馴鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定

韓一嘯 周 偉 賈 敏 祝令偉 紀(jì) 雪孫 洋 劉 軍 王海軍 郭學(xué)軍*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長(zhǎng)春，130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春，130122；3.吉林省野生動(dòng)物救護(hù)繁育中心，長(zhǎng)春，130122)

馴鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定

韓一嘯1，2周 偉2賈 敏2祝令偉2紀(jì) 雪2孫 洋2劉 軍2王海軍3郭學(xué)軍2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長(zhǎng)春，130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春，130122；3.吉林省野生動(dòng)物救護(hù)繁育中心，長(zhǎng)春，130122)

修回日期：2016-03-14

發(fā)表日期：2016-05-10

馴鹿；

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)又稱(chēng)魏氏梭菌，是一種革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)芽孢桿菌，廣泛分布在土壤、污水、飼料、食物和糞便等環(huán)境樣本中，能引起多種動(dòng)物壞死性腸炎、腸毒血癥及人類(lèi)食物中毒和創(chuàng)傷性氣性壞疽，是一種重要的人獸共患病原菌[1]。魏氏梭菌能產(chǎn)生多種外毒素，根據(jù)其產(chǎn)生的主要毒素(α、β、ε、ι)可將菌株分為A、B、C、D和E等5種毒素型[2]。該菌在全球范圍內(nèi)流行，能感染牛、羊、豬、家兔等多種家養(yǎng)動(dòng)物，也有野生動(dòng)物如大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)、鹿(Cervidae)、獅(Pantheraleo)、牦牛(Bosgrunniens)等感染產(chǎn)氣莢膜梭菌的報(bào)道，其中以A型毒素型流行最廣[3-4]。目前在臨床上尚無(wú)有效的治療方法，發(fā)病迅猛，一旦發(fā)病，多數(shù)來(lái)不及治療均以死亡告終。

馴鹿(Rangifertarandus)主要分布于北半球的環(huán)北極地區(qū)，包括在歐亞大陸和北美洲北部及一些大型島嶼。在中國(guó)馴鹿只見(jiàn)于大興安嶺東北部林區(qū)。馴鹿不僅具有很高藥用和食用價(jià)值，而且具有一定的旅游和文化價(jià)值。馴鹿非常溫順，是唯一可以用于使役的鹿科動(dòng)物，鄂溫克族就會(huì)使用馴鹿作為交通工具[5]。馴鹿已被列入中國(guó)國(guó)家林業(yè)局2000年8月1日發(fā)布的《國(guó)家保護(hù)的有益的或者有重要經(jīng)濟(jì)、科學(xué)研究?jī)r(jià)值的陸生野生動(dòng)物名錄》中。

2015年5月，本實(shí)驗(yàn)室從猝死馴鹿的肝、脾、腎、血的樣本中分離獲得一株產(chǎn)氣莢膜梭菌，進(jìn)行了毒素型鑒定，為野生動(dòng)物疾病防控提供了參考病例數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

無(wú)菌采集猝死馴鹿的血、腎、肝和脾編號(hào)為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)，低溫保存送回實(shí)驗(yàn)室，制作觸片革蘭氏染色鏡檢。

1.2 病原鑒定

1.2.1 培養(yǎng)特性鑒定

依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.13-2012《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)》，厭氧培養(yǎng)的情況下在胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)瓊脂平板上生長(zhǎng)黑色菌落，接種到液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG)可觀察到大量產(chǎn)氣的現(xiàn)象，初步判定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

分別取血、腎、肝和脾樣本分別劃線(xiàn)接種含5%兔血瓊脂平板、TSC瓊脂平板和FTG液體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)12 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定

挑取TSC瓊脂平板上生長(zhǎng)的黑色菌落接種FTG液體培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)，取1 mL純培養(yǎng)液離心收集菌體，經(jīng)滅菌生理鹽水洗滌2遍后，用200 μL滅菌蒸餾水重懸，水浴煮沸10 min作為PCR模板。由長(zhǎng)春庫(kù)美生物公司合成細(xì)菌16S rRNA通用引物[6]，產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素、β毒素、ε毒素、ι毒素、腸毒素、β2毒素特異性引物[7]，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序比對(duì)分析，血清型PCR結(jié)果可根據(jù)表1進(jìn)行判定[8]。

表1產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素型

Tab.1 Toxin types of Clostridium perfringens

1.3 藥敏試驗(yàn)

取新鮮液體純培養(yǎng)物0.1 mL均勻涂布TSC瓊脂培養(yǎng)基上，正面放置待菌液完全吸收后，無(wú)菌夾取頭孢吡肟、頭孢匹羅、頭孢曲松、吡利霉素、頭孢他啶、氨曲南、左氧氟沙星、四環(huán)素、阿莫西林、環(huán)丙沙星、阿米卡星、氨芐青霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑藥敏試紙片(購(gòu)自寶泰克)置于培養(yǎng)基上壓實(shí)，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，量取抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 病情報(bào)告

某動(dòng)物園雄性馴鹿，4歲，身體狀況良好，2014年9月引進(jìn)。白天園區(qū)內(nèi)散養(yǎng)，夜晚補(bǔ)飼青草、花生殼、苔蘚、玉米面、豆餅、胡蘿卜和蘋(píng)果。在2015年4月22晚未正?；厝?，23日7：00發(fā)現(xiàn)已死亡。尸體表觀特點(diǎn)為腹脹、肛門(mén)四周污穢、鼻孔有血性黏液。剖檢皮下出血、腸管破裂、腹腔有大量腸內(nèi)容物、大腸段腸壁薄、脾臟腫大、肝臟土黃色、心包積血、肺充血。

2.2 鏡檢觀察

對(duì)血、腎、肝和脾制作的觸片進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。均可見(jiàn)革蘭氏陽(yáng)性、菌體兩端鈍圓、呈粗桿狀、單個(gè)、成雙或者成短鏈狀存在，個(gè)別菌體有芽孢(圖1)，芽孢不大于菌體寬度，為單極芽孢，革蘭氏染色不能著色。

圖1 本試驗(yàn)中樣本革蘭氏染色Fig.1 Sample gram staining in this experiment

2.3 病原分離與鑒定

2.3.1 TSC瓊脂平板黑色菌落觀察

依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.13-2012《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)》，產(chǎn)氣莢膜梭菌在厭氧培養(yǎng)條件下在胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)瓊脂平板上生長(zhǎng)黑色菌落，可初步判定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。該菌僅在厭氧條件下生長(zhǎng)為專(zhuān)性厭氧菌，將血、腎、肝和脾樣本分別劃線(xiàn)接種于TSC瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)12 h，均可見(jiàn)到有大量表面光滑、正圓形、球狀突起的黑色菌落生長(zhǎng)(圖2)。

圖2 在TSC瓊脂平板上長(zhǎng)出的黑色菌落Fig.2 The black colony on TSC agar

2.3.2 FTG液體培養(yǎng)產(chǎn)氣情況觀察

在TSC瓊脂平板上挑取黑色單菌落接種于FTG液體，培養(yǎng)約12 h，可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)并伴有輕微產(chǎn)氣現(xiàn)象。

2.3.3 血瓊脂平板實(shí)驗(yàn)

將分離菌株劃線(xiàn)接種于5%兔鮮血瓊脂平板厭氧培養(yǎng)12 h后，形成灰白色的圓整、表面濕潤(rùn)、黏稠、隆起的菌落，大小約1.5～2.0 mm，菌落周?chē)孰p環(huán)溶血(圖3)。

圖3 血瓊脂平板實(shí)驗(yàn)Fig.3 The test od blood agar plate

2.4 分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 細(xì)菌16S rRNA

細(xì)菌16S rRNA基因產(chǎn)物由長(zhǎng)春庫(kù)美生物公司測(cè)序，獲得1 357 bp目的片段序列，經(jīng)NCBI Blast同源性比對(duì)，與產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC 13124的同源性為100%。基于16S rRNA序列，采用MEGA 6.0(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖4。XL-1與產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13124親緣關(guān)系最近，與蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)ATCC11778、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC6633遺傳距離較遠(yuǎn)。

圖4 基于16S rRNA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 The phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence

2.4.2 血清型PCR鑒定

PCR檢測(cè)結(jié)果如圖5所示：陽(yáng)性對(duì)照為ATCC 13124 B型產(chǎn)氣莢膜梭菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，PCR檢測(cè)血液和各臟器僅有α目的條帶，表明本次分離菌株攜帶α毒素基因，為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

圖5 PCR檢測(cè)結(jié)果M：DL2 000；0：陽(yáng)性對(duì)照1-4：分別為血、腎、肝、脾分離的菌株Fig.5 PCR test resultsM：DL2 000；0：Positive control；1-4：The isolated strains were isolated from blood, kidney, liver and spleen.

2.5 藥敏試驗(yàn)

參照美國(guó)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)，比較抑菌圈直徑結(jié)果表明，分離菌株對(duì)頭孢替坦、吡利霉素、頭孢他啶、氨曲南敏感，對(duì)頭孢吡肟、阿米匹羅、頭孢曲松、左氧氟沙星中度敏感，對(duì)四環(huán)素、阿莫西林、環(huán)丙沙星、阿米卡星、氨芐青霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑耐藥(表2)。

表2 分離菌對(duì)14種抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn)

Tab.2 Fourteen antibiotic sensitivity test

注：根據(jù)1994年12月版美國(guó)NCCLS藥敏試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法法規(guī)判定:“S”敏感 “I”中介 “R”耐藥

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌在繁殖過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種毒素蛋白，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)12種毒素，根據(jù)產(chǎn)生的毒素不同，可將其分為A型、B型、C型、D型、E型5個(gè)血清型。其中A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病因子是其產(chǎn)生的α毒素，α毒素可通過(guò)破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，從而使A型產(chǎn)氣莢膜梭菌具有細(xì)胞毒性、溶血性、致死性和皮膚壞死性等特性[9]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種條件性致病菌，其發(fā)病原因與菌株特性和環(huán)境因素密切相關(guān)。該菌株在自然界中分布廣泛，形成芽孢以后對(duì)自然環(huán)境的抵抗能力較強(qiáng)，可長(zhǎng)期存在于土壤中，當(dāng)畜舍環(huán)境衛(wèi)生條件較差時(shí)，動(dòng)物采食了被產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的飼草或飲用水后，可引發(fā)此病[10]。正常情況下，在動(dòng)物的腸道中存在一定數(shù)量的魏氏梭菌，腸道內(nèi)容物的酸堿度和氧飽和度等內(nèi)環(huán)境因素的變化會(huì)影響魏氏梭菌的繁殖。而腸道內(nèi)環(huán)境的變化易受食物成分、動(dòng)物年齡、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)狀況、飼養(yǎng)環(huán)境溫度突變的影響，如動(dòng)物過(guò)量采食高蛋白和高能量的食物，采食粗纖維飼料少，導(dǎo)致消化不良，都可為腸道內(nèi)魏氏梭菌增殖和毒素生成提供營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)[11]。該病暴發(fā)時(shí)危害嚴(yán)重，發(fā)病急，病程短，動(dòng)物常未見(jiàn)癥狀即突然死亡[12]。感染魏氏梭菌的家畜臨床癥狀并不明顯，死亡后的尸體外觀出現(xiàn)腹脹明顯、肛門(mén)擴(kuò)張有少量粘液滲出，眼結(jié)膜紅等特征，主要的剖檢變化為心臟心肌纖維腫脹，有充血、壞死灶；肝臟壞死有色素顆粒沉著；脾臟腫大局部有出血及壞死；腎臟充血，壞死較嚴(yán)重；腸道十二指腸肌層薄，局部有凝固性壞死，大量散在的炎性細(xì)胞，絨毛層脫落，有出血、充血[13]。

本起疫情中的馴鹿死亡突然，根據(jù)尸體外觀變化和剖檢病變觀察，我們懷疑是由魏氏梭菌感染引起，為進(jìn)一步確診，進(jìn)行了病原分離培養(yǎng)及鑒定試驗(yàn)。從各臟器樣本中分離到有相同形態(tài)特征的菌落，后經(jīng)培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)及分子生物學(xué)特性觀察，最終判定導(dǎo)致馴鹿死亡的病原為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌，這與高文偉等[14]研究報(bào)道的引起鹿科動(dòng)物死亡的病原菌主要為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的結(jié)果一致。馴鹿發(fā)病在晝夜溫差相對(duì)較大的4月，再加上馴鹿采食過(guò)量易導(dǎo)致其腸道內(nèi)魏氏梭菌大量繁殖，這可能是致其猝死的主要原因。

產(chǎn)氣莢膜梭菌病死亡癥狀與一些化學(xué)物質(zhì)中毒有很多相似之處，容易被診斷為化學(xué)物質(zhì)中毒[15]。另外，該病的突然死亡特征與炭疽也有相似之處，所以必須要進(jìn)行細(xì)菌學(xué)、毒物學(xué)檢查來(lái)進(jìn)行確診。由于存在細(xì)菌耐藥性問(wèn)題，通過(guò)藥敏實(shí)驗(yàn)篩選合適的藥物治療，是十分必要的。此次分離出的菌株對(duì)頭孢替坦、吡利霉素、氨曲南等藥物敏感，這與艾地云等[16]和寇敘等[17]的分離菌株藥敏結(jié)果存在著差異，在每次疫情防控中，需要針對(duì)流行菌株檢測(cè)其藥物敏感性，選用合適的藥物來(lái)進(jìn)行治療。此次病情發(fā)生在馴鹿身上，雖然國(guó)內(nèi)對(duì)從野生大動(dòng)物中分離出產(chǎn)氣莢膜梭菌的情況有少量報(bào)道，但就我們所知，這是首次報(bào)道產(chǎn)氣莢膜梭菌致死馴鹿的病例，這表明產(chǎn)氣莢膜梭菌不僅能引起家畜發(fā)病死亡，也能引起野生動(dòng)物發(fā)病死亡。有關(guān)部門(mén)應(yīng)予以重視并采取必要的預(yù)防措施，希望本次檢測(cè)結(jié)果對(duì)今后馴鹿產(chǎn)氣莢膜梭菌感染研究提供有力參考。

[1] Miwa N，Masuda T，Terai K，et al.Bacteriological investigation of an outbreak ofClostridiumperfringensfood poisoning caused by Japanese food without animal protein [J].International Journal of Food Microbiology，1999，49(1)：103-106.

[2] 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001：318-320.

[3] 李云霄，金鑫，張營(yíng)，等.魏氏梭菌病診斷方法研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28(7)：88-93.

[4] 張紅英，盧中華，楊霞，等.我國(guó)魏氏梭菌病的流行特點(diǎn)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2004，31(1)：39-41.

[5] 卡麗娜.論馴鹿鄂溫克人的馴鹿文化[J].黑龍江民族叢刊，2007，97(2)：174-178.

[6] Weisburg W G，Barns S M，Pelletier D A，et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].Journal of Bacteriology，1991，173(2)：697-703.

[7] 張小榮，文其乙，劉秀梵，等.應(yīng)用多重PCR快速診斷山羊猝死癥的研究[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2002，32(3)：10-12.

[8] Rood J I，Cole S T.Molecular genetics and pathogenesis ofClostridiumperfringen[J].Microbiological Reviews，1991，55(4)：621-648.

[9] 許崇波.A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素分子生物學(xué)的研究進(jìn)展[J].寧夏大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，23(2)：188-192.

[10] 鄭曉麗，宋振銀，倪學(xué)勤，等.產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)家禽業(yè)的危害及其預(yù)防[J].中國(guó)家禽，2008，30(24)：67-71.

[11] 王鳳陽(yáng)，范泉水.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2007：302-304.

[12] 侯安祖，盧中華，王自振，等.家畜魏氏梭菌病的診斷和防制[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，1998，24(10)：12-14.

[13] 張成林，劉燕，閆鶴，等.麋鹿發(fā)生C型魏氏梭菌病[J].野生動(dòng)物，2012，33(5)：260-263.

[14] 高文偉，吳永春.產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，28(1)：64-68.

[15] 黃建華，陳松明.德國(guó)牧羊犬魏氏梭菌毒素中毒引起猝死的診斷報(bào)告[J].畜牧與獸醫(yī)，2013，45(2)：109-110.

[16] 艾地云，邵華斌，張騰飛，等.雞產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35(6)：149-152.

[17] 寇敘，劉永華，唐雨順，等.一起兔產(chǎn)氣莢膜梭菌病爆發(fā)流行及病原體的分離鑒定[J].微生物學(xué)雜志，2014，34(1)：104-106.

Reindeer；Clostridiumperfringens；Pathogen isolation and identification

IsolationandIdentificationofClostridiumperfringensfromaReindeer

HanYixiao1，2ZhouWei2JiaMin2ZhuLingwei2JiXue2SunYang2LiuJun2WangHaijun3GuoXuejun2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，JilinAgriculturalUniversity，Changchun，130118，China；2.InstituteofMilitaryVeterinary，AMMS，KeylaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl，Changchun，130122，China；3.JilinWildAnimalConservationandBreedingCenter，Changchun，130122，China)

A farmed reindeer died suddenly.According to its body appearance and autopsy lesions，we suspected that the reindeer was infected byClostridumperfringens.In order to further confirmed the causes，the liver，spleen，kidney and blood samples from the dead reindeer were collected.AClostridiumperfringenstype A strain was recovered.The strain(XL-1)was then evaluated by cultural characteristics，colony morphology，molecular biology.Drug sensitivity tests showed that XL-1 was sensitive to cefotetan，ceftazidime and aztreonam.

稿件運(yùn)行過(guò)程

2016-01-05

產(chǎn)氣莢膜梭菌；

病原分離鑒定

S858.9

A

2310-1490(2016)02-113-05

某動(dòng)物園馴鹿死亡突然，根據(jù)其尸體外觀變化和剖檢病變觀察，懷疑為產(chǎn)氣莢膜梭菌感染，為進(jìn)一步確診，進(jìn)行了病原分離培養(yǎng)及鑒定試驗(yàn)。在猝死馴鹿的肝、脾、腎、血等樣本中分離獲得1株革蘭氏陽(yáng)性桿菌(編號(hào)XL-1)。經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)特性鑒定、菌落形態(tài)觀察、分子生物學(xué)鑒定，確定分離菌為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。藥敏實(shí)驗(yàn)顯示，XL-1對(duì)頭孢替坦、頭孢他啶、氨曲南等藥物敏感。

國(guó)家“863”項(xiàng)目(2012AA022006)；軍隊(duì)醫(yī)藥衛(wèi)生課題(13CXZ024)

韓一嘯，男，26歲，碩士研究生；主要從事分子細(xì)菌學(xué)的研究工作。E-mail：15144218386@163.com

*通訊作者：郭學(xué)軍，E-mail：xuejung@yahoo.com