新疆伊犁哈薩克自治州蜱及牛羊蜱傳病分子流行病學調(diào)查

陳秋語，羅　金，陳　澤，陳榮貴，王海軍，段維春，崔建國，包拉提·烏木爾別克，李　凱，劉小翠，郝嘉瑋，劉光遠

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，蘭州 730046；2. 伊犁州動物疾病控制與診斷中心，伊犁 835000；3. 新源縣畜牧獸醫(yī)站，新源 835800；4. 鞏留縣畜牧獸醫(yī)站，鞏留 835400；5. 察布查爾錫伯自治縣畜牧獸醫(yī)站，察布查爾錫伯 835300；6. 昭蘇畜牧獸醫(yī)站，昭蘇 835600）

新疆伊犁哈薩克自治州蜱及牛羊蜱傳病分子流行病學調(diào)查

陳秋語1，羅金1，陳澤1，陳榮貴2，王海軍3，段維春4，崔建國5，包拉提·烏木爾別克6，李凱1，劉小翠1，郝嘉瑋1，劉光遠1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，蘭州 730046；2. 伊犁州動物疾病控制與診斷中心，伊犁 835000；3. 新源縣畜牧獸醫(yī)站，新源 835800；4. 鞏留縣畜牧獸醫(yī)站，鞏留 835400；5. 察布查爾錫伯自治縣畜牧獸醫(yī)站，察布查爾錫伯 835300；6. 昭蘇畜牧獸醫(yī)站，昭蘇 835600）

為調(diào)查新疆伊犁哈薩克自治州境內(nèi)的蜱及家畜血液樣品中潛在蜱傳病原的流行情況，采集了新源縣、察布查爾錫伯族自治縣、鞏留縣和昭蘇縣的蜱（600只，150只/縣）及血液樣品（牛血1200份，150份/縣/月；羊血1200份，150份/縣/月）。根據(jù)形態(tài)學標準，共鑒定出邊緣革蜱、刻點血蜱、殘緣璃眼蜱、亞洲璃眼蜱及嗜群血蜱5個蜱種。運用PCR方法和序列分析，對采集的蜱、羊血和牛血樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)了泰勒蟲、巴貝斯蟲、牛無漿體、噬吞噬細胞無漿體、邊緣無漿體、羊無漿體、螺旋體和立克次體等多種病原。結(jié)果表明，伊犁州人和動物蜱傳病原在蜱及動物體內(nèi)大量存在，特別是一些人獸共患病原體的陽性率較高，流行普遍，對人和動物的危害嚴重。

蜱；蜱傳病原體；混合感染；流行病學；牛；羊

蜱屬蜱螨亞綱、蜱亞目，是一類重要的體外寄生蟲，以吸食脊椎動物的血液為生[1]。蜱在吸血過程中將大量的病原體傳入人和動物體內(nèi)，可引發(fā)嚴重的疾病和人畜共患病[2,3]。蜱是熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的有害生物和多種病原體的傳播媒介[4-6]。

蜱和蜱傳病原體的分布規(guī)律隨著地區(qū)和時間的變化而改變。迄今為止，已經(jīng)有許多蜱傳疾病在新疆地區(qū)被報道，例如梨形蟲病、無漿體病、Q熱、克里米亞-剛果出血熱（新疆出血熱）、蜱傳腦炎（森林腦炎）、蜱傳回歸熱和萊姆病等[7]。一個蜱種可以攜帶并傳播多種病原體。某些情況下，在相同的自然疫源地可以檢測到多個不同的蜱傳疾病[8]。如果人和動物被攜帶多種病原的蜱所叮咬，很有可能引起致病性更加復(fù)雜、愈后更加嚴重的多發(fā)性疾病。由于當?shù)厣鐣?jīng)濟發(fā)展和自然環(huán)境的改變，新出現(xiàn)的病原體及其協(xié)同感染具有的潛在威脅性會逐漸提高，從而影響人類的身體健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。

新疆伊犁哈薩克自治州位于我國西北邊境地區(qū)，不僅是一個畜牧業(yè)發(fā)達的地區(qū)，還是中國西北部地區(qū)的旅游勝地。其東部地區(qū)有大量的山脈和丘陵，西部地區(qū)為山間平原和河谷。相對較高的濕度和舒適的溫度為蜱的發(fā)育、繁殖提供了理想的環(huán)境，而春季被認為是蜱生長、繁殖的最佳季節(jié)，同時也是蜱傳疾病傳播的高危時期。多年來，該地區(qū)雖有蜱傳病流行的報道，但均為零星記錄，對當?shù)仳绾万鐐鞑∥催M行過全面整體的調(diào)查。為了更好地了解伊犁地區(qū)蜱及蜱傳病原的分布規(guī)律，評估人（包括牧民、獸醫(yī)從業(yè)者和游客）和動物的已有損失及潛在的危害，本研究選取代表性區(qū)域，在蜱和蜱傳病主要流行季節(jié)對該地區(qū)動物群中的蜱類、潛在的病原以及協(xié)同感染等情況進行研究，進而評估該地區(qū)蜱傳疾病可能帶來的公共衛(wèi)生風險。

1　材料和方法

1.1蜱的采集和鑒定采樣地區(qū)位于北緯40°14′16′′至49°10′45′′，東經(jīng)80°9′42′′到91°01′45′′之間，包括了新疆伊犁州4個縣：新源縣、昭蘇縣、鞏留縣和察布查爾錫伯族自治縣（圖1）。在2015年4月、5月期間共采集了600只（150只/縣）饑餓成蜱。根據(jù)形態(tài)學標準，對采集的蜱進行鑒定分類[9]。

1.2血液樣品的采集對上述4個縣的放牧牛羊進行隨機采血（牛1200份，150份/縣/月；羊1200份，150份/縣/月），保存于EDTA-K2抗凝管中。

1.3DNA的提取蜱樣本在500 μL 75%的酒精中渦旋20 s，再置于500 μL的生理鹽水中渦旋20 s，洗凈后轉(zhuǎn)移至干凈的1.5 mL離心管中。將清洗后的樣本置于液氮中大約20 s，用一次性組織研磨杵將其研磨成小塊，加入180 μL的ATL緩沖液將其重懸。按照QIAamp?DNA Mini Kit（QIAGEN）說明書進行操作。

牛羊血液樣品DNA按照DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen, Hilden，Germany）操作說明進行提取。

1.4PCR擴增及DNA序列分析一步法PCR用于檢測立克次氏體[10]、邊緣無漿體[11]和羊無漿體[12]，套式PCR用于檢測巴貝斯蟲[13]、泰勒蟲[14]、牛無漿體[15]、噬吞噬細胞無漿體[15]和螺旋體[16]。針對不同病原體檢測的目標基因、特異性引物和PCR方法詳見表1。擴增體系均為50 μL，其中10×PCR buffer（Mg2+Plus）5μL，dNTP（2.5 mmol/L）4 μL，DNA高保真聚合酶（TaKaRa）4.5 μL，模板DNA 2 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/mL），ddH2O 32.5 μL。將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測序。將測序得到的DNA序列進行匹配，并與NCBI數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)序列進行比較。

表1　標記基因、引物序列、PCR方法及參考文獻Table 1　Target genes, primers sequence, PCR methods used for pathogens identifi cation

2　結(jié)果

2.1蜱的鑒定根據(jù)形態(tài)學特征，對采集到的600只蜱進行鑒定，共發(fā)現(xiàn)了5個蜱種，分別是邊緣革蜱（Dermacentor marginatus，70.00%)，刻點血蜱（Haemaphysalis punctata，19.33%）、殘緣璃眼蜱（Hyalomma detritum，4.67%）、亞洲璃眼蜱（Hyalomma asiaticum，2.67%）及嗜群血蜱（Haemaphysalis concinna，2.00%）。蜱及宿主的詳細信息見表2。

表2　蜱種、采集地區(qū)、宿主以及數(shù)量Table 2　Tick species, collection regions, host species and numbers

2.2蜱和血液樣品中病原體的檢測及鑒定通過PCR擴增，并對獲得的序列進行測序分析后，發(fā)現(xiàn)泰勒蟲（Theileria spp.）、巴貝斯蟲（Babesia spp.）、螺旋體（Borrelia. spp.）、立克次體（Rickettsia spp.）、牛無漿體（A. bovis）、噬吞噬細胞無形體（A. phagocytophilum）、邊緣無漿體（A. marginale）、羊無漿體（A. ovis）等多種病原，陽性率分別為30.67%、21.33%、12.67%、94.00%、10.67%、18.00%、12.67% 和8.00%。在蜱和血液樣品檢出的病原中，泰勒蟲有5種，包括水牛泰勒蟲（T. buffeli）、瑟氏泰勒蟲（T. sergenti）、環(huán)形泰勒蟲（T. annulata）、呂氏泰勒蟲（T. luwenshuni）和羊泰勒蟲（T. ovis）；巴貝斯蟲有3種，包括莫氏巴貝斯蟲（B. motasi）、卵形巴貝斯蟲（B. ovata）和羊巴貝斯蟲（B. ovis）；螺旋體有3種，包括B. afzelii、B. garinii和B. bissettii；立克次體有3種，分別為：R.rickettsii、R.slovaca和R.raoultii。統(tǒng)計分析可知，這些病原體在樣品采集地普遍存在。在檢測的病原體中，蜱體內(nèi)的立克次氏體陽性率最高，達94.00%（表3）；在血液樣品中，無漿體和梨形蟲病原陽性率較高，其中羊無漿體的檢出率高達54.33%（表4）。

表3　蜱攜帶病原的檢測Table 3　Detected pathogens in ticks

表4　血液樣品中病原的檢測Table 4　Detected pathogens in blood samples

2.3混合感染情況分析在所有檢測的蜱蟲中，2.00%蜱體內(nèi)沒有檢測出任何病原體，28.67%的蜱體內(nèi)只感染1種病原體，50.67%的蜱體內(nèi)同時感染了2種病原體，15.33%的蜱體內(nèi)同時感染了3種病原體，剩下的3.33%的蜱體內(nèi)同時感染了4種病原體。通過對血液樣品的檢測發(fā)現(xiàn)，病原體協(xié)同感染的比例也較高，只有4.00%的血液樣品沒有感染任何病原體。在梨形蟲陽性血液樣品中，有9.33%羊和6.00%牛同時感染了泰勒蟲和巴貝斯蟲。38.67%羊和30.00%牛同時感染2種無漿體，18.00%羊和12.00%牛的血液樣品中檢出了3種無漿體，2.67%羊血液樣品同時感染了4種無漿體。

3　討論

研究結(jié)果顯示，邊緣革蜱作為伊犁州當?shù)氐膬?yōu)勢蜱種，不具有明顯的宿主特異性及宿主選擇性 ，且革蜱作為各類病原體的儲存宿主，是該地區(qū)疾病傳播的重要來源。在鞏留縣的蜱蟲樣品中，僅采集到1只刻點血蜱，說明樣品采集期并非其繁殖的最佳季節(jié)。然而，在這只刻點血蜱中仍然檢測到有梨形蟲感染（T. annulata），說明其仍可作為疾病的儲存宿主和攜帶者。

本次檢測的饑餓成蜱均在野外草原采集獲得，可以保證提取的DNA包含蜱的整個基因組，并且沒有宿主基因污染。檢測結(jié)果表明，除了12只潔凈蜱之外，其他蜱蟲都至少感染了1種病原，說明蜱蟲攜帶病原體極為普遍，給人和動物傳播疫病的風險非常高。血液樣品均采自放牧的牛羊體，在蜱中檢測出的陽性病原體同時可在次月采集的家畜血液樣品中發(fā)現(xiàn)，表明家畜感染的病原體很可能是通過蜱類媒介傳播給放牧動物。

立克次氏體可以引發(fā)人畜共患病，如Q熱和蜱傳斑疹熱，但由于缺乏典型的臨床癥狀，這些疾病常常錯過最佳的診斷時機，甚至造成誤診。本次檢測結(jié)果顯示，立克次體的感染率非常高，所攜帶的病原均為人獸共患病原體，對人畜健康帶來極大的威脅。值得一提的是，在所有的血液樣品檢測中，僅在新源縣則克臺鎮(zhèn)采集的羊血液樣品中檢出了1例立克次體陽性，且為本實驗室第一次在血液樣品中檢測到立克次體。這一現(xiàn)象可能是由于這類病原體在感染動物后，只能在動物發(fā)病的菌血癥階段才能在其血液中檢測到病原體，臨床檢測只能依賴于血清學檢查，使用PCR方法在血液中檢測到立克次體非常難得和不易。因此建議，在臨床大面積調(diào)查這類疫病的流行狀況時，使用成熟的血清學方法檢測較為準確和客觀。

萊姆?。↙yme disease）由萊姆病螺旋體（Borrelia burgdorferi sensu lato）所引起，全溝硬蜱是其病原的主要傳播媒介。本次研究中沒能采集到全溝硬蜱，但在邊緣革蜱（D. marginatus）中檢測到了B. afzelii、B. garinii和B. bissettii，說明伊犁州可能是萊姆病的自然疫源地，而邊緣革蜱可能是萊姆病傳播的潛在媒介。

動物及蜱蟲體內(nèi)的蜱傳寄生蟲病檢測表明，該地區(qū)的蜱傳寄生蟲病流行普遍，病原種類較為多樣，是危害該地區(qū)動物健康和阻礙畜牧業(yè)發(fā)展的主要因素。在羊的血液樣品中，檢測出大量的牛無漿體（A. bovis）陽性樣品，經(jīng)反復(fù)測序及檢測分析確認，這些陽性樣品攜帶的病原確為牛無漿體[17]。這一結(jié)果提示，動物無漿體并非傳統(tǒng)意義上的“嚴格宿主專一性”，宿主選擇范圍較為寬泛，可能具有跨種傳播的能力。

新疆伊犁州畜牧業(yè)發(fā)達，旅游觀光為當?shù)氐闹饕еa(chǎn)業(yè)之一。在本次調(diào)查中無論在蜱體還是動物血液樣品中均發(fā)現(xiàn)大量的蜱傳性病原，甚至1只蜱蟲攜帶多種病原，1個動物被幾種病原感染的現(xiàn)象相當普遍，表明當?shù)仳缗c蜱傳病的流行較為嚴重，家畜和從業(yè)人員飽受蜱傳疾病肆虐的嚴峻考驗，急需引起當?shù)匦竽敛块T的高度重視。同時，本次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了一些重要的蜱傳性人獸共患病病原，如：A. phagocytophilum、B. genomosp、B. afzelii、B. bissettii、R.slovaca和R. raoultii等，這些病原的發(fā)現(xiàn)不僅對畜牧從業(yè)人員及家畜帶來極大的危害，而且對當?shù)鼐用窈陀慰偷慕】蹬c公共衛(wèi)生安全帶來極大的隱患。蜱和蜱傳病是危害當?shù)匦竽翗I(yè)發(fā)展和公共衛(wèi)生安全的頭號危害之一，相關(guān)從業(yè)人員及衛(wèi)生部門應(yīng)高度重視蜱和蜱傳病的防控工作，居民和游客應(yīng)采取必要的保護措施，防止蜱類叮咬，控制蜱傳病原體的傳播，盡量將蜱與蜱傳病的危害降到較低。

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MOLECULAR EPIDEMIOLOGICAL INVESTIGATION OF TICKS AND TICKBORNE PATHOGENS IN DOMESTIC ANIMALS IN KAZAK AUTONOMOUS PREFECTURE OF ILI, XINJIANG, CHINA

CHEN Qiu-yu1, LUO Jin1, CHEN Ze1, CHEN Rong-gui2, WANG Hai-jun3, DUAN Wei-chun4, CUI Jian-guo5, Bolati Womuerbieke6, LI Kai1, LIU Xiao-cui1, HAO Jia-wei1, LIU Guang-yuan1

(1. Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province, State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, CAAS, Lanzhou 730046, China; 2. Ili Center of Animal Disease Control and Diagnosis, Ili 835000, China; 3. Xinyuan County Animal Husbandry and Veterinary Station, Xinyuan 835800, China; 4. Gongliu County Animal Husbandry and Veterinary Station, Gongliu 835400, China; 5. Qapqal Xibe Autonomous County Animal Husbandry and Veterinary Station, Qapqal Xibe 835300, China; 6. Zhaosu County Animal Husbandry and Veterinary Station, Zhaosu 835600, China)

Kazak Autonomous Prefecture of Ili, Xinjiang, a border region in Northwest China, famous for its animal husbandry and famed as a romantic holiday resort. For years, there were sporadic research about the tick-borne disease, but systematic epidemiological fi ndings have not report yet. In order to identify the ticks and detect the tick-borne pathogens in ticks and blood samples, samples were collected from steppe and animal body from 4 counties within Ili (Xinyuan County, Qapqal Xibe Autonomous County, Gongliu County and Zhaosu County). A total of 600 ticks were collected in smpling site (each county for 150 pieces), among which fi ve species of Ixodidae were found, including Dermacentor marginatus, Haemaphysalis punctata, Hyalomma detritum, Hyalomma asiaticum and Haemaphysalis concinna. There were also 150 sheep blood samples and 150 cattle blood samples in each sampling site(total of 1200 cattle blood samples, 150/county/month; 1200 sheep blood samples, 150/county/month). Polymerase chain reaction assay (PCR) and sequence analysis were employed to identify the potential pathogens. A total of eight genera pathogens were detected, including Theileria spp., Babesia spp., A. bovis, A. phagocytophilum, A. marginale, A. ovis, Borrelia spp. and Rickettsia spp. The detection results indicated that both human and animal pathogens were abundant in ticks and blood samples in the study areas. Some zoonosis pathogens were prevalent and had an extremely high infection rate. Humans and animals in these regions were at a high risk of exposure to these tick-borne diseases.

Ticks; tick-borne pathogens; co-infection; epidemiology; cattle; sheep

S852.746

A

1674-6422（2016）03-0072-06

2016-03-23

農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（ASTIP）

陳秋語，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學專業(yè)

劉光遠，E-mail：liuguangyuan@caas.cn