有重要的現(xiàn)實意義。

目前，弓形蟲病的診斷方法主要有病原學(xué)檢查（鏡檢觀察），免疫學(xué)檢查（ELISA與間接血凝等[9]）與分子生物學(xué)（PCR等[10]）等方法；而針對于弓形蟲卵囊的診斷方法只有病原學(xué)與分子生物學(xué)檢查方法，鏡檢觀察對于少量感染蟲體的病料較難觀察，容易漏檢；PCR等生物學(xué)方法首先要純化并破碎卵囊，由于卵囊壁很厚，不易破碎而難于提取出蟲體DNA，所以臨床上會出現(xiàn)漏檢，同時DNA容易被污染而出現(xiàn)假陽性等現(xiàn)象，并且操作過程較復(fù)雜，儀器要求高[11,12]。因此，建立一種簡便、快速、敏感、特異的弓形蟲卵囊感染的實時監(jiān)測方法非常必要。

本研究擬從檢測弓形蟲卵囊感染的角度，通過重組表達卵囊壁蛋白OWP1，制備特異性單克隆抗體，對單抗進行一系列特征化鑒定，建立檢測感染性卵囊的Western blot檢測方法。研究制備的重組卵囊壁蛋白和特異性抗體，可為進一步建立間接免疫熒光檢測（indirect immunofluorescence assay，IFA）等血清學(xué)診斷技術(shù)提供基礎(chǔ)，進而可以監(jiān)測感染樣品中弓形蟲卵囊的存在和數(shù)量，方便臨床檢測貓及其他污染物的弓形蟲卵囊感染情況。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1蟲體核酸、實驗動物、載體和細(xì)胞株弓形蟲弱毒株ME49蟲體DNA由本實驗室制備保存；7周齡雌性 BALB/c 小鼠購自溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；pET-28a載體、GST-OWP1重組蛋白和SP2/0細(xì)胞由本實驗室保存。

1.1.2主要試劑PCR反應(yīng)試劑、DNA Marker（DL2000、DLl5000）、IPTG、蛋白質(zhì)Marker、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶（EcoRΙ，XhoΙ）購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞和表達宿主菌BL21（DE3）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；His-Affinity Agarose beads樹脂和GST Agarose beads樹脂購自上海悅克生物科技有限公司；DMEM 和胎牛血清購自Gibco公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；弗氏完全佐劑（FCA）和弗氏不完全佐劑（FICA）、PEG1450、HT和HAT均購自Sigma公司；TMB底物顯色液購自Solarbio 公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計根據(jù)GenBank中登錄的基因序列（序列號：XM_002367673），利用Oligo6.0軟件設(shè)計1對引物。引物上游引入EcoRΙ酶切位點，下游引入XhoΙ酶切位點，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。OWP1-F：5′-TT GAA TTC AAC CCT GGA GTG CCT CCT GTG-3′ OWP1-R：5′-AA CTC GAG CTA GAG CTT CTT TTT GCC GTT-3′。

1.2.2PCR擴增目的基因和構(gòu)建重組表達載體以弓形蟲弱毒株ME49 DNA為模板，常規(guī)PCR擴增OWP1基因，目的基因定向克隆至原核表達載體pET-28a中，利用EcoRΙ和XhoΙ雙酶切鑒定。

1.2.3重組蛋白的誘導(dǎo)表達、純化和SDS-PAGE分析將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-28a-OWP1轉(zhuǎn)化宿主菌BL21（DE3），37℃震蕩培養(yǎng)過夜；接種新的培養(yǎng)基后，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，37℃震蕩5 h進行誘導(dǎo)表達，收集菌體沉淀經(jīng)超聲破碎菌體，離心后分別取上清液和沉淀，SDS-PAGE檢測重組蛋白OWP1的表達情況。采用His-Agarose beads樹脂純化OWP1蛋白，純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳分析鑒定純化產(chǎn)物。

1.2.4重組蛋白Western blot檢測將SDS-PAGE凝膠電泳蛋白條帶轉(zhuǎn)印到 N C 膜上，用PBST（含0.05% Tween-20）洗膜3次，每次5 min；加入 5% 脫脂奶粉封閉后加入His-tag 單克隆抗體（按照1:3000 比例稀釋），室溫孵育 1 h；PBST洗膜3次，每次5 min，加入 1:5000比例稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體，室溫孵育1 h；洗滌后置DAB顯色液中顯色，待條帶清晰后迅速用ddH2O終止顯色。

1.2.5動物免疫與細(xì)胞融合按照常規(guī)免疫方案對7周齡雌性BALB/c小鼠進行免疫。首次免疫按每只小鼠100 μg劑量的抗原與等體積FCA乳化，頸背部皮下多點注射。間隔20 d，將FCA換成FICA，以劑量減半的方法進行二免及免疫推進。細(xì)胞融合前3 d進行加強免疫，取不加佐劑的100 μg劑量抗原經(jīng)腹腔注射。常規(guī)方法進行細(xì)胞融合，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按細(xì)胞個數(shù)4:1混合，1000×g 離心10 min；將沉淀細(xì)胞塊輕彈成糊狀，37℃水浴3 min；將預(yù)熱的50% PEG融合劑在1 min內(nèi)輕輕滴入，37℃靜置90 s；緩慢滴入預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)液并補加至30 mL，以終止融合劑的融合作用，1000×g離心7 min；用HAT選擇培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，分別接種于預(yù)先鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（100 μL/孔），置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約7～10 d，更換HT培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6建立間接ELISA檢測方法及陽性雜交瘤篩選亞克隆采用方陣滴定法建立間接ELISA抗體檢測方法，檢測和篩選陽性克隆細(xì)胞孔。檢測抗原為GSTOWP1蛋白（200 μg/mL）進行400倍稀釋后包被酶標(biāo)板，以待檢的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為一抗，SP2/0細(xì)胞上清和1:200稀釋的免疫小鼠多抗血清分別作為陰陽性對照，ELISA反應(yīng)讀取OD450值，以P/ N≥2.1判定為陽性，以P/N≥2.1的最大稀釋度作為抗體效價。待融合細(xì)胞生長至覆蓋孔底10%～20%時，采用有限稀釋法，進行3次細(xì)胞亞克隆純化，克隆篩選獲得穩(wěn)定分泌抗OWP1的單克隆抗體細(xì)胞株。

1.2.7制備單抗腹水與Western blot檢測應(yīng)用單抗腹水按照常規(guī)方案制備，選擇10周齡雌性BALB/c小鼠每只腹腔注射0.5 mL FICA處理，1周后每只小鼠腹腔注射0.5 mL細(xì)胞懸液，約含5×105～10×105個細(xì)胞。接種后10 d左右，待小鼠腹腔明顯膨大，無菌采集腹水，離心分裝，-40℃低溫保存?zhèn)溆?。His-OWP1和GST-OWP1重組蛋白SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印NC 膜，分別以2株單抗腹水作為一抗，HRP-羊抗鼠IgG作為二抗進行Western blot鑒定。

2　結(jié)果

2.1卵囊壁蛋白OWP1基因擴增與重組表達載體pET-28a-OWP1酶切鑒定OWP1基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，獲得大小1500 bp目的片段（圖1）。重組表達載體 pET28a-OWP1經(jīng)EcoRΙ和XhoΙ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳顯示兩條大小約為5369 bp和1500 bp，與預(yù)期大小一致，見圖2。

圖1　弱毒株ME49株OWP1基因PCR擴增Fig. 1　PCR-amplifi ed OWP1 gene from ME49 strain

圖2　重組表達載體pET28a -OWP1的酶切鑒定Fig. 2　Identifi cation of recombinant pET28a -OWP1 by restriction enzyme digestion

2.2重組蛋白His-OWP1純化分析和Western blot檢測通過His純化樹脂對目的蛋白進行純化，取樣經(jīng)過SDS-PAGE電泳分析，得到單一條帶，說明成功獲得純化蛋白，見圖3。利用His單抗Western blot檢測His-OWP1重組蛋白，在56 kDa處出現(xiàn)一條清晰的反應(yīng)條帶（圖4），說明重組蛋白在大腸桿菌中得到正確表達，并且具有反應(yīng)原性。

圖3　OWP1重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 3　Analysis of the recombinant OWP1 protein by SDS-PAGE

圖4　利用His單抗對OWP1重組蛋白的Western blot檢測Fig. 4　Western blot analysis of the recombinant OWP1 protein using anti-His-tag mAb

2.3雜交瘤細(xì)胞株的篩選經(jīng)4次免疫后，選擇免疫效果優(yōu)秀小鼠（血清1萬倍稀釋后ELISA檢測OD450≥1.0），腹腔加強免疫3 d后進行細(xì)胞融合，經(jīng)過3次亞克隆篩選，獲得2株能穩(wěn)定分泌抗OWP1單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為4A2和2C10。

2.4單克隆抗體效價檢測將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和單抗腹水分別稀釋3200倍和20萬倍，ELISA測定顯示OD450均大于0.4（陰性對照OD450≤0.15），因此可認(rèn)定細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水抗體效價分別達到3200和20萬倍以上。結(jié)果見表1。

表1　雜交瘤細(xì)胞上清和腹水單抗效價的測定Table 1　Determination results of OWP1 mAb titer of cell supernatant and ascetics fl uid by ELISA

2.5單抗腹水Western blot檢測重組蛋白OWP1純化的重組蛋白His-OWP1和GST-OWP1 經(jīng)SDS-PAGE電泳并且轉(zhuǎn)膜后，分別以2株單抗腹水作為一抗，HRP-羊抗鼠IgG為二抗進行Western blot，均可見明顯反應(yīng)帶，說明2株細(xì)胞株分泌抗體均能與重組OWP1蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，結(jié)果見圖5。

圖5　利用4A2和2C10對OWP1重組蛋白的Western blot檢測Fig. 5　Western blot analysis of recombinant protein OWP1 using 4A2 and 2C10

3　討論

通過GenBank數(shù)據(jù)庫查找到弓形蟲卵囊相應(yīng)的目標(biāo)蛋白序列，進行卵囊壁蛋白OWP1體外重組表達，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定得到純化的重組蛋白，之后免疫實驗動物制備了單克隆抗體。經(jīng)雜交瘤細(xì)胞株篩選、單抗效價測定以及Western blot檢測，最終獲得了特異性強、敏感性高的兩株單克隆抗體。Western blot檢測結(jié)果顯示，兩株單抗反應(yīng)的條帶都是單一的，并且抗體效價也非常高。

本研究選取了卵囊壁蛋白OWP1，此蛋白為弓形蟲幾種卵囊壁蛋白中表達量很高的蛋白，表達后分泌在卵囊的表面，利用OWP1單抗可以敏感、特異的識別該蛋白，從而為我們進一步建立檢測卵囊的IFA診斷技術(shù)奠定基礎(chǔ)。IFA技術(shù)不僅操作簡單，便于觀察，而且還可以通過熒光點來定量病料中卵囊的數(shù)量，從而為臨床診斷和治療提供依據(jù)。

人類及其他動物感染弓形蟲的來源主要有兩個：一是弓形蟲組織包囊，通過攝取未煮熟含包囊的肉類；二是弓形蟲卵囊，通過接觸貓或是攝取被含卵囊的貓糞污染的食物和水而受到感染[12]。卵囊主要隨貓的糞便排出體外，每個卵囊里含有兩個圓形的孢子囊，每個孢子囊內(nèi)含4個長而彎曲的小孢子。貓作為弓形蟲的終末宿主，感染后所排放的卵囊數(shù)量驚人，每次可達幾千萬個甚至上億個，并且持續(xù)排卵達4～8 d。卵囊對外環(huán)境抵抗力強，50℃30min；70℃ 2min；90℃ 30s才能殺滅，在環(huán)境中的感染力可維持1年以上。因此，貓對弓形蟲病的傳播起著至關(guān)重要的作用[1]。近些年來隨著寵物熱的升溫，貓與人類的接觸越來越密切。貓糞便中卵囊檢出率25%～100%[13]。因飼養(yǎng)貓而感染弓形蟲的機率較不飼養(yǎng)貓者高出3～4倍[14]。因此對貓排放弓形蟲卵囊進行有效監(jiān)控顯得尤為重要，通過檢測貓弓形蟲卵囊感染率可為弓形蟲病的預(yù)防和治療提供更多依據(jù)。

弓形蟲在貓腸上皮細(xì)胞內(nèi)進行有性繁殖，之后形成和排放卵囊。由于目前對卵囊不能進行人工培養(yǎng)，只能從貓的糞便中通過純化獲得，因此，針對卵囊壁特異性蛋白成份的研究很少[15]。有研究認(rèn)為微腺體蛋白4（MIC4）與卵囊壁的形成有關(guān)[16]，而更多卵囊蛋白功能的挖掘還有待進一步研究，尋找更特異敏感的卵囊壁蛋白將是我們進一步的研究方向。

在后續(xù)研究中，我們將應(yīng)用這2株特異性單克隆抗體，建立一種檢測弓形蟲卵囊的IFA免疫學(xué)檢測技術(shù)，從而能簡便、快速、敏感、特異的檢測到弓形蟲卵囊的存在和數(shù)量，進而克服以往病原學(xué)檢測難和PCR檢測步驟繁瑣且特異性差的缺點，方便臨床檢測貓及其他污染物中弓形蟲卵囊感染情況，同時還可以對水及水源飲料、食物進行檢測。此外，我們將探索能否應(yīng)用單抗作為抗體藥物，阻斷弓形蟲的繁殖與傳播，從而為弓形蟲病的預(yù)防和治療提供更多依據(jù)。

[1] 于恩庶. 中國弓形蟲病[M]. 香港: 亞洲醫(yī)藥出版社. 2000, 31-57.

[2] Jones J L, Dubey J P. Foodborne toxoplasmosis[J]. Clin Infect Dis, 2012, 55(6): 845-851.

[3] Xiao Y, Yin J, Jiang N, et al. Seroepidemiology of human Toxoplasma gondii infection in China[J]. BMC Infect Dis, 2010, 10: 4.

[4] Lanjewar D N, Surve K V, Maheshwari M B, et al. Toxoplasmosis of the central nervous system in the acquired immunodeficiency syndrome[J]. Indian J Pathol Microbiol, 1998, 41(2): 147-151.

[5] Luft B J, Remington J S. Toxoplasmic encephalitis in AIDS[J]. Clin Infect Dis, 1992, 15(2): 211-222.

[6] Montoya J G, Liesenfeld O. Toxoplasmosis[J]. Lancet, 2004, 363(9425): 1965-1976.

[7] Zhang M, Yang Z, Wang S, et al. Detection of Toxoplasma gondii in shellfish and fish in parts of China[J]. Vet Parasitol, 2014, 200(1-2): 85-89.

[8] 路燕. 動物寄生蟲病防治[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2012: 229-232.

[9] 鄭世英，鄭芳，李士平, 等. 山東省部分地區(qū)犬貓弓形蟲病流行情況調(diào)查[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2015, 51(3): 74-75.

[10] Kourenti C and Karanis P. Evaluation and applicability of a purification method coupled with nested PCR for the detection of Toxoplasma oocysts in water [J]. Lett appl Microbiol, 2006, 43: 475-481.

[11] Herrmann D C, Maksimov A, Pantchev N, et al. Comparison of different commercial DNA extraction kits to detect Toxoplasma gondii oocysts in cat faeces[J]. Berl Munch Tierarztl Wochenschr, 2011, 124(11-12): 497-502.

[12] Dubey J P. Toxoplasma gondii oocyst survival under defined temperatures[J]. J Parasitol, 1998, 84(4): 862-865.

[13] 陳昌源. 家養(yǎng)寵物與人群弓形蟲感染情況的研究[J].中國人獸共患病雜志, 2001, 17(1): 76-77.

[14] 郭永和，劉永春，秦劍. 女性不孕癥與弓形蟲感染關(guān)系的探討[J]. 濟寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2001, 24(1): 62.

[15] Possenti A, Cherchi S, Bertuccini L, et al. Molecular characterisation of novel family of cysteine-rich proteins of Toxoplasma gondii and ultrastructural evidence of oocyst wall localisation[J]. Int J Parasitol, 2010, 40(14): 1639-1649.

[16] Ferguson D J, Brecht S, Soldati D. The microneme protein MIC4, or an MIC4-like protein, is expressed within the macrogamete and associated with oocyst wall formation in Toxoplasma gondii[J]. Int J Parasitol, 2000, 30(11): 1203-1209.

RECOMBINANT EXPRESSION AND PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO OOCYST WALL PROTEIN 1 OF TOXOPLASMA GONDII

B AI Yu, LI Pei-de, HU Jing-yan, HE Jie, CHEN Huan-li, WU Chun-qin, JIN Jun-jie
(Wenzhou Vocational College of Science & Technology, Wenzhou 325006, China)

In order to obtain specifi c monoclonal antibodies against oocyst wall protein 1 (OWP1) of Toxoplasma gondii, the recombinant plasmid pET-28a-OWP1 containing the OWP1 gene was constructed and transformed into BL21 cells. The fusion protein was expressed in BL21 with the induction of IPTG. The recombinant OWP1 protein was purifi ed and emulsifi ed in Freund's adjuvant for immunization of BALB/c mice. The monoclonal antibodies (mAbs) were prepared by fusing mouse myloma cells (SP2/0) with the spleen cells from immunized BALB/c mice. Two hybridoma cell lines secreting mAbs were identifi ed by screening in indirect ELISA and designated as 4A2 and 2C10, respectively. Both mAbs specifi cally reacted in Western blot with recombinant OWP1 of Toxoplasma gondii. The future research will examine if these Mabs can be used for development of diagnostic methods for Toxoplasmosis and investigation into the pathogenecity of Toxoplasma gondii.

Toxoplasma gondii; ocyst wall protein 1(owp1); recombinant expression; monoclonal antibody

S852.723

A

1674-6422（2016）03-0060-06

2016-02-29

溫州市公益性技術(shù)研究項目（N20150027）；浙江省公益性技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項目（2014C32046）

白宇，男，博士，助理研究員，主要從事弓形蟲病研究

金俊杰，E-mail：jjjaabbaann@163.com