果蔬中苯醚甲環(huán)唑免疫分析方法的研究

劉冰，馮久慧，童貝，張富源，生威，張燕，陸旸，王碩

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

果蔬中苯醚甲環(huán)唑免疫分析方法的研究

劉冰，馮久慧，童貝，張富源，生威，張燕，陸旸，王碩*

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

針對(duì)目前由于三唑類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑的廣泛應(yīng)用所帶來的農(nóng)藥殘留問題，建立了苯醚甲環(huán)唑的直接酶聯(lián)免疫檢測方法，其靈敏度IC50為（67.96±2.73）μg/L，檢測限IC15為（8.86±0.34）μg/L，與11種三唑類殺菌劑的交叉反應(yīng)率均小于0.01%。苯醚甲環(huán)唑在10種果蔬類樣品中的平均回收率為89.01%～103.43%，變異系數(shù)小于14.33%，檢出限為0.443mg/kg。

苯醚甲環(huán)唑；抗體；檢測；酶聯(lián)免疫吸附測定法

苯醚甲環(huán)唑，又名噁醚唑，商品名為世高、思科，英文名為Difenoconazole，化學(xué)名稱為順，反-3-氯-4-［4-甲基-2-（1H-1，2，4-三唑-1-甲基）-1，3-二氧戊烷-2-甲基］苯基-4-氯苯基醚。苯醚甲環(huán)唑是一種廣譜高效的三唑類內(nèi)吸性殺菌劑，屬于14α-甾醇脫甲基化抑制劑，可以干擾菌絲生長，抑制病原體孢子萌發(fā)，最終抑制真菌生長［1］。苯醚甲環(huán)唑具有保護(hù)和治療作用，被廣泛應(yīng)用于谷物、油料、水果、蔬菜、花生、甜菜、茶葉、人參等作物以控制病蟲害，主要用于防治灰腐病、霜霉病和白粉病，同時(shí)還可以抑制草莓和辣椒炭疽病［2］。按照我國農(nóng)藥的毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，苯醚甲環(huán)唑的毒性經(jīng)口大于500 mg/kg，屬于低毒類農(nóng)藥，對(duì)人的每日容許攝入量為0.01 mg/kg體重［3］。但由于是直接噴灑于蔬菜、水果等作物上，使人們易受其危害。許多國家對(duì)該農(nóng)藥在食品中的殘留限量已經(jīng)作出了嚴(yán)格的限制，因此對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品中苯醚甲環(huán)唑殘留量的檢測日益受到重視。

潘曉威［4］提出利用氣相色譜法能夠快速檢測芒果中苯醚甲環(huán)唑的殘留量，結(jié)果表明：樣品經(jīng)乙腈渦旋提取，通過PSA和無水硫酸鎂高速離心凈化，氣相色譜檢測，其添加回收率為79.8%～100.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.81%～4.39%，檢出限為0.002 5 mg/kg。Sandip H等［5］利用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）對(duì)秋葵中苯醚甲環(huán)唑的殘留量進(jìn)行了檢測，回收率為80%～107%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4%～17%，檢測限為0.005 mg/kg。Ting D等［6］利用苯醚甲環(huán)唑作為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，建立了一種固相微萃?。肿佑≯E方法，用來檢測自來水和葡萄汁中的苯醚甲環(huán)唑殘留。檢測結(jié)果顯示，苯醚甲環(huán)唑的回收率為87.6%～95.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.9%，檢出限為0.5 μg/L。運(yùn)用上述常規(guī)的儀器分析方法，不僅時(shí)間長、費(fèi)用高，而且操作人員易接觸一些有毒的有機(jī)溶劑和化學(xué)試劑［7］?，F(xiàn)今，食品安全檢測正朝著快速便捷的方向發(fā)展，本研究旨在建立一種簡單、快速、靈敏的酶聯(lián)免疫分析檢測方法，這對(duì)于日益嚴(yán)重的食品安全問題得到更好更便捷地解決來說意義重大。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

苯醚甲環(huán)唑、腈菌唑、三唑醇、戊唑醇、雙苯三唑醇、三唑酮、烯唑醇、丙環(huán)唑、氟硅唑、粉唑醇、匙孔血藍(lán)蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、雞卵白蛋白（OVA）、辣根過氧化氫酶（HRP）、溴代乙酰氯、4-氨基丁酸：均購自美國Sigma公司；氟環(huán)唑、戊環(huán)唑：購自Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司；3，4′-二氯二苯醚：購自北京力徳士化學(xué)科技有限公司；其它試劑均為分析純。包被緩沖液（0.05 mol/L，pH 9.6，碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液）；磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L PBS，pH 7.4）；封閉液（0.5%脫脂乳粉/PBS溶液）；洗滌液（PBST，pH 7.4）；底物液（TMB-過氧化脲溶液）；終止液（1.25 mol/L硫酸溶液）。苯醚甲環(huán)唑抗體：由食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。

蛋白純化儀：美國BIO-RAD公司；酶標(biāo)儀：Thermo公司；冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；96孔酶標(biāo)板：丹麥Nunc公司。

1.2方法

1.2.1直接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

1.2.1.1直接競爭ELISA的檢測步驟

抗體以100 μL/well包被于酶標(biāo)板上，4℃孵育過夜；洗板后以200 μL/well加入封閉液，37℃孵育1 h；洗板后每孔先加入50 μL梯度稀釋的苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后加入50 μL酶標(biāo)抗原稀釋液，37℃競爭反應(yīng)1 h；洗板后以100 μL/well加入底物液，室溫顯色20 min；以50 μL/well加入終止液；在雙波長方式（450 nm～650 nm）下用酶標(biāo)儀讀取OD值。根據(jù)OD值按公式（1）計(jì)算抑制率：

式中：OD陰性對(duì)照為不加標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值；OD陽性對(duì)照為加標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值；OD空白為不加標(biāo)準(zhǔn)品和抗血清的吸光度值。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：X軸為苯醚甲環(huán)唑標(biāo)品濃度的對(duì)

式中：IC50（苯醚甲環(huán)唑）為標(biāo)準(zhǔn)曲線上抑制率為50%處對(duì)應(yīng)的苯醚甲環(huán)唑濃度；IC50（結(jié)構(gòu)類似物）為標(biāo)準(zhǔn)曲線上抑制率為50%處對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)類似物濃度。

1.2.3實(shí)際樣品檢測

1.2.3.1樣品預(yù)處理

選取青花菜、大白菜、番茄、黃瓜、根芹菜、柑橘、蘋果、梨、香蕉、木瓜，共10種果蔬類樣品進(jìn)行研究，所有樣品不可洗滌，選取食用部分經(jīng)充分?jǐn)囁楹笾糜?℃?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)時(shí)，稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL正己烷，渦旋震蕩5 min，吸取上層清液2 mL，經(jīng)氮吹濃縮近干，加入1 mL甲醇復(fù)溶［8］，用0.01 mol/L PBS稀釋后用于ELISA檢測。

1.2.3.2樣品的基質(zhì)影響及消除

將樣品按照1.2.3.1的方法處理后，用PBS分別稀釋5、10、50倍，然后分別繪制基質(zhì)曲線，選取與標(biāo)準(zhǔn)曲線吻合度最高的條件作為最適試驗(yàn)條件。

1.2.3.3加標(biāo)回收

向選取的果蔬類樣品中分別添加3個(gè)濃度水平（0.5、2.5、25 mg/kg）的苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品，將加標(biāo)樣品充分混勻，靜置一段時(shí)間后，按照1.2.3.1的方法處理后，利用直接競爭ELISA法檢測，計(jì)算苯醚甲環(huán)唑的回收率。

1.2.3.4果汁樣品檢測分析

選取不同品牌的蘋果汁和橙汁樣品，按照1.2.3.1的方法處理后，進(jìn)行實(shí)際檢測分析。數(shù)值，Y軸為相應(yīng)的抑制率，是典型的S型曲線。

1.2.1.2抗體包被量和酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

試驗(yàn)采用棋盤法對(duì)抗體包被量和酶標(biāo)抗原的稀釋倍數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選取3個(gè)抗體包被量（0.05、0.10、0.50 μg/well）和3個(gè)酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)（2 000、3 000、4 000），同時(shí)進(jìn)行優(yōu)化，并繪制抑制率隨標(biāo)品濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，選取ODmax在0.8～1.2之間，IC50值較小的參數(shù)為最優(yōu)條件。

1.2.1.3封閉液的種類及濃度的確定

供選擇的封閉液包括：0.5%脫脂乳粉，1.0%脫脂乳粉，0.5%OVA，1.0%OVA，分別用磷酸鹽緩沖液配置后，在其他條件不變的情況下進(jìn)行測定，選取ODmax在0.8～1.2之間，IC50值較小的參數(shù)為最優(yōu)條件。

1.2.2抗體特異性的測定

試驗(yàn)選取腈菌唑、三唑醇、戊唑醇、雙苯三唑醇、三唑酮、烯唑醇、氟環(huán)唑、戊環(huán)唑、氟硅唑、粉唑醇、丙環(huán)唑共11種三唑類殺菌劑，按公式（2）分別計(jì)算其交叉反應(yīng)率，以確定苯醚甲環(huán)唑抗體的特異性。

2　結(jié)果與討論

2.1直接競爭ELISA檢測方法的建立

經(jīng)優(yōu)化，抗體以0.50 μg/well包板，酶標(biāo)抗原稀釋3 000倍，封閉液為0.5%脫脂乳粉，苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品從2 000 μg/L開始4倍梯度稀釋6個(gè)濃度進(jìn)行測試，繪制抑制率隨苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，通過計(jì)算得出：靈敏度IC50為（67.96±2.73）μg/L，檢測限IC15為（8.86±0.34）μg/L。

圖1　苯醚甲環(huán)唑直接競爭ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of difenoconazole by dc-ELISA

2.2抗體特異性的測定

抗體的特異性通常用交叉反應(yīng)率來表示，交叉反應(yīng)率是指抗體與結(jié)構(gòu)不同的抗原決定簇發(fā)生結(jié)合的能力。交叉反應(yīng)率越小，說明抗體的特異性高，反之，交叉反應(yīng)率越大，說明抗體具有廣譜性，可識(shí)別多種同類藥物。本試驗(yàn)選取了腈菌唑、三唑醇、戊唑醇、雙苯三唑醇、三唑酮、烯唑醇、氟環(huán)唑、戊環(huán)唑、氟硅唑、粉唑醇、丙環(huán)唑，共11種三唑類殺菌劑，與苯醚甲環(huán)唑的交叉反應(yīng)率均小于0.01%，證明該抗體特異性較高，可以對(duì)食品中的苯醚甲環(huán)唑進(jìn)行有效檢測。

2.3實(shí)際樣品檢測

2.3.1樣品的基質(zhì)影響及消除

樣品中的腐殖質(zhì)、金屬離子、有機(jī)成分等基質(zhì)的存在可能會(huì)影響檢測方法的靈敏度，為了消除基質(zhì)效應(yīng)，可以對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋［9］。在本試驗(yàn)中，以蘋果樣品為例，將樣品按照1.2.3.1的方法處理后，用PBS分別稀釋5、10、50倍，然后分別繪制基質(zhì)曲線，選取與標(biāo)準(zhǔn)曲線吻合度最高的條件作為最適試驗(yàn)條件，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

當(dāng)樣品提取液用PBS稀釋50倍時(shí)，最適合進(jìn)行ELISA的測定。根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)及直接競爭ELISA方法的檢測限，計(jì)算得出10種果蔬類樣品中苯醚甲環(huán)唑的檢出限，均為0.443 mg/kg。

2.3.2加標(biāo)回收

共選擇10種果蔬類樣品，分別向其中添加3個(gè)濃度水平（0.5、2.5、25 mg/kg）的苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品，按照直接競爭ELISA方法進(jìn)行檢測，計(jì)算其加標(biāo)回收率，測定結(jié)果如表1、表2所示。

圖2　不同稀釋倍數(shù)提取液的優(yōu)化結(jié)果Fig.2　The optimization of concentrations of extract

表1　蔬菜樣品中苯醚甲環(huán)唑的加標(biāo)回收率（n=3）Table 1　Recoveries studies of difenoconazole in vegetables（n=3）

表2　水果樣品中苯醚甲環(huán)唑的加標(biāo)回收率（n=3）Table 2　Recoveries studies of difenoconazole in fruits（n=3）

回收率在89.01%～103.43%之間，變異系數(shù)小于14.33%，說明此方法適用于食品樣品的檢測。

2.3.3果汁樣品檢測分析

選取不同品牌的蘋果汁和橙汁樣品進(jìn)行實(shí)際檢測分析，利用本研究所建立的dc-ELISA方法進(jìn)行檢測后，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3　實(shí)際果汁樣品檢測及回收率表Table 3　Detection of real samples and their recoveries

由表3可知，6種樣品中均無苯醚甲環(huán)唑檢出（實(shí)測濃度低于樣品檢出限0.443 μg/L）。同時(shí)向所有樣品中添加2.5 mg/L的苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算回收率，樣品處理方法同1.2.3.1，回收率為91.04%～113.84%。

3　結(jié)論

本研究通過苯醚甲環(huán)唑半抗原的設(shè)計(jì)及合成，人工抗原的制備，多克隆抗體的制備及純化，最終建立了苯醚甲環(huán)唑的直接競爭ELISA檢測方法，其靈敏度IC50為（67.96±2.73）μg/L，檢測限IC15為（8.86±0.34）μg/L，與11種三唑類殺菌劑的交叉反應(yīng)率均小于0.01%。選取10種果蔬類樣品，經(jīng)正己烷提取，PBS稀釋后，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，平均回收率為89.01%～103.43%，變異系數(shù)小于14.33%，檢出限為0.443 mg/kg。本研究所建立的直接競爭ELISA方法，靈敏度和特異性較高，樣品處理簡單，為農(nóng)產(chǎn)品中苯醚甲環(huán)唑殘留的有效監(jiān)管提供了一種高效的檢測工具。

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Development of An Enzyme-linked Immunosorbent Assay for the Detection of Difenoconazole in Fruits and Vegetables

LIU Bing，F(xiàn)ENG Jiu-hui，TONG Bei，ZHANG Fu-yuan，SHENG Wei，ZHANG Yan，LU Yang，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nurtrition and Safety Ministry of Education of China，The School of Food Engineering and Biotechnology of Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

A direct competitive enzyme-linked immunosorbent assays（dc-ELISA）was developed for detection of difenoconazole.The sensitivity（IC50）and the limit of detection（IC15）were（67.96±2.73）μg/L and（8.86± 0.34）μg/L，respectively.The assay conditions were optimized and the cross-reactivity against other triazole fungicides was low.The recoveries were in range of 89.01%-103.43%and RSD were below 14.33%.The detection limit for the method was 0.443 mg/kg.

difenoconazole；antibody；detection；ELISA

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.025

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（31301462）

劉冰（1979—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品安全檢測。

王碩（1969—），男，教授，研究方向：食品安全檢測。

2015-12-21