環(huán)糊精/納米氧化鋅-多壁碳納米管修飾電極的制備及在腺苷測定中的應(yīng)用

趙志偉, 申貴雋, 谷靈燕, 謝澄斌, 韓超超, 弓曉杰

?

環(huán)糊精/納米氧化鋅-多壁碳納米管修飾電極的制備及在腺苷測定中的應(yīng)用

趙志偉1, 申貴雋1, 谷靈燕1, 謝澄斌1, 韓超超1, 弓曉杰2

(1. 大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院, 遼寧大連 116622; 2. 大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 遼寧大連 116622)

研究-CD/納米ZnO-MWNTs修飾電極的制備與應(yīng)用，建立了一種測定瑪卡與冬蟲夏草中腺苷的新方法。腺苷在電極上開路預(yù)富集后，用循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法研究了腺苷在修飾電極上的電化學(xué)行為。結(jié)果表明：腺苷在該電極上為兩電子兩質(zhì)子的氧化過程，在4×10-3~4×10-1g×L-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測限可達(dá)5×10-4g×L-1。該方法具有較強(qiáng)的抗干擾能力，在pH = 6.0，電位掃描范圍-1.2~+1.0 V，掃描速度100 mV×S-1的條件下，加標(biāo)直接測定冬蟲夏草和瑪卡的提取液中腺苷的含量，回收率為98%~110%。

腺苷；納米ZnO；循環(huán)伏安法；差分脈沖伏安法

1 前 言

腺苷(Adenosine，ADE)化學(xué)名9---呋喃核糖基腺嘌呤,它是一種遍布人體細(xì)胞的內(nèi)源性核苷，可以用于冠狀血管障礙、狹心癥、動脈硬化癥及高血壓癥等疾病的治療，也是合成三磷酸腺苷(ATP)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中間體。同時它還是心肌缺血損害和心肌保護(hù)效果的重要指標(biāo)，參與心肌能量代謝與擴(kuò)張冠脈血管。腺苷對肌體的許多其它系統(tǒng)及組織均有生理作用。目前，測定ADE的主要方法有高效液相色譜法[1,2]、酶法[3]、電化學(xué)法[4~6]、化學(xué)發(fā)光檢測法[7]。這些方法中有的存在儀器昂貴，操作復(fù)雜缺點，有的存在靈敏度和選擇性較差的缺點。

本文參考相關(guān)研究報道[8,9]，對-CD/ZnO-MWNTs化學(xué)修飾電極的制備以及對腺苷的電化學(xué)行為進(jìn)行了研究，并采用循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法對冬蟲夏草和瑪卡等實際樣品進(jìn)行測定。該方法操作簡便、測定快速、具有很高的靈敏度，可用于復(fù)雜樣品的分析。

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

CHI600C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；三電極系統(tǒng)：玻碳電極(GCE)或修飾電極為工作電極，參比電極為Ag/AgCl(上海納锘實業(yè)有限公司)，對電極為鉑電極(天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司)；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；離心沉淀機(jī)80-1型(上海機(jī)械手術(shù)廠)；pHB-1型酸度計(上海宇隆儀器有限公司)；Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent科技有限公司)；FA1604型分析天平(上海雷韻試驗儀器制造有限公司)。

-環(huán)糊精(-CD，Aladdin，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)；多壁碳納米管(MWNTs，純度> 95％，= 8~15 nm，中國科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)研究所)；α-A12O3拋光粉(天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司)；鐵氰化鉀(北京化工廠)；腺苷，肌苷和腺苷-5’-磷酸，甲醇，乙腈和石油醚(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。西藏瑪卡由大連大學(xué)弓曉杰教授提供并鑒定。所有試劑均為分析純，實驗用水為去離子水。

2.2 修飾電極的制備

2.2.1 玻碳電極預(yù)處理

將玻碳電極在金相砂紙(3000#)上打磨，然后在麂皮墊上依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3粉末拋光，最后分別用二次蒸餾水，HNO3(50%(v))，無水乙醇和二次蒸餾水超聲波清洗各3 min。將處理后的玻碳電極，置于0.5 mol×L-1的H2SO4溶液中，以50 mV×s-1掃描速度，在-0.5~+1.4 V電位區(qū)間循環(huán)掃描直至無峰[10]。將電極取出后用二次蒸餾水沖洗干凈，此玻碳電極經(jīng)處理后，其表面已達(dá)到清潔和活化的要求。最后將清洗完畢的電極保存在去離子水中備用。

2.2.2 納米ZnO-MWNTs分散液的制備

超聲條件下將37 mg Zn(CH3COO)2×2H2O和100 mg聚乙二醇加入15 mL二次蒸餾水，50℃下，將8 mL 0.04 mmol×L-1Li(OH)2·H2O水溶液緩慢滴加到上述混合液中，滴加完成后恒溫超聲10 min，離心分離得到沉淀，用二次蒸餾水超聲離心洗滌數(shù)次，70℃真空干燥后，置于瓷坩堝中放入箱式電阻爐，經(jīng)過300℃熱處理加工2 h，取出冷卻至室溫即可得到納米ZnO。

采用V(HNO3):V(HCl) =1:3回流12 h的方法將MWNTs羧基化，用0.01 mol×L-1NaOH洗至pH為近中性時止，離心后干燥。分別稱取上述1 mg 納米ZnO和2 mg預(yù)處理過的MWNTs于10 mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中超聲分散30 min，最后得到穩(wěn)定的分散液。

2.2.3-CD/納米ZnO-MWNTs修飾電極的制備

圖1所示，以GCE為基體電極，在5×10-3mol×L-1-CD+0.5 mol×L-1H2SO4介質(zhì)中，且溶液靜止條件下，通過電聚合的方式，于-0.6~+1.0 V電位范圍之間以100 mV×s-1的掃速循環(huán)掃描20周至循環(huán)伏安圖(CV)曲線穩(wěn)定，然后取出電極，經(jīng)去離子水淋洗電極表面，干燥，得到-CD/GCE[11]。然后用微量移液器取適量的納米ZnO-MWNTs分散液，滴涂在-CD/GCE上，部分納米粒子會進(jìn)入-CD的空腔內(nèi)，提高選擇性，最后紅外燈下烘干即制得-CD/ZnO-MWNTs/GCE。

圖1 β-CD/納米ZnO-MWNTs 修飾電極的制備

2.2.4 液相色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18，(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)和水(B)；梯度洗脫程序：0~40 min，60%A~100%A；流量：1 mL×min-1；柱溫：40℃；二極管陣列紫外檢測器，波長260 nm。

2.3 實驗方法

測定前先將電極置于緩沖溶液中，以-1.2~+1.0 V循環(huán)掃描數(shù)次至有良好的重復(fù)性, 然后將電極插入樣品溶液中靜置富集一定時間后，采用示差脈沖和循環(huán)伏安法研究腺苷在該電極上的電化學(xué)行為。電位掃描范圍為-1.2~+1.0 V，掃描速度為100 mV×s-1，脈沖振幅為50 mV，脈沖寬度為50 ms。計時庫侖法的電位階躍范圍為-1.2~+0.6 V，靜置富集18 min，脈沖寬度為20 s。

3 結(jié)果與討論

3.1 修飾膜的聚合與表征

圖2為玻碳電極在-CD中電聚合過程的循環(huán)伏安曲線?？梢钥闯?，-CD的電聚合過程是不可逆過程，隨著掃描圈數(shù)的增加，峰電流不斷降低，表明玻碳電極表面逐漸形成聚合膜。在電位范圍為-0.2~+0.7V，100 mV×s-1掃描速率下，分別用GCE、-CD/GCE、-CD/ ZnO-MWNTs/GCE在K3Fe(CN)6溶液中用循環(huán)伏安法掃描。如圖3所示，-CD/GCE (曲線a)比GCE(曲線b)峰電流低，這是由于-CD聚合膜的弱導(dǎo)電性所造成的。-CD/ZnO- MWNTs/GCE(曲線c)峰電流值明顯最大，表明-CD/ ZnO-MWNTs/GCE電極能有效傳遞電子。

圖2 β-CD 的電聚合CV 圖

圖3 不同電極在鐵氰化鉀中的CV 曲線

3.2 GCE、-CD /GCE和-CD/ ZnO- MWNTs/GCE的比較

將GCE、-CD/GCE和-CD/ ZnO- MWNTs/GCE在5.0×10-3mol×L-1K3[Fe(CN)6]中，以計時庫侖法進(jìn)行研究。根據(jù)Anson[12]公式：

= 2π-1/21/21/2+ads+dl(1)

式中，為工作電極的有效表面積，是電解質(zhì)的濃度，為電子傳遞數(shù)，是電解質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)，已知K3[Fe(CN)6]的和分別為1和7.6×10-6cm2×s-1[13]。由公式(1)，分別作三個電極的-1/2關(guān)系曲線(GCE：= 36.541/2-3.481；-CD/GCE：= 34.361/2-32.73；-CD/ ZnO-MWNTs/GCE：= 2111.91/2-2216.9)，由-1/2線性關(guān)系的斜率，即可計算得到GCE、-CD/GCE和-CD/ZnO-MWNTs/GCE的有效表面積分別為0.0244、0.0229和1.407 cm2。因此，納米氧化鋅與碳納米管增大了玻碳電極的微觀表面積。

圖4為GCE、-CD/GCE和-CD/ZnO-MWNTs/GCE三種電極在測定相同濃度ADE標(biāo)準(zhǔn)溶液的極化曲線，-CD/GCE (a)較GCE的峰電流高，表明-CD對ADE有良好的電化學(xué)響應(yīng)，而-CD/ ZnO-MWNTs/GCE(c)峰電流較b提高了100倍以上，表明納米氧化鋅與碳納米管起到了增敏作用。

圖4 不同電極測定相同濃度腺苷標(biāo)準(zhǔn)品的極化曲線

3.3 ADE在-CD/ ZnO-MWNTs/GCE上的電化學(xué)行為

掃速在30~150 mV×s-1，采用循環(huán)伏安法研究0.1 g×L-1ADE在修飾電極表面的電化學(xué)機(jī)理，其結(jié)果如圖5所示。其中a峰峰電位不隨掃描速度改變，表明a峰的反應(yīng)為可逆反應(yīng)，d峰的峰電流p隨掃速的增大而增大，符合方程：p= 0.94+ 17.42 (R2= 0.9982)，說明該反應(yīng)主要是吸附控制的電極過程[14]。d峰電位p隨掃速的增大正移，并且與掃速的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系：p= 0.0222ln+ 0.62 (R2= 0.9883)。根據(jù)Laviron[15]公式：

p=0+[/()]ln[s/()]+[/()]ln(2)

式中，斜率為/，為絕對溫度，為掃描速度，V×s-1，s為反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)，實驗室溫298 K，計算得約為1.15，由此可知電荷傳遞系數(shù)約為0.55，電子數(shù)為2，即ADE的氧化反應(yīng)為雙電子過程。

圖5 ADE 在修飾電極上的CV 曲線

緩沖溶液的pH對ADE的電化學(xué)響應(yīng)有重要的影響，因此，考查了ADE在不同pH的PBS緩沖溶液中的伏安行為，其中pH = 6.0時峰形最好。對于d峰，滿足方程：p=-0.0501 pH +0.7324 (R2 = 0.9895)。斜率–0.0501 V×pH-1較接近理論值–0.059 V×pH-1，表明電子轉(zhuǎn)移數(shù)與質(zhì)子轉(zhuǎn)移數(shù)之比為1:1，且為兩電子兩質(zhì)子的氧化過程。

圖6 β-CD/ ZnO-MWNTs/GCE 的選擇性

3.4 選擇性實驗

用pH = 6.0的PBS緩沖溶液配制的0.1 g×L-1ADE、0.01 g×L-1肌苷(INO)、0.01 g×L-1腺苷-5’-磷酸((5'-AMP)和它們的混合溶液(ADE+INO+5'-AMP)，預(yù)富集后，用循環(huán)伏安法進(jìn)行掃描。如圖6所示。對于d峰，-CD/ ZnO-MWNTs/GCE幾乎對肌苷沒有響應(yīng)(曲線1)，對腺苷-5’磷酸的電化學(xué)響應(yīng)(曲線2)較腺苷(曲線3)低,測定混合溶液時(曲線4)，峰電流的偏差僅為5.46%，表明該電極對ADE具有良好的選擇性。

3.5 工作曲線和電極的穩(wěn)定性

在最佳實驗條件下，用循環(huán)伏安法(CV)和示差脈沖伏安法(DPV)對不同濃度的ADE標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，其中b峰呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，如圖7和圖8所示。其線性范圍、線性回歸方程和檢出限結(jié)果如表1所示。對0.1g×L-1ADE標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行10次平行實驗，RSD分別為3.2%，表明此電極測定具有良好的重現(xiàn)性。-CD/ZnO-MWNTs/GCE在室溫下放置20 d，相同條件下再次測定時，峰電位和峰電流仍較為穩(wěn)定，表明該修飾電極具有良好的穩(wěn)定性。

圖7 不同濃度ADE 的DPV 曲線

圖8 不同濃度ADE 的CV 曲線

表1 測定ADE的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

3.6 樣品分析及加標(biāo)回收率實驗

將冬蟲夏草粉碎，取樣品粗粉2 g，置圓底燒瓶中，加90% 甲醇40 mL；回流提取30 min，過濾[16]，用PBS緩沖溶液稀釋至100 mL。精密稱取瑪卡根l.0 g，研磨粉碎，用甲醇與水的混合液超聲提取，過濾，用PBS緩沖溶液稀釋至100 mL，然后對上述樣品分別用循環(huán)伏安法和高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行回收率實驗，結(jié)果見表2。對比實驗表明，-CD/ ZnO-MWNTs/GCE的加標(biāo)回收率為98%~110%(與高效液相色譜方法的測定結(jié)果相當(dāng))，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1. 9%~3.5%，表明修飾電極具有潛在的應(yīng)用價值。

表2 樣品中回收率測定結(jié)果

* The average of five measurements.

4 結(jié) 論

用循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法研究了腺苷在自制-CD/ZnO-MWNTs修飾電極上的電化學(xué)行為及樣品含量分析。結(jié)果表明，ADE的氧化反應(yīng)為兩電子兩質(zhì)子過程，在4×10-3~4×10-1g×L-1該修飾電極的電化學(xué)響應(yīng)峰電流與腺苷濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測限可達(dá)5×10-4g×L-1。冬蟲夏草和瑪卡提取液中腺苷含量測定的加標(biāo)回收率在98%~110%。

符號說明：

A?工作電極的有效表面積，cm2Qads?表面吸附產(chǎn)生電量，C C?電解質(zhì)濃度，moL×L-1Qdl?雙電層電量，C D?電解質(zhì)傳遞系數(shù)R?理想氣體常數(shù) Ep?峰電位，VT?絕對溫度，K E0?式量電位，Vα?電荷傳遞系數(shù) Ip?峰電流，At?電解時間，min n?電子傳遞數(shù)v?掃描速度，V×s-1 Q— 電極通過的電量，C

參考文獻(xiàn)：

[1] JIANG Li-zhen (姜麗珍), HU Duan-long (胡端龍), XI Jing-fang (奚靜芳),. RP-HPLC method for the determination of adenosine in ganoderma capsules (RP-HPLC法測定靈芝膠囊中腺苷) [J]. Chinese Traditional Patent Medicine (中成藥), 2012, 34(2): 377-379.

[2] XU Yong (許勇), WANG Ke (王柯), JI Shen (季申). Determination of adenosine in cordyceps oral liquid by HPLC (高效液相色譜法測定冬蟲夏草口服液中腺苷) [J]. Chinese Traditional Patent Medicine (中成藥), 2011, 33(5): 909-911.

[3] LI Ning (李寧), DONG Hui-na (董會娜), ZU Xin (祖昕),. High-throughput assay of adenosine in fermentation broth based on enzyme catalysis (酶法高通量測定發(fā)酵液中的腺苷含量) [J]. Food and Fermentation Industries (食品與發(fā)酵工業(yè)), 2015, 41(2):167-172.

[4] Chen M L, Wei S S, Yuan B F,. Preparation of methacrylate-based monolith for capillary hydrophilic interaction chromatography and its application in determination of nucleosides in urine [J]. Journal of Chromatography A, 2012, 1228(9): 183-192.

[5] Goyal R N, Gupta V K, Oyama M,. Voltammetric determination of adenosine and guanosine using fullerene-C60-modified glassy carbon electrode [J]. Talanta, 2007, 71(3): 1110-1117.

[6] Goyal R N, Gupta V K, Chatterjee S. Simultaneous determination of adenosine and inosine using single-wall carbon nanotubes modified pyrolytic graphite electrode [J]. Talanta, 2008, 76(3): 662-668.

[7] LU Lu (魯盧), YAN Xi-luan (嚴(yán)喜鸞), XIAO Yi-bei (肖義陂),.Aptamer-based chemiluminescent detection of adenosine (基于核酸適配體的化學(xué)發(fā)光檢測腺苷) [J]. Journal of Instrumental Analysis (分析測試學(xué)報), 2014, 33(1): 73-77.

[8] BAI Yang (白楊), TANG Shao-kun (唐韶坤), XIE Cheng-zhong (謝承中). Adsorption properties of camellia oleifera abel polyphenols on mixed macroporous resins (大孔樹脂復(fù)配純化油茶多酚的吸附特性研究) [J]. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities (高校化學(xué)工程學(xué)報), 2014, 28(6): 1399-1404.

[9] LI Ying (李根), YE Shi-chao (葉世超), ZHANG Ze-guang (張則光),. Research and analysis of mass transfer model for liquid-liquid phase dispersion extraction (液-液微分散萃取傳質(zhì)模型的研究) [J]. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities (高?；瘜W(xué)工程學(xué)報), 2015, 29(6): 1325-1332.

[10] ZHAO Zhi-wei (趙志偉), SHEN Gui-jun (申貴雋), MU Shuai (穆帥),. Preparation and characteristics of a molecularly imprinted electrode for dioxopromethazine hydrochloride (鹽酸二氧丙嗪分子印跡電極的制備與性能研究) [J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory (分析試驗室), 2015, 34(2): 178-181.

[11] KANG Wei-zhong (康偉忠), SHEN Gui-jun (申貴雋), WANG Rong-hai (王榮海). Electrochemical behavior of metformin hydrochloride at a-CD and MWNTs modified glassy carbon electrode (鹽酸二甲雙胍在-CD/MWNTs修飾玻碳電極上的電化學(xué)行為研究) [J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory (分析試驗室), 2015, 34(1): 99-103.

[12] Anson F C. Application of potentiostatic current integration to the study of the adsorption of cobalt(III)-(ethylenedinitrilo(tetraacetate) on mercury electrodes [J]. Analytical Chemistry, 1964, 36(7): 932-934.

[13] Adams R. Electrochemistry at solid electrodes [M]. New York: Marcel Dekker Inc., 1969.

[14] SUN Kai (孫凱), SUN Deng-ming (孫登明). Study on electrochemical behaviors and determination of xanthine and uric acid on modified glassy carbon electrode (黃嘌呤和尿酸在修飾電極上的電化學(xué)行為及測定研究) [J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry (分析化學(xué)), 2014, 72(7): 991-996.

[15] Laviron E. General expression of the linear potential sweep voltammogram in the case of diffusionless electrochemical systems [J]. Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry, 1979, 101(1): 19-28.

[16] XIA Wen-juan (夏文娟), ZENG Xiao-ying (曾曉英), YUAN Hai-long (袁海龍),Determination of adenosine in Cordyceps at different area (不同產(chǎn)地冬蟲夏草腺苷含量的測定) [J]. China Journal of Chinese Materia Medica (中國中藥雜志),2001, 26(8): 34-36.

Preparation of-Cyclodextrin/Nanometer ZnO-MWNTs Modified Electrodes and their Application in Adenosine Detection

ZHAO Zhi-wei1, SHEN Gui-jun1, GU Ling-yan1, XIE Deng-bin1, HAN Chao-chao1, GONG Xiao-jie2

(1. College of Environmental and Chemical Engineering, Dalian University, Dalian 116622, China; 2. College of Medicine, Dalian University，Dalian 116622, China)

-CD/Nanometer ZnO-MWNTs modified electrodes were prepared and a new sensitive electrochemical method for adenosine detection in Ophiocordyceps sinensis and Maca was established. Electrochemical behaviors of adenosine on the modified electrodes were studied by cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry after open-circuit preconcentration. The results indicate that the oxidation reaction happens with two-electron and two-proton transfer, which has linear response at the range of 4′10-3~4′10-1g×L-1with a detection limit of 5′10-4g×L-1. Adenosine contents in the extracts of Ophiocordyceps sinensis and Maca can be directly measured under pH=6.0, the potential scan range of-1.2~+1.0V and scanning speed of 100 mV×s-1, and the method is robust with recovery of 98%~110%.

adenosine; nanometer ZnO; cyclic voltammetry; differential pulse voltammetry

1003-9015(2016)05-1191-06

http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1141.TQ.20160826.1557.006.html

O65.7

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2016.00.028

2015-07-04；

2015-11-25。網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-08-26 15:57:27

國家自然科學(xué)基金 (81172949)。

趙志偉(1993-)，男，山西陽泉人，大連大學(xué)本科生。通訊聯(lián)系人：申貴雋，E-mail: sgj0501@163.com