鹽度脅迫對(duì)花鱸幼魚(yú)腸道抗氧化和非特異性免疫能力的影響

王海亮 溫海深 張曉燕

摘要 試驗(yàn)比較不同鹽度處理對(duì)花鱸幼魚(yú)抗氧化酶和非特異性免疫酶的影響。設(shè)置5‰、15‰、20‰、25‰ 4個(gè)鹽度處理組，10‰對(duì)照組。分別在試驗(yàn)開(kāi)始（即鹽度脅迫開(kāi)始）的第1天、第11天和第21天采集腸道為試驗(yàn)樣品，并進(jìn)行超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活力和丙二醛含量的測(cè)定。結(jié)果表明：在高鹽度和低鹽度的脅迫下，花鱸幼魚(yú)腸道各測(cè)定指標(biāo)都表現(xiàn)出了顯著的變化。超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶變化趨勢(shì)表現(xiàn)出一致性，在5‰、15‰、20‰、25‰鹽度中活力都顯著升高（P<0.05），并隨著時(shí)間推移而逐漸降低，在21 d時(shí)25‰處理組測(cè)得活力最低值。在急性鹽度脅迫下，酸性磷酸酶活力有降低的趨勢(shì)，并且在低鹽度（5‰）急性脅迫下活力顯著降低（P<0.05）；而隨著時(shí)間，活力又有所回升，到21 d時(shí)恢復(fù)正常水平。21 d時(shí)，25‰鹽度組酸性磷酸酶活力最高，顯著高于其他組（P<0.05）。堿性磷酸酶在鹽度脅迫下活力也受到抑制，在第1天25‰處理組測(cè)得活力最低值，隨著時(shí)間，各處理組活力得到恢復(fù)，25‰處理組在21 d時(shí)活力達(dá)到最高值。在急性鹽度脅迫下，丙二醛含量顯著升高（P<0.05），而后，在21 d恢復(fù)正常水平。結(jié)果表明，鹽度脅迫對(duì)花鱸腸道抗氧化酶和非特異性免疫酶活力都有顯著影響。

關(guān)鍵詞 花鱸；鹽度脅迫；抗氧化酶活力；非特異性免疫

中圖分類號(hào) S968.25 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）04-0261-03

Effects of Salinity Stress on Antioxidant Enzyme and Non-specific Immunity Activities in the Intestine of Juvenile Lateolabrax maculatus

WANG Hai-liang Wen Hai-shen * ZHANG Xiao-yan

（Key laboratory of Mariculture，Ministry，Ocean University of China，Qingdao Shandong 266003）

Abstract The effects of salinity on the non-specific immunity and the antioxidant enzyme activities in juvenile Lateolabrax maculatus were investigated in this research. The salinity of aquaculture water were maintained at 5‰，15‰，20‰ and 25‰ in four experimental groups，and group of 10‰ was used as control. We collected intestine as samples on day 1，11 and 21 during the experiment，and determined the changes of superoxid dismutase（SOD），catalase（CAT），acid phosphatase（ACP），alkaline phosphatase（AKP），and malondialdehyde（MDA）. The results revealed that the activities had significant changes in high and low salinity water. Changes of SOD and CAT were corresponding，and activities of SOD and CAT increased obviously（P<0.05）before a decline. The activity of ACP showed a downward trend，and the the trend was significant in 5‰ water（P<0.05）during the acute salinity stress. The activity of AKP was inhibited during acute salinity stress，and reached the minimum in 25‰ at the first day. The activity of AKP increased to the nomal value，and reached the maximum in 25‰ on 21 day. The content of MDA showed a increasing trend before a downward trend，and remained stable. In conclusion，salinity stress could result to significant changes of the non-specific immunity and the antioxidant enzyme activities.

Key words Lateolabrax maculatus；salinity stress；antioxidant enzyme activities；non-specific immunity

鹽度是水生生物的重要環(huán)境因子，能夠顯著影響魚(yú)類的生長(zhǎng)、存活、代謝及非特異性免疫[1-3]。水體鹽度受到多方面因素的影響，諸多人為因素和自然因素都會(huì)引起鹽度的變化。有研究表明，鹽度的變化能夠引起魚(yú)類的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致魚(yú)體能量消耗增加，代謝加速，耗氧增多[4]。同時(shí)，在高鹽度或低鹽度脅迫下，魚(yú)體體質(zhì)會(huì)變差，容易受到病原體的入侵，引起魚(yú)體疾病，甚至死亡[5]。此外，鹽度的變化還能夠引起魚(yú)體活性氧自由基（ROS）的增多，若不能夠及時(shí)清除會(huì)引起魚(yú)體氧化損傷。長(zhǎng)期處于這種氧化狀態(tài)之下，魚(yú)體的免疫能力和抵抗力下降[6]。

抗氧化機(jī)制是魚(yú)類防止氧化損傷的主要屏障，它能夠清除體內(nèi)氧自由基，增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力，維持體內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡。超氧化物歧化酶（SOD）是重要的自由基清除劑，它能保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。過(guò)氧化氫酶（CAT）能夠?qū)⑦^(guò)氧化氫分解為水和氧氣，對(duì)于維持魚(yú)類細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)及對(duì)氧化應(yīng)激的防御起著關(guān)鍵的作用。非特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫系統(tǒng)是魚(yú)類抵抗外來(lái)病原入侵的第一道防線[7]。酸性磷酸酶（ACP）作為溶酶體的標(biāo)志酶，具有清除衰老或死亡的細(xì)胞和細(xì)胞器，識(shí)別、吞噬和降解入侵的病原體的作用，同時(shí)在免疫防護(hù)方面具有重要作用。堿性磷酸酶（AKP）是動(dòng)物溶酶體的組成部分，參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、利用，鈣的代謝，在免疫反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用[8]。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化物，可以間接反映組織細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，而且還可以間接反映活性氧自由基產(chǎn)生的數(shù)量。因此，抗氧化酶和免疫酶在維持魚(yú)體穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)抵抗力方面具有重要的作用。

花鱸（Lateolabrax maculatus）隸屬于鱸形目鮨科花鱸屬，主要分布于太平洋西部，在我國(guó)黃海、渤海等海域及朝鮮半島均有分布，是我國(guó)重要海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一。花鱸是一種廣鹽性魚(yú)類，在海水、半咸水、淡水中都有養(yǎng)殖。然而，對(duì)花鱸在鹽度脅迫下，免疫和抗氧化方面的研究還較少。該文以花鱸幼魚(yú)為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定不同鹽度脅迫下，腸道超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）堿性磷酸酶（AKP）的活力以及丙二醛（MDA）的含量的變化，探討花鱸在鹽度脅迫下抗氧化能力和免疫能力的變化，分析花鱸對(duì)鹽度變化的適應(yīng)性。通過(guò)該項(xiàng)研究，在理論上豐富花鱸免疫生理學(xué)研究?jī)?nèi)容，在生產(chǎn)實(shí)踐上為花鱸的健康養(yǎng)殖和水環(huán)境調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)魚(yú)種。試驗(yàn)所用花鱸為珠海市斗門區(qū)河口漁業(yè)研究所池塘養(yǎng)殖的幼魚(yú)，試驗(yàn)之前在鹽度為10‰的水泥池中暫養(yǎng)10 d。試驗(yàn)選用體質(zhì)健壯、活力旺盛的幼魚(yú)進(jìn)行，試驗(yàn)用魚(yú)體長(zhǎng)為（5.56±0.68）cm、體重為（1.50±0.31）g。

1.1.2 試驗(yàn)試劑。試驗(yàn)測(cè)定超氧化物岐化酶、過(guò)氧化氫酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活力和丙二醛、蛋白含量所用試劑盒均采購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在30 L的塑料箱中進(jìn)行，分為5‰、10‰、15‰、20‰、25‰ 5個(gè)鹽度組，其中10‰為對(duì)照組（CK），每個(gè)處理3個(gè)平行。試驗(yàn)過(guò)程中每日換水1/3，試驗(yàn)用水為曝氣自來(lái)水和過(guò)濾海水配制而成。24 h不間斷充氣，及時(shí)清除殘余餌料及糞便。

1.3 樣品采集

在試驗(yàn)開(kāi)始的1 d、11 d和21 d采集樣品，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)在每個(gè)塑料箱中采集3尾魚(yú)，將其用MS-222麻醉劑進(jìn)行快速麻醉，解剖后采集其腸道，迅速放入離心管中，保存于液氮，待測(cè)。

1.4 樣品的制備

準(zhǔn)確稱取0.2 g樣品，按重量體積比1∶9（g/mL）向樣品中加入生理鹽水，在冰水浴條件下，采用轉(zhuǎn)速為2 500 r/min離心10 min，取上清液，保存于-20 ℃冰箱中，在1周內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。

1.5 酶活力的測(cè)定

蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)法，考馬斯亮藍(lán)遇蛋白質(zhì)顯現(xiàn)藍(lán)色，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，再轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)含量；超氧化物歧化酶采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，在顯色劑作用下反應(yīng)系統(tǒng)呈現(xiàn)紫紅色，在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，通過(guò)公式轉(zhuǎn)化為酶活力值。定義1 mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)活力單位（U）。過(guò)氧化氫酶采用鉬酸銨法測(cè)定[8]，過(guò)氧化氫與鉬酸銨產(chǎn)生黃的淡絡(luò)合物，在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，計(jì)算轉(zhuǎn)化為酶活力。定義1 mg組織蛋白1 s分解1 μmol過(guò)氧化氫的量為一個(gè)活力單位（U）。酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力的測(cè)量采用磷酸苯二鈉法，2種酶與磷酸苯二鈉作用產(chǎn)生紅色的衍生物，在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，轉(zhuǎn)化為酶活力。酸性磷酸酶定義1 g組織蛋白在37 ℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位。堿性磷酸酶定義1 g組織蛋白在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位；丙二醛采用硫代巴比妥酸（TBA）法進(jìn)行測(cè)定，反應(yīng)體系產(chǎn)生紅色產(chǎn)物，在532 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，計(jì)算轉(zhuǎn)換為丙二醛含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

該試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）以及Duncan多重比較檢驗(yàn)數(shù)據(jù)差異的顯著性，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度脅迫下超氧化物歧化酶活力的變化

如圖1所示，在急性脅迫的第1天，隨著脅迫強(qiáng)度的增加，SOD活力逐漸增強(qiáng)，1 d時(shí)25‰組活力顯著高于其他各鹽度（P<0.05）。在11 d時(shí)，各鹽度組之間，SOD活力差異不明顯（P>0.05），已經(jīng)基本恢復(fù)至正常水平。在21 d時(shí)，25‰處理組SOD活力顯著低于其他鹽度組（P<0.05）。在5‰、10‰處理組，隨著時(shí)間變化，SOD活力變化不明顯。而15‰、20‰、25‰鹽度組第1天SOD活力顯著高于另外2個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

2.2 鹽度脅迫下過(guò)氧化氫活力的變化

鹽度脅迫下CAT活力變化如圖2所示?？傮w看來(lái)，CAT變化趨勢(shì)和SOD有很高的相似性。在急性鹽度脅迫作用下，第1天脅迫組CAT活力有增高的趨勢(shì)，25‰鹽度組活力最高，5‰鹽度處理組次高，其余3個(gè)鹽度組沒(méi)有顯著性變化（P>0.05）。在第11天，各組活力逐漸恢復(fù)至正常水平。脅迫后21 d，各鹽度組沒(méi)有表現(xiàn)出顯著性差異（P>0.05），此時(shí)25‰組CAT活力最低。在同一鹽度各不同時(shí)間處理組中，5‰、10‰、15‰鹽度組在各時(shí)間點(diǎn)之間沒(méi)有顯著性差異，變化較小。20‰和25‰鹽度組第1天的CAT活力顯著高于11 d和21 d（P<0.05），而后二者之間沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。

2.3 鹽度脅迫下酸性磷酸酶活力的變化

如圖3所示，花鱸在鹽度脅迫下，酸性磷酸酶的活力有降低的趨勢(shì)。在急性脅迫的第1天，各處理組酸性磷酸酶活力都低于對(duì)照組，并且低鹽度脅迫（5‰）下，活力降低最為顯著（P<0.05）。在第11天，25‰鹽度組活力迅速上升，活力顯著高于其他各組（P<0.05）。在21 d，CAT活力隨鹽度升高而升高。各鹽度處理組，隨著時(shí)間的推延，CAT活力都有上升的趨勢(shì)。

2.4 鹽度脅迫下堿性磷酸酶活力的變化

如圖4所示，在鹽度的急性脅迫下，堿性磷酸酶活力在第1天的各處理組中都有下降的趨勢(shì)，5‰、20‰、25‰顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。在11 d時(shí)，各處理組AKP活力都有所回升，各組之間也表現(xiàn)出明顯的差異。在21 d，25‰組AKP活力快速升高，并顯著高于其他鹽度組。AKP活力在總體上也表現(xiàn)出隨鹽度升高而上升的趨勢(shì)。

2.5 鹽度脅迫下丙二醛含量的變化

鹽度脅迫下，MDA含量變化如圖5所示，在急性脅迫的第1天，各處理組MDA都顯著升高（P<0.05），且隨著脅迫強(qiáng)度的增加，MDA含量升高。在11 d，各處理組MDA含量都顯著下降（P<0.05）。在脅迫后的第21天，各鹽度組MDA含量都恢復(fù)正常水平，含量比較低。

3 討論與結(jié)論

抗氧化機(jī)制和非特異性免疫體系在維持魚(yú)類動(dòng)態(tài)平衡、增強(qiáng)魚(yú)體抵抗力等方面具有重要作用[9]。該研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)中所測(cè)得的抗氧化酶和非特異性免疫酶類在鹽度脅迫下都有較為顯著的變化。這也說(shuō)明鹽度脅迫對(duì)花鱸幼魚(yú)抗氧化能力和非特異性免疫能力有顯著的影響。超氧化物歧化酶是重要的抗氧化酶，能夠清除體內(nèi)超氧自由基（O2-），保護(hù)魚(yú)體細(xì)胞免受活性氧自由基的損傷，是抗氧化機(jī)制中的關(guān)鍵酶[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)魚(yú)類生存環(huán)境（鹽度、水溫、溶解氧等）發(fā)生變化時(shí)，均能夠引起魚(yú)體抗氧化能力的變化[11]。在鹽度急性脅迫開(kāi)始的第1天，鹽度處理組SOD活力較對(duì)照組（10‰）升高，這是由于在鹽度脅迫下，魚(yú)體要消耗更多的能量來(lái)維持身體平衡，而在這個(gè)代謝旺盛的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，SOD活力升高用以清除這些自由基，進(jìn)而保護(hù)魚(yú)體免受氧化損傷。在11 d的樣品中，各鹽度條件下SOD活力沒(méi)有顯著差異，推測(cè)這是隨著時(shí)間推移，魚(yú)體適應(yīng)各自鹽度環(huán)境的緣故。21 d時(shí)，25‰鹽度組SOD活力顯著低于其他組，這可能是由于此鹽度是花鱸幼魚(yú)最適生長(zhǎng)鹽度，因此受到脅迫壓力小而其SOD活力也較低。

過(guò)氧化氫酶（CAT）是生物體內(nèi)過(guò)氧化物酶類的標(biāo)志酶，占過(guò)氧化物總酶體量的40%[12]。CAT能夠?qū)Ⅲw內(nèi)的過(guò)氧化氫分解成水和氧氣，保護(hù)機(jī)體免受氧化的危害。該研究發(fā)現(xiàn)，鹽度脅迫下，花鱸幼魚(yú)腸道中SOD和CAT在急性鹽度脅迫下的變化趨勢(shì)高度相似，推測(cè)這是由于二者在功能上的協(xié)同性導(dǎo)致的[13]。脅迫后第1天，各處理組CAT活力都顯著升高，且隨著脅迫強(qiáng)度的增加，CAT活力升高也更加顯著，推測(cè)這與SOD變化原因相同。但是，可以發(fā)現(xiàn)低鹽度脅迫（5‰）對(duì)花鱸幼魚(yú)的影響較高鹽度強(qiáng)烈。在之后各時(shí)間點(diǎn)，CAT恢復(fù)正常水平，推測(cè)是由于花鱸幼魚(yú)此時(shí)已經(jīng)適應(yīng)各自的鹽度環(huán)境，脅迫程度也顯著降低。

酸性磷酸酶（ACP）是高等動(dòng)物體內(nèi)巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志性酶，在體內(nèi)直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝[14]。酸性磷酸酶作為溶酶體的標(biāo)志酶，參與消除生物大分子，維持細(xì)胞正常代謝活動(dòng)，清除衰老或死亡的細(xì)胞和細(xì)胞器，識(shí)別、吞噬和降解入侵的病原體，在免疫防護(hù)方面起重要作用[15]。該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在脅迫試驗(yàn)開(kāi)始的第1天，各鹽度處理組ACP活力低于對(duì)照組，低鹽度脅迫（5‰）ACP活力顯著低于對(duì)照組，這可能是由于鹽度的急性變化抑制了ACP的活力，并且低鹽度脅迫的抑制作用明顯。隨著魚(yú)體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)，在11 d和21 d各鹽度處理組ACP活力都有所上升。在最后一次采得的樣品中，ACP活力顯現(xiàn)出隨著鹽度升高而升高的趨勢(shì)，根據(jù)白秀娟等在文昌魚(yú)（Branchiostoma lanceolatum）中的研究結(jié)果[16]，推測(cè)這是由于金屬離子對(duì)ACP活力的激活作用。

堿性磷酸酶（AKP）是溶酶體酶的重要組成部分，在魚(yú)體的生長(zhǎng)、物質(zhì)代謝以及免疫方面具有重要作用[17]。在該試驗(yàn)中，急性鹽度脅迫下，AKP活力在第1天受到抑制。各鹽度組AKP活力隨著時(shí)間都有顯著升高的趨勢(shì)。且隨著鹽度的升高，AKP活力也有升高的趨勢(shì)。與該試驗(yàn)結(jié)果相比較，劉存歧等發(fā)現(xiàn)海水中金屬離子的升高對(duì)酸性磷酸酶活力有促進(jìn)作用[18]；馮 娟等在軍曹魚(yú)（Rachycentron canadum Linnaeus）鹽度脅迫的試驗(yàn)中得到的結(jié)果與該文試驗(yàn)結(jié)果一致[19]。推測(cè)這種變化趨勢(shì)是由于水中金屬離子對(duì)AKP活力的促進(jìn)作用。

丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化物，MDA含量的高低能夠直接反應(yīng)脂質(zhì)氧化的程度，也能間接反應(yīng)自由基的數(shù)量。因此其可以作為脂質(zhì)氧化程度和自由基產(chǎn)生數(shù)量的反應(yīng)指

標(biāo)[20]。在鹽度脅迫初期（1 d），各鹽度處理組MDA含量顯著高于對(duì)照組。這是由于在鹽度脅迫下，花鱸幼魚(yú)需要消耗額外的能量來(lái)維持機(jī)體滲透壓平衡，在這些過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧自由基將脂質(zhì)氧化，從而導(dǎo)致MDA含量增多。隨著SOD和CAT等抗氧化酶類活力的增加，MDA含量在第11天和第21天活力都顯著降低，最后恢復(fù)至正常水平。

鹽度是魚(yú)類生存的重要環(huán)境因子，鹽度的變化會(huì)引起魚(yú)體的應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致魚(yú)體抵抗力的下降，病原體便可乘機(jī)而入，導(dǎo)致魚(yú)體疾病。該研究發(fā)現(xiàn)，急性鹽度脅迫能夠?qū)︳~(yú)體造成氧化壓力，此時(shí)，SOD和CAT等重要的抗氧化酶類在避免魚(yú)體氧化損傷方面具有重要作用。在非特異性免疫方面，急性鹽度脅迫會(huì)造成魚(yú)類ACP、AKP等免疫酶類活力的暫時(shí)性抑制，而高鹽度會(huì)對(duì)ACP和AKP活力具有促進(jìn)作用。綜上所述，花鱸養(yǎng)殖過(guò)程中鹽度脅迫會(huì)引起體內(nèi)氧化應(yīng)激、抵抗力下降。25‰是花鱸較為適宜的生長(zhǎng)鹽度，此時(shí)魚(yú)體抵抗力水平較高，不易患病。因此，在花鱸養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中要注意鹽度的變化，避免由于抵抗力下降導(dǎo)致魚(yú)體疾病。

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