楊樹環(huán)化酶基因組織表達(dá)模式和蛋白定位

?賈志剛，夏德安，李淑娟?

（東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江　哈爾濱　150040）

楊樹環(huán)化酶基因組織表達(dá)模式和蛋白定位

賈志剛，夏德安，李淑娟

（東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150040）

半定量RT-PCR顯示，毛果楊形成層、幼葉和頂芽中的Potri.006G237100轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物極低，但在木質(zhì)部、葉柄和根中其轉(zhuǎn)錄水平卻較髙，在木質(zhì)化莖節(jié)其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也呈現(xiàn)高豐度積累，這表明Potri.006G237100在毛果楊木質(zhì)化組織中特異地、高豐度轉(zhuǎn)錄表達(dá)。實(shí)驗(yàn)構(gòu)建pGWB5-Potri.006G237100載體，轉(zhuǎn)化擬南芥、分子鑒定得到5個(gè)過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，激光共聚焦分析顯示融合蛋白Potri.006G237100-GFP定位在轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞質(zhì)。

環(huán)化酶；組織表達(dá)模式；Potri.006G237100；蛋白定位；楊樹

環(huán)化酶是一種催化核苷三磷酸生成環(huán)核苷酸的酶，廣泛存在于動物、植物、微生物[1]。環(huán)化酶編碼基因呈現(xiàn)基因家族特征，在植物中存在多種類型，參與植物的多種生物學(xué)功能。研究報(bào)道，水稻的一類環(huán)化酶通過控制活性氧水平參與逆境脅迫[2]。番茄紅素ε-環(huán)化酶基因過量表達(dá)與光合作用有關(guān)[3]，番茄紅素β-環(huán)化酶基因參與小麥β-胡蘿卜素生物合成[4]。丙二烯環(huán)化酶基因參與作物的耐鹽性，過量表達(dá)該基因增加水稻在高鹽度環(huán)境下生物量[5]，這種功能在小麥中也有類似報(bào)道[6]。然而，環(huán)化酶基因在樹木中的研究信息卻報(bào)道甚少。

在前期研究中分離了一個(gè)楊樹環(huán)化酶基因Potri.006G237100，推測它可能參與木材形成。為了鑒定該基因的功能，采用半定量RT-PCR分析Potri.006G237100的組織中表達(dá)特性，及其轉(zhuǎn)錄水平與莖木質(zhì)化程度同步情況。此外，通過融合綠色熒光蛋白GFP策略，分析Potri.006G237100-GFP融合蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株細(xì)胞內(nèi)的定位。以期對今后解析楊樹Potri.006G237100在木材形成上作用提供重要的基礎(chǔ)信息。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料從頂端向基部分別取毛果楊第1至第10莖節(jié)以及木質(zhì)部、形成層、韌皮部、幼葉、老葉、葉柄、頂芽和根各組織，用于鑒定目標(biāo)基因的組織表達(dá)特性。Columbia野生型擬南芥即WT作為遺傳轉(zhuǎn)化環(huán)化酶基因Potri.006G237100所需的擬南芥材料。

1.1.2載體和試劑載體：pENTR/SD/D-TOPO載體、LR Clonase載體、GWB5、pGWB2；主要試劑：植物基因組DNA提取試劑、DNA Marker、dNTP、pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶和PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser試劑盒。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1植物總RNA提取及cDNA合成植物樣品材料經(jīng)液氮速凍、研碎至粉末，移入1.5 mL離心管內(nèi)，按0.1 g樣品加入0.5 mL pBIOZOL試劑，具體操作參照pBIOZOL試劑說明書。用不含核糖核酸酶水溶解總RNA，測定濃度和純度。總cDNA合成使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser試劑盒，操作步驟參照其說明書。

1.2.2引物設(shè)計(jì)及序列Potri.006G237100基因所需擴(kuò)增片段長度為507 bp，引物序列為：cds-UP：5′-ATGG CAGAAGAAACACCACAGAT-3′；cds-DN：5′- ACCC GATAGGA CATC CTGTTCCA-3′。內(nèi)參基因ACT引物序列為：UP5′-CCCAGTGTTGTTGGTAGGCCA AGAC-3′；DN5′-CATAGCGGGAGAGTTAAAGGTCTC-3′。

1.2.3PCR擴(kuò)增總體系為20 μL，水13 μL，模板1.0 μL，Taq DNA聚合酶1.0 μL，dNTP 2.0 μL，10×Buffer 2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 5 min，變性95℃ 30 s，引物退火均為62℃ 30 s、72℃ 30 s，擴(kuò)增30循環(huán)，72℃延伸7 min，16℃保存。1.2.4植物表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥取30～60 ng基因片段和pENTR/SD/D-TOPO載體進(jìn)行連接反應(yīng)，體系為5 μL、反應(yīng)時(shí)間2 h。取1 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，通過菌落PCR擴(kuò)增進(jìn)行陽性菌落篩選，并結(jié)合DNA測序。將帶有目的基因片段pENTR/SD/D-TOPO質(zhì)粒與pGWB5植物表達(dá)載體LR反應(yīng)，反應(yīng)體系2.5 μL、反應(yīng)時(shí)間8～12 h，取1 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過菌落PCR鑒定陽性菌落，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌。擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌蘸花法，操作參見文獻(xiàn)[7]。

1.2.5植物基因組DNA提取擬南芥基因組DNA提取方法參見文獻(xiàn)[8]。

1.2.6綠色熒光蛋白GFP檢測在1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)6 d的幼苗被用于GFP熒光檢測。使用Zeiss LSM700激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行GFP熒光觀察和拍照，激發(fā)波長設(shè)定為488 nm。

2　結(jié)果與分析

2.1環(huán)化酶Potri.006G237100基因表達(dá)分析

為了鑒定楊樹Potri.006G237100基因在楊樹各組織的表達(dá)情況，首先以毛果楊的木質(zhì)部、形成層、韌皮部、幼葉、老葉、葉柄、頂芽和根組織為模板，用該環(huán)化酶基因全長引物進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示：毛果楊Potri.006G237100基因在木質(zhì)部、根、葉柄組織中轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平最高，在韌皮部、老葉組織中轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平低于木質(zhì)部、葉柄、根組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，在形成層、幼葉和頂芽基本沒有轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)，同時(shí)，使用內(nèi)參基因ACT作為半定量RT-PCR內(nèi)標(biāo)，ACT基因擴(kuò)增數(shù)據(jù)顯示木質(zhì)部、形成層、韌皮部、幼葉、老葉、葉柄、頂芽、根組織各樣品cDNA模板濃度基本相同（圖1A）。

試驗(yàn)通過分析第1至第10莖節(jié)中的Potri.006G237100基因轉(zhuǎn)錄水平，以進(jìn)一步確定該基因轉(zhuǎn)錄水平與木質(zhì)化組織相關(guān)性。在第1第2莖節(jié)處Potri.006G237100基因轉(zhuǎn)錄水平幾乎檢測不到，從第3至第10莖節(jié)轉(zhuǎn)錄水平逐漸提高（圖1B）。由于第1節(jié)至第10毛果楊莖節(jié)呈現(xiàn)逐漸木質(zhì)化發(fā)育[9]，RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果表明：在木質(zhì)化程度高的莖節(jié)中Potri.006G237100基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平高，且它的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平與莖節(jié)木質(zhì)化程度同步。此外，用內(nèi)參基因ACT作為半定量RT-PCR內(nèi)參，結(jié)果顯示各樣品cDNA模板濃度基本相等（圖1）。

圖1　毛果楊不同組織的Potri.006G237100轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平

2.2Potri.006G237100植物表達(dá)載體構(gòu)建

以毛果楊總cDNA為模板，以Potri.006G237100基因全長基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到約為500 bp的片段長度（圖2A），該片段長度基本符合目的基因片段長度，確定是試驗(yàn)需要的目的片段。片段膠回收后與pENTR/SD/D-TOPO載體連接，得到重組質(zhì)粒pENTR/ SD/D-TOPO-Potri.006G237100（圖2A），經(jīng)質(zhì)粒DNA測序表明全長Potri.006G237100基因片段被插入到pENTR/SD/D-TOPO載體上。

通過LR反應(yīng)將pENTR/SD/D-TOPO載體上Potri.006G237100片段同源重組到pGWB5植物表達(dá)載體上，重組質(zhì)粒pGWB5-Potri.006G237100經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖2B）。以該質(zhì)粒DNA為模板，加入Potri.006G237100基因引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)約500 bp特異帶，與目標(biāo)基因片段大小相符（圖2B）。這表明Potri.006G237100基因已經(jīng)與植物表達(dá)載體pGWB5融合。由于pGWB5載體帶有報(bào)告基因GFP，得到Potri.006G237100-GFP基因（C端融合GFP）。

2.3轉(zhuǎn)Potri.006G237100-GFP基因擬南芥鑒定

將Potri.006G237100-GFP基因遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，通過卡那霉素篩選得到抗卡那霉素植株5株。為了分析這5個(gè)株系是否過量表達(dá)Potri.006G237100-GFP基因，提取各株系RNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過半定量RT-PCR鑒定Potri.006G237100基因轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果如圖3所示，在未轉(zhuǎn)入外源基因的野生型擬南芥中沒有擴(kuò)增出目的基因帶，而在5個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中均擴(kuò)增出特異的目的帶。以擬南芥內(nèi)參基因ACT作為半定量RT-PCR內(nèi)標(biāo)，ACT基因擴(kuò)增結(jié)果顯示野生型與各轉(zhuǎn)基因株系樣品cDNA模板濃度基本相同（圖3）。PCR循環(huán)數(shù)顯示轉(zhuǎn)基因植株過量表達(dá)了目的基因，由此判斷，該基因成功轉(zhuǎn)入擬南芥及在轉(zhuǎn)基因擬南芥中呈現(xiàn)出高豐度的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖2　pGWB5-Potri.006G237100植物表達(dá)載體構(gòu)建

圖3　轉(zhuǎn)Potri.006G237100-GFP基因擬南芥RT-PCR分析

2.4Potri.006G237100-GFP融合蛋白細(xì)胞內(nèi)定位分析

已有數(shù)據(jù)顯示Potri.006G237100特異在楊樹木質(zhì)化組織內(nèi)表達(dá)，其功能應(yīng)該參與木材（次生細(xì)胞壁）形成。鑒于此，試驗(yàn)分析Potri.006G237100-GFP融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位。用激光共聚焦顯微鏡檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥根中GFP熒光信號，結(jié)果顯示：信號集中在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在周質(zhì)區(qū)域也有少量信號分布（圖4）。這一結(jié)果表明，Potri.006G237100-GFP融合蛋白并沒有定位在細(xì)胞壁。

圖4　轉(zhuǎn)Potri.006G237100-GFP蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位

3　結(jié)論與討論

環(huán)化酶基因廣泛地存在于生物體，在植物中一些環(huán)化酶基因被認(rèn)為參與逆境脅迫[2，5]。研究中RT-PCR數(shù)據(jù)顯示，楊樹環(huán)化酶基因Potri.006G237100在木質(zhì)化組織中特異地、高豐度轉(zhuǎn)錄表達(dá)，特別是在木質(zhì)部、葉柄、根中高豐度轉(zhuǎn)錄表達(dá)，相關(guān)基因在木質(zhì)部高豐度表達(dá)[10]，而木質(zhì)部是植物木質(zhì)化程度發(fā)育最快的部位，因此推測Potri.006G237100基因可能與楊樹次生生長有關(guān)。樹木木材是次生組織生長發(fā)育形成的，次生壁形成是其中的主要特征。基于這點(diǎn)，分析了該環(huán)化酶在細(xì)胞內(nèi)的定位。數(shù)據(jù)顯示Potri.006G237100定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，卻不是定位于細(xì)胞壁，這一結(jié)果暗示這個(gè)環(huán)化酶可能不是直接參與次生壁形成的。在生物體內(nèi)環(huán)化酶種類較多，其作用的底物種類可能較多，然而其參與的生理功能被了解得很少。要確定楊樹環(huán)化酶Potri.006G237100是否參與木材形成，敲除該基因、分析其突變體遺傳表型無疑是一種非常有效的方式。

[1] 張 霞，范可強(qiáng)，李紅玉，等. 芳香聚酮早期后修飾環(huán)化酶的結(jié)構(gòu)分類和功能分析[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2010，50（5）：561-567.

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（責(zé)任編輯：夏亞男）

Gene?Expression?Pattern?and?Subcellular?Localization?of?Populus Trichocarpa?Cyclase

JIA Zhi-gang，XIA De-an，LI Shu-juan
（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin150040, PRC）

Semi-quantitative RT-PCR analysis showed that Potri.006G237100 gene transcripts are very low in cambium， young leaf and apical bud of Populus trichocarpa， but high in xylem， petiole and root. Also， high abundance of Potri.006G237100 gene transcripts was detected in lignifying stems. These data suggest that Potri.006G237100 gene is specifically and abundantly expressed in the lignifying tissues of P. trichocarpa. In addition， the DNA fragement of Potri.006G237100 gene was constructed into plant expression vector pGWB5 and transformed into Arabidopsis plant. Five transgenic plants were attained through molecular identification. Confocal laser scanning microscope analysis suggested that Potri.006G237100-GFP fusion protein is located in the cytoplasm of transgenic plants.

cyclase; tissue expression pattern; Potri.006G237100; protein localization; Populus trichocarpa

S792.11

A

1006-060X（2016）10-0001-03

2016-08-01

國家“863”計(jì)劃課題（2013AA102702）

賈志剛（1989-），男，河北衡水市人，碩士研究生，研究方向?yàn)榱帜具z傳育種。

李淑娟