HPLC法同時(shí)測(cè)定益膚丸中香豆素類化合物的含量

李小玲，刁娟娟，李新霞#（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊 83008；.新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室分析測(cè)試中心，烏魯木齊 830011）

HPLC法同時(shí)測(cè)定益膚丸中香豆素類化合物的含量

李小玲1＊，刁娟娟2，李新霞2#（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊 830028；2.新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室分析測(cè)試中心，烏魯木齊 830011）

目的：建立同時(shí)測(cè)定益膚丸中香豆素類化合物含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Inertsil ODS-3，流動(dòng)相為乙腈-水（49∶51，V/V），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長為320 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果：蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為5.16～206.4 μg/ml（r=0.999 9）、37.40～1 495.89 μg/ml（r=0.999 9）、9.95～318.34 μg/ml（r=0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3.0%；加樣回收率分別為96.05%～103.19%（RSD=2.18%，n= 9）、96.90%～103.09%（RSD=2.07%，n=9）、95.50%～103.57%（RSD=2.15%，n=9）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性較好，可用于益膚丸中香豆素類化合物含量的同時(shí)測(cè)定。

益膚丸；蛇床子素；異歐前胡素；二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯；含量測(cè)定；高效液相色譜法

益膚丸由黨參、羌活、獨(dú)活等16味中藥材組成，具有健脾化濕、活血潤膚止癢的功效，常用于慢性濕疹、銀屑病、神經(jīng)性皮炎、皮膚瘙癢等癥的治療，原方以煎劑在臨床使用多年，因其療效顯著，后制成丸劑作為新疆昌吉州中醫(yī)院的院內(nèi)中藥制劑，目前尚無質(zhì)量可控方法。存在于益膚丸中的羌活、獨(dú)活均有祛風(fēng)除濕、止痛抗炎作用，而產(chǎn)生該藥理活性的物質(zhì)主要為香豆素類化合物［1-2］。異歐前胡素、蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯［3］分別為羌活和獨(dú)活中的香豆素類化合物，其含量的多少與益膚丸藥效有一定的聯(lián)系。因此，本研究利用高效液相色譜法（HPLC）在同一色譜條件下同時(shí)測(cè)定以上3種香豆素類化合物的含量，建立含量測(cè)定方法，從而確定量效關(guān)系，為益膚丸質(zhì)量控制方法的建立提供更加準(zhǔn)確的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型HPLC儀，包括SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器（日本Shimadzu公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz）；AB135-S型分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

益膚丸（新疆昌吉回族自治州中醫(yī)醫(yī)院自制，批號(hào)：20140201、20140202、20140301，規(guī)格：60 g/瓶）；蛇床子素對(duì)照品（批號(hào)：110822-201308，純度：100%）、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品（批號(hào)：111583-201304，純度：98.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；異歐前胡素對(duì)照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：A0012，純度：≥99%）；乙腈為色譜純，甲醇、95%乙醇均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（49∶51，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長：320 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取蛇床子素對(duì)照品10.32 mg，置于50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為206.4 μg/ml的蛇床子素對(duì)照品貯備液；精密稱取異歐前胡素對(duì)照品15.11 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為1 495.8 μg/ml的異歐前胡素對(duì)照品貯備液；精密稱取二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品10.12 mg，置于25 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為397.92 μg/ml的二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品貯備液。分別精密吸取上述蛇床子素對(duì)照品貯備液2.5 ml、異歐前胡素對(duì)照品貯備液0.6 ml、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品貯備液0.5 ml，置于同一10 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品5 g，加硅藻土2.5 g，研勻，置圓底燒瓶中，加甲醇75 ml，加熱回流45 min，濾過，再加甲醇50 ml，加熱回流0.5 h，濾過，合并濾液，濾液蒸干，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按益膚丸處方比例和制備工藝制備缺羌活、獨(dú)活的陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，蛇床子素的保留時(shí)間約為33 min，理論板數(shù)為19 619；分離度為1.7，拖尾因子為1.05。異歐前胡素的保留時(shí)間約為38 min，理論板數(shù)為18 984；分離度為1.6，拖尾因子為1.04。二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的保留時(shí)間約為42 min，理論板數(shù)為19 553；分離度為1.7，拖尾因子為0.99。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.蛇床子素；2.異歐前胡素；3.二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control；1.osthole；2.isoimperatorin；3.columbianadin

2.4 線性關(guān)系考察

分別量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為5.16、10.32、20.64、51.6、103.2、206.4 μg/ml的系列蛇床子素對(duì)照品溶液，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為37.40、74.79、149.59、299.18、747.95、1 495.89 μg/ml的系列異歐前胡素對(duì)照品溶液，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為9.95、19.90、39.79、79.58、159.17、318.34 μg/ml的系列二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯回歸方程分別為y=72 898.611x+ 2 858.811 5（r=0.999 9）、y=56 920.295 1x+89 098.993 5（r=0.999 9）、y=53 724.346 8x+8 786.074 6（r=0.999 9）。結(jié)果表明，蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為5.16～206.4、37.40～1 495.89、9.95～318.34 μg/ml。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯峰面積的RSD分別為2.87%、1.07%、2.98%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20140201）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、15、18、21、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，蛇床子素、異歐前胡素在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，其峰面積的RSD分別為1.43%、0.98%（n=9）；二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯在15 h內(nèi)基本穩(wěn)定，其峰面積的RSD=1.31%（n=9），超過15 h后發(fā)生降解，其峰面積增大，RSD=29.4%。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：20140201）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含量平均值分別為131.26、236.57、52.92 μg/g，RSD分別為2.16%、1.57%、2.15%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（批號(hào)：20140201）適量，共6份，分別加入低、中、高含量的蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab 1 Results of recovery tests（n=9）

續(xù)表1Continued Tab 1

2.9 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3，μg/g）Tab 2 Results of content determination of samples（n=3，μg/g）

3 討論

本試驗(yàn)因在同一色譜條件下同時(shí)測(cè)定益膚丸中蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯3種化合物，綜合2015年版《中國藥典》（一部）和相關(guān)文獻(xiàn)方法［3-6］，最終確定采用文中色譜條件。

益膚丸中二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯穩(wěn)定性差，故用于益膚丸中香豆素類化合物含量測(cè)定的供試品溶液應(yīng)在檢測(cè)前臨時(shí)制備。考慮到樣品中化合物的穩(wěn)定性，提取和濾液蒸干時(shí)，溫度應(yīng)不超過80℃，以避免熱不穩(wěn)定成分的降解。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性較好，可用于益膚丸中香豆素類化合物含量的同時(shí)測(cè)定。

［1］李云霞，高春華，沙明.中藥羌活化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，6（1）：22.

［2］段志富，陳建偉，李祥.傘形科藥用植物中香豆素類成分及其藥理作用研究現(xiàn)狀［J］.中國藥房，2008，19（3）：223.

［3］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：182.

［4］胡太德，陳紹成，譚君.重慶道地藥材獨(dú)活與全國其他產(chǎn)區(qū)獨(dú)活主要藥效成分含量對(duì)比研究［J］.中國藥房，2015，26（33）：4 711.

［5］段紅，翟科峰，曹穩(wěn)根，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選祛風(fēng)止痛片中制草烏、獨(dú)活的合提工藝［J］.中成藥，2010，32（8）：1 421.

［6］謝惠艷，王英豪，王蓉蓉，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選羌活-獨(dú)活藥對(duì)的合提工藝［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（12）：10.

（編輯：張 靜）

Simultaneous Determination of Coumarin Compounds in Yifu Pill by HPLC

LI Xiaoling1，DIAO Juanjuan2，LI Xinxia2（1.Dept.of Pharmacy，the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830028，China；2.Analysis and Testing Center of Central Laboratory，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of coumarin compounds in Yifu pill.METHODS：HPLC was performed on the column of Inertsil ODS-3 with mobile phase of acetonitrile-water（49∶51，V/V）at a flow rate was 1.0 ml/min，the detection wavelength was 320 nm，column temperature was 30℃，injection volume was 20 μl.RESULTS：The linear range was 5.16-206.4 μg/ml for osthole（r=0.999 9），37.40-1 495.89 μg/ml for isoimperatorin（r=0.999 9）and 9.95-318.34 μg/ml for columbianadin（r=0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3.0%；recoveries were 96.05%-103.19%（RSD=2.18%，n=9）for osthole，96.90%-103.09%（RSD=2.07%，n=9）for isoimperatorin，95.50%-103.57%（RSD=2.15%，n=9）for columbianadin.CONCLUSIONS：The method is simple with good precision，stability and reproducibility，and can be used for the simultaneous determination of coumarin compounds in Yifu pill.

Yifu pill；Osthole；Isoimperatorin；Columbianadin；Content determination；HPLC

R917

A

1001-0408（2016）30-4299-03

2015-10-19

2016-02-04）

＊主管藥師。研究方向：中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：0991-4609105。E-mail：lixiaoling008@sohu.com

#通信作者：教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：新藥研發(fā)。電話：0991-4365034。E-mail：LXX6668@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.30.40