多指標正交試驗優(yōu)化復方江南卷柏散提取工藝

趙之麗，趙　平，鄧光銳，李　娟，劉義梅，陳科力#（.湖北中醫(yī)藥大學教育部中藥資源與中藥復方重點實驗室，武漢　430065；.黃岡市中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，湖北黃岡　438000）

多指標正交試驗優(yōu)化復方江南卷柏散提取工藝

趙之麗1＊，趙平1，鄧光銳2，李娟1，劉義梅1，陳科力1#（1.湖北中醫(yī)藥大學教育部中藥資源與中藥復方重點實驗室，武漢430065；2.黃岡市中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，湖北黃岡438000）

目的：優(yōu)化復方江南卷柏散提取工藝。方法：采用多指標正交試驗。以芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-吡喃木糖苷（YⅡ）含量、落新婦苷含量和浸膏得率的綜合評分為指標，篩選最優(yōu)加水倍數(shù)、提取時間和提取次數(shù)；同時進行驗證試驗。結果：篩選的最優(yōu)提取工藝為加12倍水量提取3次，每次1h；驗證試驗中YⅡ含量為0.3506mg/g（RSD＝1.2074%，n＝3）、落新婦苷的含量為1.406 0 mg/g（RSD＝1.459 8%，n＝3）、浸膏得率為23.066 6%（RSD＝1.660 3%，n＝3）。結論：該工藝科學合理，可用于復方江南卷柏散的提取。

復方江南卷柏散；正交試驗；芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-吡喃木糖苷；落新婦苷；浸膏得率；提取工藝

復方江南卷柏散為黃岡市中醫(yī)醫(yī)院制劑，由江南卷柏、土茯苓和車前子等3味中藥組成，用藥形式為加水煎服，主要用于治療高尿酸血癥及痛風性關節(jié)炎。方中江南卷柏為卷柏科植物江南卷柏（Selaginella molledorfii Hieron）的全草，具有清熱利濕、涼血止血之功效，其有效成分為黃酮苷、雙黃酮等[1-2]。文獻報道其所含黃酮類成分可抑制黃嘌呤氧化酶（XOD）從而減少尿酸生成[3]，同時具有明顯的抗炎功效[4]。土茯苓為百合科植物光葉菝葜（Smilax glabra Roxb）的干燥根莖，具有解毒、除濕、利關節(jié)的功效。已有報道土茯苓中的落新婦苷可下調腎臟尿酸鹽轉動體（URAT1）基因mRNA的表達，促進尿酸的排泄，對尿酸鈉（MSU）所致的大鼠痛風性關節(jié)炎具有明顯療效[5]。本研究以處方中江南卷柏水溶性部位黃酮苷類代表性成分芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-D-吡喃木糖苷（YⅡ）[2]及土茯苓中落新婦苷含量、浸膏得率進行多指標綜合評分，對該復方中藥的提取工藝進行優(yōu)化研究，為該制劑劑型改造提供試驗依據(jù)。

1　材料

1.1儀器

UltiMate 3000高效液相色譜（HPLC）儀，包括二元泵、色譜柱、可變波長檢測器、色譜工作站（美國戴安公司）；MS105十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多國際股份有限公司）。

1.2藥材與試劑

江南卷柏于2012年9月采于湖北宜昌霧渡河，由湖北中醫(yī)藥大學陳科力教授鑒定為卷柏科植物江南卷柏Selaginella molledorfii Hieron的全草（藥材標本存放在湖北中醫(yī)藥大學標本館內(nèi)）；車前子（批號：141202-141204）、土茯苓（批號：141002-141004）均購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學陳科力教授鑒定符合2015年版《中國藥典》（一部）對應項下規(guī)定；落新婦苷對照品（上海阿拉丁試劑有限公司，批號：A102 725，純度：≥98%）；YⅡ對照品（湖北中醫(yī)藥大學教育部中藥資源與中藥復方重點試驗室自制[2]，批號：20110119，純度：＞98.5%）；甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1復方江南卷柏散的制備

取江南卷柏、土茯苓和車前子凈藥材分別粉碎并過100目篩，取過篩后的細粉按3∶1∶1比例均勻混合，即得。

2.2YⅡ及落新婦苷的含量測定

2.2.1色譜條件色譜柱：Welchrom-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-水（B，含2%的四氫呋喃和0.1%的三氟乙酸），梯度洗脫（0～5 min，18%A→25%A；5～45 min，25%A→45%A；45～55 min，45%A→100%A；55～60 min，100%A→18%A）；流速：1 ml/min；柱溫：30；檢測波長：330 nm；進樣量：20 μl。在上述色譜條件下，取“2.2.2”“2.2.3”（“2.4”項下試驗號7）項下溶液進樣測定。結果，YⅡ與相鄰峰分離度≥2.78，理論板數(shù)以YⅡ計≥12 408；落新婦苷與相鄰峰分離度≥1.58，理論板數(shù)以落新婦苷計≥25186。色譜圖見圖1。

圖1　高效液相色譜圖A.樣品；B.YⅡ對照品；C.落新婦苷對照品；1.YⅡ；2.落新婦苷Fig 1　HPLC chromatogramsA.sample；B.YⅡcontrol；C.astilbin control；1.YⅡ；2.asbilbin

2.2.2對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒質量的落新婦苷對照品2.07 mg，加入甲醇溶解并定容至25 ml量瓶中，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得質量濃度為0.082 8 mg/ml的落新婦苷對照品溶液。精密稱取干燥至恒質量的YⅡ對照品1.53 mg，加入甲醇溶解并定容至5 ml量瓶中，搖勻，即得質量濃度為0.3060mg/ml的YⅡ對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備取復方江南卷柏散干燥粉末9份，每份10 g，精密稱定，按“2.4”項下各條件處理后，將所得提取液合并后離心（離心半徑為9 cm，1 500 r/min，下同）5 min，取上清液定容至500 ml量瓶，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4線性關系考察精密量取落新婦苷對照品溶液1、2、3、4、5 ml置于10 ml量瓶中；YⅡ對照品溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 ml置于5 ml量瓶中，分別加甲醇定容，混勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過。精密吸取20 μl，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。以對照品質量濃度（x，mg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行回歸分析，得落新婦苷、YⅡ回歸方程分別為y＝153.26x+0.064 1（r＝0.999 8）、y＝896.86x－0.091 7（r＝0.999 8），線性范圍分別為0.008 28～0.041 40、0.003 06～0.015 30 mg/ ml，定量限分別為1.8270×10－4、5.6313×10－5mg/ml。

2.2.5精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗按相關方法進行操作。結果，精密度試驗中落新婦苷峰面積的RSD＝0.87%（n＝6），YⅡ峰面積的RSD＝1.13%（n＝6）；穩(wěn)定性試驗中落新婦苷峰面積的RSD＝1.94%（n＝5），YⅡ峰面積的RSD＝1.72%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定；重復性試驗中落新婦苷峰面積的RSD＝2.55%（n＝6），YⅡ峰面積的RSD＝2.45%（n＝6）。

2.2.6加樣回收率試驗精密吸取6份已知含量的供試品溶液各5 ml，分別加入落新婦苷、YⅡ對照品溶液適量，加水定容至10 ml量瓶中，混勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過。精密吸取各溶液20 μl，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，落新婦苷、YⅡ的平均加樣回收率分別為96.92%（RSD＝1.55%，n＝6）、96.25%（RSD＝1.46%，n＝6），表明本方法回收率良好。

2.3浸膏得率的測定

精密稱定復方江南卷柏散干燥粉末10 g，按“2.4”項下各條件處理后，將所得提取液合并后離心5 min，取上清液定容至500 ml量瓶中。精密量取100 ml（相當于原藥材2 g），置于干燥至恒質量的蒸發(fā)皿中，80水浴揮干后，置于105烘箱內(nèi)烘干至恒質量，于干燥器內(nèi)冷卻30 min，迅速稱定質量并計算浸膏得率。浸膏得率（%）＝干燥后質量（g）×0.5×100%。

2.4正交試驗優(yōu)化復方江南卷柏散提取工藝

在預試驗的基礎上，選擇影響提取工藝的3個因素：加水倍數(shù)（A）、提取時間（B，h）、提取次數(shù)（C），按L9（34）正交表進行試驗。因素與水平見表1。

表1　因素與水平Tab 1　Factors and levels

稱取復方藥材粗粉10 g，按L9（34）正交表的條件進行正交試驗。將正交試驗得到的提取液濾過后合并，分別測定YⅡ含量（X）、落新婦苷含量（M）及浸膏得率（N），并進行多指標綜合評分。評分時以各指標的最大值為參照將數(shù)據(jù)進行歸一化后設定不同權重，X、M、N的權重系數(shù)分別設定為0.5、0.4、0.1，綜合評分Y＝0.5Xi/Xmax+0.4Mi/Mmax+0.1Ni/Nmax（Xi、Mi、Ni分別為i試驗號的相應結果，i＝1，2，3…9；Xmax、Mmax、Nmax分別為相應指標的最大值）。正交試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

表2　正交試驗設計與結果Tab 2　Design and results of test

由表2可知，各因素的影響強度為C＞B＞A；由表3可知，A和B無顯著影響（P＞0.05），C具有顯著影響（P＜0.05）?？紤]到節(jié)能，最終選擇最優(yōu)工藝為A1B1C3，即加12倍水量提取3次，每次1h。

表3　方差分析結果Tab 3　Results of variance analysis

2.5驗證試驗

稱取復方藥材粗粉200 g，共3份，按最優(yōu)工藝條件提取，驗證試驗結果見表4。

表4　驗證試驗結果（n＝3）Tab 4　Results of validation test（n＝3）

3　討論

3.1提取溶劑的選擇

江南卷柏、土茯苓、車前子中均含有較多黃酮類成分，文獻[6-8]中對黃酮類成分的提取研究報道較多，多采用乙醇、甲醇等溶劑提取。本課題組通過前期試驗比較發(fā)現(xiàn)，甲醇提取雜質少、提取完全，但毒性較大；乙醇提取雖無毒且完全，但雜質很多，特別是江南卷柏乙醇提取物中葉綠素含量很高，為后續(xù)提取液的純化工作帶來極大困難，且除雜工藝復雜。課題組前期試驗證實，江南卷柏的水煎液對痛風性關節(jié)炎具有良好療效，加之黃岡市中醫(yī)醫(yī)院的制劑即為水煎液，已有多年臨床使用經(jīng)驗。因此，設計本提取工藝時選擇水為溶劑。

3.2因素與水平的選定依據(jù)

本研究正交試驗前曾以不同加水量和提取時間對復方江南卷柏散水提取工藝進行了單因素考察，根據(jù)測定的YⅡ、落新婦苷的含量和浸膏得率3個指標，得最優(yōu)的料液比為1∶15，提取時間則對上述指標含量影響不顯著。因此根據(jù)單因素考察結果以15倍水量為中心前后各取一個水平設計了因素水平表。根據(jù)正交試驗結果，并結合生產(chǎn)實際，最后得到最優(yōu)提取工藝為加12倍水量提取3次，每次1 h。驗證試驗結果表明，本研究確立的提取工藝穩(wěn)定，提取物中有效成分YⅡ、落新婦苷的含量分別為0.350 6、1.406 0 mg/g（RSD分別為1.207 4%、1.459 8%，n＝3），浸膏得率為23.066 6%（RSD＝1.660 3%， n＝3）。

3.3評價指標的選擇與權重系數(shù)的判定依據(jù)

本試驗中YⅡ是江南卷柏的主要水溶性成分之一，研究發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)可代謝為芹菜素，后者具有抑制黃嘌呤氧化酶的作用。落新婦苷為2015年版《中國藥典》（一部）[9]中規(guī)定的土茯苓的指標性成分，同時也是土茯苓治療高尿酸血癥及痛風等疾病的活性成分。因此，檢測落新婦苷和YⅡ的含量，能夠為該復方的提取工藝優(yōu)選提供依據(jù)。此外，浸膏得率亦可反映復方有效成分的總量，是復方提取工藝優(yōu)化的評價指標之一[10-11]。因此，本研究選擇YⅡ、落新婦苷含量和浸膏得率為復方江南卷柏散的工藝評價指標。鑒于江南卷柏為該復方中的君藥，故設定其代表成分YⅡ含量的權重系數(shù)為0.5；土茯苓為臣藥，故設定其所含落新婦苷含量的權重系數(shù)為0.4；浸膏得率權重系數(shù)則為0.1。本課題組另設YⅡ、落新婦苷含量和浸膏得率的權重系數(shù)分別為0.4、0.4、0.2時，結果與本文結果一致。

[1]江雪平，陳科力.江南卷柏中雙黃酮類化合物的研究[J].中國藥學雜志，2009，44（2）：96.

[2]朱田密，陳科力，黎莉.江南卷柏中的黃酮碳苷類成分研究[J].中國藥房，2012，23（7）：622.

[3]黎莉，陳科力，朱田密，等.卷柏屬7種藥用植物的提取物抑制黃嘌呤氧化酶的活性研究[J].中藥材，2007，30（4）：445.

[4]鄒輝，徐康平，譚桂山.卷柏屬植物化學成分及藥理活性研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，24（11）：1655.

[5]張白嘉，劉亞歐，劉榴，等.土茯苓及落新婦苷抗炎、鎮(zhèn)痛、利尿作用研究[J].中藥藥理與臨床，2004，20（1）：11.

[6]殷丹，陳科力.正交試驗優(yōu)選江南卷柏總黃酮提取工藝[J].中國藥房，2010，21（15）：1368.

[7]陳文龍，陳燕芬，盧傳堅.土茯苓總黃酮提取工藝的正交設計優(yōu)化[J].時珍國醫(yī)國藥，2014，25（3）：544.

[8] 潘冬梅，李向榮.車前子總黃酮的超聲輔助提取工藝優(yōu)化[J].浙江中醫(yī)雜志，2014，49（12）：924.

[9] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：18.

[10]黃永亮，吳純潔，何曉燕.中藥提取工藝評價指標的研究進展[J].中藥與臨床，2012，3（5）：49.

[11]陳紀鵬.中藥復方提取工藝及制劑產(chǎn)業(yè)化的思路[J].中國實驗方劑學雜志，2000，6（2）：59.

（編輯：劉明偉）

Optimization of Extraction Technology for Compound Selaginella moellendorffii Powder with Orthogonal Test by Multiple Indicators

ZHAO Zhili1，ZHAO Ping1，DENG Guangrui2，LI Juan1，LIU Yimei1，CHEN Keli1（1.Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Resource and Compound Prescription，Ministry of Education&Hubei University of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430065，China；2.Dept.of Traditional Chinese Internal Medicine，Traditional Chinese Medicine Hospital of Huanggang City，Hubei Huanggang 438000，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Compound Selaginella moellendorffii powder.METHODS：The amount of water，extracting time and times were screened by orthogonal test using the content of 6-C-β-D-glucopyranosul-8-C-β-D-xylopyranosyl apigonin（YⅡ）and astilbin，the yield of extract as index.The validation test was conducted.RESULTS：The optimal extraction technology was as follows as 12-fold water，decocting 3 times，1 h each time；in validation test，the content of YⅡand astilbin were 0.350 6 mg/g（RSD＝1.207 4%，n＝3）and 1.406 0 mg/g（RSD＝1.459 8%，n＝3）；the yield of extract was 23.066 6%（RSD＝1.660 3%，n＝3）.CONCLUSIONS：The technology is reasonable and scientific，and can be used for the extraction of Compound S.moellendorffii powder.

Compound Selaginella moellendorffii powder；Orthogonal test；6-C-β-D-glucopyranosul-8-C-β-D-xylopyranosyl apigonin；Astilbin；Yield of extract；Extraction technology

R932

A

1001-0408（2016）28-3996-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.33

＊碩士研究生。研究方向：中藥資源及其品質。E-mail：810847743@qq.com

教授，博士生導師。研究方向：中藥資源及其品質。電話：027-68890106。E-mail：Kelichen@126.com

（2016-01-14

2016-08-16）