環(huán)尾狐猴源弓形蟲的檢測與鑒定

單 芬 李康信 徐春忠 陳 武* 彭仕明 李婉萍 李國清*

(1.廣州動物園，廣州，510070；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州，510642；3.上海市野生動物園有限公司，上海，201300)

環(huán)尾狐猴源弓形蟲的檢測與鑒定

單 芬1李康信2徐春忠3陳 武1*彭仕明1李婉萍1李國清2*

(1.廣州動物園，廣州，510070；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州，510642；3.上海市野生動物園有限公司，上海，201300)

環(huán)尾狐猴；

為了確定引起廣東環(huán)尾狐猴(Lemurcatta)呼吸困難、厭食和出血性肺炎癥狀的病原，從2只死亡的環(huán)尾狐猴體內(nèi)無菌采集心肝肺腎組織樣本。通過病原形態(tài)學(xué)觀察，鑒定為弓形蟲(Toxoplasmasp.)后，另外采集在狐猴籠舍出現(xiàn)的2只老鼠和1只貓4份組織樣本。所有樣本分別采用熒光定量PCR及一步法PCR技術(shù)進行弓形蟲的檢測與529 bp重復(fù)序列分析。以弓形蟲B1基因片斷為擴增對象的熒光定量PCR檢測顯示6份樣本的CT為25.84～30.29，溶解曲線中均出現(xiàn)明顯峰值，核酸定量峰值均大于陽性對照。用一步法PCR自6份樣本中均擴增出529 bp目的片段，測序和Blast分析顯示，該目的片段與GenBank中登錄號為KC607824和DQ779189的剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)核苷酸序列相似性最高，均為98.7%；與國際標準強毒蟲株RH的核苷酸相似性為98.5%。這些結(jié)果表明，熒光定量PCR技術(shù)可以用于環(huán)尾狐猴弓形蟲病的快速診斷，本次環(huán)尾狐猴的死亡可能是由于弓形蟲的感染引起的，剛地弓形蟲可能由野貓與老鼠傳播。

剛地弓形蟲是一種細胞內(nèi)寄生原蟲，在分類上隸屬頂復(fù)門(Apicomplexa)、孢子蟲綱(Sporozoasida)、真球蟲目(Eucoccidiorida)、弓形蟲科(Toxoplasmatidae)、弓形蟲屬。弓形蟲呈世界性分布，目前人和200多種動物均可感染，貓是其終末宿主，人及其他動物均為中間宿主。弓形蟲病對人及動物的危害很大，孕婦感染弓形蟲后導(dǎo)致早產(chǎn)、流產(chǎn)、胎兒發(fā)育畸形，也是免疫功能低下患者(如AIDS病人等)死亡的主要原因。動物感染很普遍，但多數(shù)呈隱性感染[6]。對于弓形蟲病的診斷，國內(nèi)外學(xué)者作了多方面的探索，包括病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)診斷方法[7-8]。分子生物學(xué)診斷方法以其簡便、快速、特異、敏感等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于弓形體核酸的直接檢測。本研究就是采用熒光定量PCR及常規(guī)PCR方法對圈養(yǎng)疑似感染弓形蟲病急性死亡的環(huán)尾狐猴病例進行分子生物學(xué)診斷，為圈養(yǎng)環(huán)尾狐猴的弓形蟲病的診斷、治療和預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料組織

無菌采集2015年12月廣東某地圈養(yǎng)死亡的2只環(huán)尾狐猴(1♂1♀)心肝肺腎組織，另取在環(huán)尾狐猴籠舍出現(xiàn)且死亡的1只貓及2只老鼠的肺和淋巴組織，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

Taq酶、Buffer、MgCl2、dNTPs為大連寶生物公司產(chǎn)品；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒為諾唯贊生物科技公司產(chǎn)品；TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒為天根公司產(chǎn)品；TaKaRa Agarose Gel DNA Purification試劑盒為大連寶生物公司產(chǎn)品。pGEM-T載體質(zhì)粒和感受態(tài)細胞DH5α均為天根生物技術(shù)公司產(chǎn)品。TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 4.0質(zhì)粒提取試劑盒為大連寶生物公司的產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 環(huán)尾狐猴發(fā)病癥狀的觀察、病理變化與蟲體的分離鑒定

那一路日本兵過江后，就直奔沈家大院而來了。沈老七不得不開門把日本人迎進院里。那個挎著長刀的日本軍官嘰里咕嚕幾句后，幾個日本兵就又出院門去了，一會兒后他們就牽來了幾頭大黃牛。那群日本兵將牛的腿腳綁在院門外的柳樹上，就開始用軍刀在牛屁股、牛腿上割肉，那牛就“哞哞”慘叫，血不斷線地往下流。那些割下來的活牛肉放在砧板上還跳得老高，像是還有生命樣的。他們把這些牛肉褪去皮毛，就在沈家大院架火燒烤。吃完了又去割。

觀察記錄環(huán)尾狐猴的發(fā)病癥狀。在環(huán)尾狐猴出現(xiàn)死亡時，解剖狐猴，觀察器官的病理變化，將發(fā)病死亡動物的心、肺等臟器進行剪切并勻漿處理后加入適量鹽酸胃蛋白酶溶液于37℃搖床消化1 h。經(jīng)過濾、離心、中和等步驟，用滅菌生理鹽水制成1∶10混懸液每1 mL加青霉素和鏈霉素各1 000 U，腹腔接種小白鼠5只，每只小白鼠接種1 mL。接種后觀察，如小白鼠有皮毛松豎、弓背、閉目、腹部膨大、顫動或呼吸急促等癥狀，立即剖殺取腹水、肝、脾、腦等組織做涂片，姬姆薩染色鏡檢。如果接種小白鼠不發(fā)病則取小白鼠腦、心、肝、脾等組織按上法制成懸液繼續(xù)盲傳數(shù)代。另取病料進行細菌和病毒的分離培養(yǎng)。

1.2.2 病料組織的處理及DNA提取

將無菌采集的6份病料組織樣品分別置于新的1.5 mL Eppendorf管中，用滅菌的微型剪刀將病變組織剪碎，然后加入200 μL的Buffer GA反復(fù)研磨，再加入20 μL的蛋白酶K，混勻后，放于54℃恒溫水浴鍋中消化3～4 h(每30 min震蕩混勻1次)。消化好的組織懸液按TIANamp Genomic DNA Kit使用說明進行組織DNA提取，DNA樣品于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 熒光定量PCR

根據(jù)GenBank中弓形蟲各株中最為保守的B1基因設(shè)計引物，參考朱祥明等[9]設(shè)計的熒光定量引物和最佳擴增體系和反應(yīng)條件，并進行優(yōu)化，其中上游引物序列為P1：5′-TCCTTCGTCCGTCGTAAT-3′；下游引物序列為P2：5′-TTCTTCAGCCGTCTTGTG-3′，擴增片段預(yù)計長度為223 bp，引物由上海生工基因測序技術(shù)有限公司合成。采用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進行熒光定量PCR檢測，反應(yīng)體系設(shè)置為：10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL，P1(10 pmol/μL)0.5μL，P2(10 pmol/μL)0.5 μL，SYBR Green1(10×)0.5 μL，TaqHS(5 U/μl)0.2 μL，模板DNA 1.0 μL，補Rnase-free H2O至總體積25 μL。反應(yīng)條件：95℃10 s、95℃ 5 s、60℃ 30 s，共40個循環(huán)。

1.2.4 PCR擴增及核苷酸序列比對分析

參考Homan等[10]報道的剛地弓形蟲529 bp重復(fù)序列，采用TOX4/TOX5的引物擴增，上游引物TOX4序列為5′-CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3′，下游引物序列TOX5序列為：5′-CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT-3′，引物由上海生工基因測序技術(shù)有限公司合成，預(yù)期擴增產(chǎn)物為529 bp。PCR反應(yīng)采用宋慧群等提供的條件[11]進行設(shè)置：10×PCR buffer(with Mg2+)3.5 μL、dNTP(2.5 mmol/ L)2.0 μL、Taq酶(5U/μl)0.2 μL、TOX4(10 pmol/μL)0.5 μL；TOX5(10 pmol/μL)0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，補雙蒸水至25 μL，設(shè)置陰性對照和陽性對照各1個。反應(yīng)參數(shù)為預(yù)變性94℃5 min、變性94℃30 s、退火57℃30 s、延伸72℃ 1 min 30 s、設(shè)置30循環(huán)，最后72℃10 min，擴增片段預(yù)計大小為530 bp。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%TBE瓊脂糖凝膠電泳，將目的片段膠回收之后，在0.2 μL微量離心管中依次加入10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μL，pGEM-T 載體(50 ng/μL)1 μL，T4 DNA Ligase 1 μl，PCR 純化產(chǎn)物5 μL，ddH20補至10 μL，混勻置4℃冰箱連接過夜。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，然后向每個離心管加入900 μL的無菌LB培養(yǎng)基(不含Amp+)，混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)45 min(150 rpm)，待菌體復(fù)蘇后，吸取100 μL涂布于含Amp+、X-gal和IPTG的LB瓊脂平板中，置恒溫搖床中按150 rpm于37℃培養(yǎng)過夜。通過藍白斑篩選法，挑選白色的菌落，置于1.5 mL的Eppendorf管，然后向每個離心管加入900 μL的無菌LB培養(yǎng)基(含Amp+)，混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜(150 rpm)，然后進行菌液PCR進一步驗證質(zhì)粒連接與轉(zhuǎn)化的情況。陽性菌液采用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 4.0試劑盒抽提重組質(zhì)粒。并將樣本送上海生工基因測序技術(shù)有限公司測序，結(jié)果用Lasergene軟件進行分析。并將序列登陸NCBI網(wǎng)站進行BLAST分析，并下載相關(guān)序列，進行核苷酸序列比對分析。參考蟲株信息詳見表1。

表1序列分析比對參考蟲株

Tab.1 Reference toxoplasma strains used for sequence analysis and comparison

2 結(jié)果

2.1 環(huán)尾狐猴的發(fā)病癥狀、病理變化與蟲體的形態(tài)學(xué)觀察

環(huán)尾狐猴初期表現(xiàn)為精神不佳，1～4 d后出現(xiàn)厭食、嗜睡、呼吸困難，妊娠母猴流產(chǎn)，并迅速出現(xiàn)死亡。死亡的狐猴肺臟嚴重水腫、出血，肝臟和脾臟腫大、出血，其中肝臟表面呈土黃色(圖1，圖2)，淋巴結(jié)高度腫脹，切面呈干酪樣變化。將狐猴組織接種小白鼠盲傳5代，在感染死亡小鼠腹水中可見到大量新月形的弓形蟲速殖子，細菌和病毒培養(yǎng)陰性。初步判斷發(fā)病死亡環(huán)尾狐猴為弓形蟲感染。

圖1 環(huán)尾狐猴肺部嚴重水腫、出血Fig.1 Pulmonary edema and hemorrhage in ring-tailed lemur

圖2 環(huán)尾狐猴肝臟腫大、出血Fig.2 Liver became swelling，hemorrhage in ring-tailed lemur

圖3 小鼠腹水涂片可見弓形蟲速殖子Fig.3 Toxoplasma gondii trophozoites at ascitic fluid smears of mouse

2.2 熒光定量PCR

熒光定量PCR檢測6份樣品，通過分析PCR產(chǎn)物溶解曲線(圖1)，可見陰性對照在編號83的位置消失，而6份樣品及陽性對照均在編號87的位置形成峰值，由此可知所有檢測樣本均為陽性。表2所示為弓形蟲熒光定量PCR檢測中部分峰值所對應(yīng)的核酸定量值，陰性對照中最大峰值為78.5，若峰值大于此值則為陽性?？芍鶛z樣本均出現(xiàn)大于78.5的核酸定量值，其中腦組織和肺組織中的最大為86，最低為心肝肺腎混合組織中的85.7，高于陽性對照中的85.5(表2)。熒光定量PCR檢測樣本的CT值詳見表3，由圖1和表2、表3綜合分析此次6份樣本熒光定量PCR檢測均為陽性。

2.3 PCR擴增及序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見片段大小約為529 bp左右，與預(yù)期目的片段大小一致，結(jié)果詳見圖2。由圖可見環(huán)尾狐猴腸、肺、心肝腎混合物以及同籠舍中鼠的淋巴結(jié)圴呈現(xiàn)強陽性，而貓的肺和淋巴結(jié)組織中呈現(xiàn)弱陽性。膠回收產(chǎn)物經(jīng)基因公司測序后，12份樣品序列全長均為529 bp，相互之間核苷酸相似性為100%，命名為RTL01。將序列登陸NCBI進行Blast比對，與登錄號KC607824、DQ779189等剛第弓形蟲序列相似性最高達到98.7%。經(jīng)過比對分析后可知此序列為剛到弓形蟲的B1基因片段與弓形蟲標準毒株RH株(登錄號：DQ779191)核苷酸相似性為98.5%；與其他相關(guān)蟲株的序列核苷酸相似性在97.9%～98.7%之間(圖3)，核苷酸序列詳細差異情況見圖6。

圖4 弓形蟲熒光定量PCR檢測溶解曲線Fig.4 The dissolution curves of fluorescent quantitative PCR method for detecting Toxoplasma B1 Gene fragment

表2 弓形蟲熒光定量PCR檢測核酸定量峰值

Tab.2 Quantitative nucleic acid peak values of fluorescent quantitative PCR method for detecting Toxoplasma B1 Gene fragment

表3 弓形蟲熒光定量PCR檢測CT值

Tab.3 The CT values of fluorescent quantitative PCR method for detecting Toxoplasma B1 Gene fragment

圖5 弓形蟲529 bp DNA 片段的PCR 擴增產(chǎn)物瓊脂糖膠電泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis of PCR products of 529 bp DNA fragment from Toxoplasma gondii注：M：DNA標準(DL 2 000)；1、2：環(huán)尾狐猴(♂)腸系膜；3、4：環(huán)尾狐猴(♂)心肝腎混合組織；5、6：環(huán)尾狐猴(♀)心肝肺腎混合組織；7、 8：貓肺組織；9、10：貓淋巴結(jié)組織；11：鼠1淋巴結(jié)組織；12：鼠2淋巴結(jié)組織；13：陽性對照；14：陰性對照Note：M：DL-2000 DNA Marker；1，2：the male ring-tailed lemur mesentery；3，4：the male ring-tailed lemur mixed tissues of heart，liver and kidney；5，6：the female ring-tailed lemur mixed tissues of heart，liver，lung and kidney；7，8：lung tissue of cat；9，10：lymph node tissue of cat；11：lymph node tissue of rat 1；12：lymph node tissue of rat 2；13：positive control；14：negative control

圖7 不同蟲株529 bp DNA片斷堿基序列相似性比較Fig.7 Similarity comparison of the 529 bp DNA fragment sequences among different Toxoplasma gondii strains注：RTL01代表環(huán)尾狐猴源弓形蟲序列，DQ779196，DQ779188， DQ779189，DQ779190，DQ779191，DQ779192，DQ779193， DQ779194， DQ779195，KC607824分別代表不同的弓形蟲株(參見表1)Note：RTL01 represents the sequence of Toxoplasma gondii from ring-tailed lemur,DQ779196，DQ779188， DQ779189，DQ779190，DQ779191，DQ779192，DQ779193， DQ779194， DQ779195，KC607824 represent different Toxoplasma gondii strains(cf Table 1)

圖6 不同蟲株529 bp DNA片斷堿基序列比較Fig.6 Comparison of the 529 bp DNA fragment sequences among different Toxoplasma gondii strains注：“.”表示與A位置的堿基相同，“-”表示此位置缺失1個堿基。RTL01代表環(huán)尾狐猴源弓形蟲序列，DQ779196，DQ779188， DQ779189，DQ779190，DQ779191，DQ779192，DQ779193， DQ779194， DQ779195，KC607824分別代表不同的弓形蟲株(參見表1)Note：“.” represents the same base as in the ITS sequence of the sample A；“-” represents the alignment gap.RTL01 represents the sequence of Toxoplasma gondii from ring-tailed lemur.DQ779196，DQ779188， DQ779189，DQ779190，DQ779191，DQ779192，DQ779193， DQ779194， DQ779195，KC607824 represent different Toxoplasma gondii strains(cf Table 1)

3 討論

3.1 2015年廣東某地圈養(yǎng)弓形體感染死亡的環(huán)尾狐猴發(fā)病初期癥狀主要表現(xiàn)為：精神沉郁、食欲缺乏、部分母獸出現(xiàn)流產(chǎn)，發(fā)病初期體溫升高至39℃以上而后迅速下降至瀕死期的35℃以下。感染死亡的雄性環(huán)尾狐猴主要表現(xiàn)中度肺炎、輕度肝炎癥狀，雌性環(huán)尾狐猴主要表現(xiàn)壞死性腸系膜淋巴結(jié)炎、肝炎、間質(zhì)性肺炎、肺水腫等病理變化。這些癥狀與Spencer等報道的環(huán)尾狐猴弓形蟲感染主要臨床癥狀(呼吸困難、倦怠、食欲缺乏等)和病理變化(肺炎、肝炎等特征性病變)基本吻合[4]。

3.2 近年來國內(nèi)外關(guān)于人和動物弓形蟲病特異PCR診斷、檢測方法的研究很多[7-8]。由于PCR方法的敏感性主要取決于目的DNA片段在基因組的拷貝數(shù)，因此可采用不同的目的DNA片段，包括35個拷貝數(shù)的BI基因[12-13]，ITS-1[14-16]及200～300個拷貝的529 bp重復(fù)序列[10]等。本研究中采用的熒光定量PCR以B1基因作為擴增對象，一步法PCR則采用弓形蟲的529 bp重復(fù)序列作為擴增對象，兩者的檢測結(jié)論一致并由形態(tài)學(xué)鑒定確認。熒光定量PCR由于高靈敏、高特異、低污染和實時檢測的特點，已廣泛應(yīng)用于多種病原體的檢測。但是由于其過高的敏感性，可能會存在假陽性的情況，所以我們把它作為本病原檢測的初篩，然后再采用一步法PCR檢測進行確診。本研究中無菌采集的6份樣品無論采用熒光定量PCR還是一步法PCR進行弓形蟲檢測，其結(jié)果均為陽性，熒光定量PCR檢測中強陽性的貓肺組織和淋巴結(jié)組織，在使用常規(guī)PCR中擴增529 bp片段陽性并不明顯，此正好印證了熒光定量PCR的高靈敏性。

3.3 從發(fā)病死亡的環(huán)尾狐猴、在猴舍內(nèi)出現(xiàn)的貓和老鼠的組織樣本中均檢測到弓形蟲，且529 bp序列完全一致，這說明本次環(huán)尾狐猴發(fā)生弓形蟲感染可能是由野貓將弓形蟲傳播給老鼠，再由攜帶弓形蟲的老鼠通過接觸狐猴的日糧或排泄糞尿至狐猴食盆等處，導(dǎo)致狐猴接觸弓形蟲而感染(野貓與狐猴沒有直接接觸)。測序與blast分析結(jié)果表明，該蟲株其與剛地弓形蟲529 bp重復(fù)序列(GenBank中登錄號為KC607824、DQ779189)的核苷酸相似性為98.7%，這說明環(huán)尾狐猴感染的蟲株為剛地弓形蟲。

3.4 弓形蟲可以感染多種哺乳動物，貓科動物是弓形體的終末宿主，其他動物采食到貓科動物隨糞便排除的蟲卵囊而感染[6]。目前動物園圈養(yǎng)條件的非洲獅(PantheraLeo)、猞猁(Lynxlynx)、山貓等動物均是弓形蟲的易感動物[17]。1962年以來多次報道圈養(yǎng)環(huán)尾狐猴死于弓形體感染，說明環(huán)尾狐猴對弓形蟲高度易感[1-5]。加強環(huán)尾狐猴的飼養(yǎng)管理，有效切斷傳染源是防控該病的關(guān)鍵。如建立嚴格的衛(wèi)生防疫體系，讓貓科動物、鼠、鳥等可能攜帶弓形蟲的動物和環(huán)尾狐猴相隔離。某些動物園將環(huán)尾狐猴飼養(yǎng)在一個封閉獨立的島上，遠離其他動物并且不直接和公眾接觸，但是有時水果、蔬菜可能被弓形體卵囊污染，在島上自由采食的麻雀(Passermontanus)、烏鶇(Turdusmerula)等野鳥也可能會攜帶污染了弓形蟲卵囊的水果蔬菜而造成環(huán)尾狐猴的感染。本次案例中發(fā)病的環(huán)尾狐猴飼養(yǎng)環(huán)境中多有老鼠、野貓等出沒，周圍也時有野鳥停留，這為剛地弓形蟲的傳播提供了條件。某些攜帶弓形蟲的動物并不會出現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀，但是在一定條件下諸如發(fā)生應(yīng)激或其他病原微生物感染等則會導(dǎo)致弓形蟲從局部感染發(fā)展至全身性感染，造成動物的死亡。因此，飼養(yǎng)環(huán)尾狐猴等動物時應(yīng)盡量減少更換籠舍、捕捉等操作避免動物出現(xiàn)應(yīng)激的行為。

[1] Sureau P，Raynaud J P，Lapeire C，et al.Premier isolement deToxoplasmagondiia Madagascar.Toxoplasmose spontanée et expérimentale duLemurcatta[J].Bulletin de la Société de Pathologie Exotique，1962，55：357-362.

[2] Nigi H，Itakura C.Spontaneous toxoplasmosis inLemurcatta[J].Primates，1968，9(1)：155-160.

[3] Brack M，Wohlsein P，Minnemann D，et al.Toxoplasmosis outbreak in ring-tailed lemurs(Lemurcatta)and squirrel monkeys(Saimirisciureus)[J].Primate Report，1998，50：71-82.

[4] Spencer J A，Joiner K S，Hilton C D，et al.Disseminated toxoplasmosis in a captive ring-tailed lemur(Lemurcatta)[J].Journal of Parasitology，2004，90(4)：904-906.

[5] Juan-Sallés C，Mainez M，Marco A，et al.Localized toxoplasmosis in a ring-tailed lemur(Lemurcatta)causing placentitis，stillbirths，and disseminated fetal infection[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2011，23(5)：1041-1045.

[6] Dubey J P.Toxoplasmosis of animals and humans[M].2nd.ed.Boca Raton:CRC Press inc，2009：1-313.

[7] Remington J S，Thulliez P，Montoya J G.Recent developments for diagnosis of toxoplasmosis[J].Journal of Clinical Microbiology，2004，42(3)：941-945.

[8] Switaj K，Master A，Skrzypczak M，et al.Recent trends in molecular diagnostics forToxoplasmagondiiinfections[J].Clinical Microbiology and Infection，2005，11(3)：170-176.

[9] 朱祥明，楊通漢，楊國慶，等.弓形蟲SYBR-Greenl熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國病原生物學(xué)雜志，2007，2(6)，428-432.

[10] Homan W L，Vercammen M，De Braekeleer J，et al.Identification of a 200-to 300-fold repetitive 529 bp DNA fragment inToxoplasmagondii，and its use for diagnostic and quantitative PCR[J].International Journal for Parasitology，2000，30(1)：69-75.

[11] 宋慧群，張德林，廖申權(quán)，等.中國弓形蟲蟲株 529 bp 重復(fù)序列的 PCR 擴增，克隆及分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40(9)：2114-2118.

[12] Burg J L，Grover C M，Pouletty P，et al.Direct and sensitive detection of a pathogenic protozoan，Toxoplasmagondii，by polymerase chain reaction[J].Journal of Clinical Microbiology，1989，27(8)：1787-1792.

[13] Pelloux H，Guy E，Angelici M C，et al.A second European collaborative study on polymerase chain reaction forToxoplasmagondii，involving 15 teams[J].FEMS Microbiology Letters，1998，165(2)：231-237.

[14] Homan W L，Limper L，Verlaan M，et al.Comparison of the internal transcribed spacer，ITS 1，fromToxoplasmagondiiisolates andNeosporacaninum[J].Parasitology Research，1997，83(3)：285-289.

[15] Hurtado A，Aduriz G，Moreno B，et al.Single tube nested PCR for the detection ofToxoplasmagondiiin fetal tissues from naturally aborted ewes[J].Veterinary Parasitology，2001，102(1)：17-27.

[16] Jauregui L H，Higgins J，Zarlenga D，et al.Development of a real-time PCR assay for detection ofToxoplasmagondiiin pig and mouse tissues[J].Journal of Clinical Microbiology，2001，39(6)：2065-2071.

[17] Sobrino R，Cabezón O，Millán J，et al.Seroprevalence ofToxoplasmagondiiantibodies in wild carnivores from Spain[J].Veterinary Parasitology，2007，148(3)：187-192.

Ring-tailed lemur；Toxoplasmagondii；Fluorogenic quantitative PCR；Polymerase Chain Reaction

DetectionandIdentificationofToxoplasmafromRing-TailedLemur(Lemurcatta)

ShanFen1LiKangxin2XuChunzhong3ChenWu1*PengShiming1LiWanping1LiGuoqing2*

(1.GuangzhouZoo，Guangzhou，510070，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou，510642，China；3.ShanghaiWildAnimalParkCompanyLimited，Shanghai，201300，China)

We sampled tissues of heart，liver，lung and kidney from two dead Ring-tailed lemurs(Lemurcatta)to identify the pathogens of lemurs that showed symptoms of dyspnea，anorexia and hemorrhagic pneumonia in Guangdong.After the pathogen was identified by morphological observation asToxoplasma，4 tissue samples from one cat and two rats which appeared in the enclosure of the dead lemurs were collected.All samples were examined by fluorescent quantitative PCR and one step PCR that were specific for Toxoplasma． We conducted sequence analysis of 529 bp fragments that was amplified using one step PCR． The CT values of six samples were 25. 84-30. 29 as determined by the fluorescent quantitative PCR method for detecting the Toxoplasma B1 Gene fragment． There were significant peaks in the dissolution curves of six samples whose quantitative nucleic acid peak values were greater than those of a positive control． The 529 bp DNA fragments were amplified and cloned from all six samples by one step PCR． The target DNA fragment was sequenced and analyzed using BLAST in GenBank． The result showed that the fragment had the highest similarity( 98. 7%) with 2 Toxoplasma gondii sequences( accession numbers: KC607824 and DQ779189) and with the international standard virulent strain of Toxoplasma gondii the RH was 98. 5%． Generally，the fluorescent quantitative PCR can be considered a rapid diagnostic technique for detecting toxoplasmosis of ring-tailed lemur． The death of ring-tailed lemur might be caused by Toxoplasma gondii which might be spread by cat and rat．

稿件運行過程

2016-02-11

修回日期：2016-02-27

發(fā)表日期：2016-05-10

剛地弓形蟲；

熒光定量PCR；

PCR

S858.9

A

2310-1490(2016)02-118-08

共同第一作者簡介：單芬，女，33歲，獸醫(yī)師；主要從事圈養(yǎng)野生動物保育與疾病防控工作。 李康信，男，25歲,碩士研究生；主要從事獸醫(yī)寄生蟲研究。

*

陳武，E-mail：guangzhouchenwu@sina.com；李國清，E-mail:gqLi@scau.edu.cn