復(fù)方葛根片對(duì)老齡大鼠肝細(xì)胞再生與凋亡的影響

王飛飛，李允江，楊文超，路其康，于燕莉（.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南　250355；2.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，濟(jì)南　25003）

復(fù)方葛根片對(duì)老齡大鼠肝細(xì)胞再生與凋亡的影響

王飛飛1＊，李允江1，楊文超1，路其康1，于燕莉2#（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南250355；2.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，濟(jì)南250031）

目的：研究復(fù)方葛根片對(duì)老齡大鼠肝細(xì)胞再生與凋亡的影響。方法：40只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組（生理鹽水，10 ml/kg）和復(fù)方葛根片低、中、高劑量組[200、400、800 mg（生藥）/kg]，每組8只。除正常組外，其他各組大鼠每天上午9：00 ip D-半乳糖溶液[250 mg/（kg·d）]復(fù)制衰老模型，每天下午15：00 ig相應(yīng)藥物，連續(xù)給藥8周。按相關(guān)試劑盒操作分別測(cè)定血清、肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量以及肝臟中脂褐素（LPF）含量，并觀察各組大鼠肝臟組織病理變化。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠血清和肝組織中SOD活性顯著降低，MDA、LPF含量顯著升高（P＜0.01）；肝臟淋巴細(xì)胞顯著增加，散在凋亡細(xì)胞增多，淋巴細(xì)胞在匯管區(qū)灶性浸潤(rùn)、肝血竇散在浸潤(rùn)。與模型組比較，復(fù)方葛根片低、高劑量組大鼠血清中SOD活性顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；中、高劑量組大鼠血清中MDA含量顯著降低（P＜0.01），肝組織中SOD活性顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；低、中、高劑量組大鼠肝組織中MDA、LPF含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；肝臟淋巴細(xì)胞減少，凋亡細(xì)胞少見，雙核細(xì)胞顯著增多。結(jié)論：復(fù)方葛根片能增加老齡大鼠肝細(xì)胞再生，減少其凋亡。

復(fù)方葛根片；抗衰老；肝臟；細(xì)胞再生；細(xì)胞凋亡；大鼠

肝臟具有調(diào)暢氣機(jī)、促進(jìn)脾胃運(yùn)動(dòng)和膽汁分泌、調(diào)暢情志、貯藏血液、調(diào)節(jié)血量、防止出血的功能。這一中醫(yī)基礎(chǔ)理論決定了肝臟在五臟中的重要地位，被稱為“將軍之官”。因此有“人之衰老，肝為先導(dǎo)”[1]這一理論，即肝臟對(duì)衰老的病程、病機(jī)具有“率先、引導(dǎo)”的作用。復(fù)方葛根片為濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院制劑，處方由葛根、丹參、茵陳和延胡索組成，具有活血化瘀、生津養(yǎng)心之功效[2]，臨床主要用于冠心病、心絞痛、心肌梗死等疾病的治療。研究表明，復(fù)方葛根片具有較強(qiáng)的活血化瘀、抗氧化損傷、清除自由基等抗衰老作用[3-4]。本研究主要通過(guò)復(fù)制D-半乳糖致衰老模型大鼠[5]觀察復(fù)方葛根片對(duì)老齡大鼠肝細(xì)胞再生與凋亡的影響，為復(fù)方葛根片抗衰老的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料

1.1儀器

B600A醫(yī)用低速離心機(jī)（河北省安新縣白洋離心機(jī)廠）；UV-2550紫外-可見光分光光度計(jì)（日本島津公司）；BS124S萬(wàn)分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；AS-3120超聲清洗器（北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司）；BIO-RAD680酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司）；TGL-16G-A冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；奧林巴斯顯微鏡（上海普赫光電科技有限公司）。

1.2藥品與試劑

復(fù)方葛根片[濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科制劑室，批號(hào)：20151112，規(guī)格：0.3 g（生藥）/片；使用時(shí)去糖衣，研磨成細(xì)粉，加純水配制成一定的質(zhì)量濃度]；D-半乳糖（張家港市華昌藥業(yè)有限公司，批號(hào)：15121101，純度：≥98%）；0.9%氯化鈉注射液（山東齊都藥業(yè)有限公司，批號(hào)：8B15111306）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20141112、20141105）；大鼠脂褐素（LPF）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上?？仑S生物科技有限公司，批號(hào)：Lotisc-e111601）。

1.3動(dòng)物

健康Wistar大鼠40只，♂，體質(zhì)量200～250 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（魯）2015-0014。實(shí)驗(yàn)前穩(wěn)定飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境濕度50%～70%、室溫25～27℃、自然光照，自由進(jìn)食、飲水。

2　方法

2.1造模、分組與給藥

40只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組（生理鹽水，10 ml/kg）和復(fù)方葛根片低、中、高劑量組[200、400、800 mg（生藥）/kg，給藥劑量按臨床給藥劑量的0.5、1、2倍系數(shù)[6]計(jì)算]，每組8只。除正常組外，其他各組大鼠每天上午9：00 ip D-半乳糖溶液[250 mg/（kg·d）]以復(fù)制衰老模型，每天下午15：00 ig相應(yīng)藥物，連續(xù)給藥8周。每周記錄各組大鼠體質(zhì)量以調(diào)整用藥劑量。

2.2各組大鼠指標(biāo)檢測(cè)[7]

末次給藥后，各組大鼠禁食不禁水12 h，ip水合氯醛溶液麻醉，于腹腔靜脈取血適量，4℃離心（離心半徑為5 cm，3 000 r/min，下同）20 min，用微量移液器吸取上清液備用；迅速摘取肝臟，切割部分稱定質(zhì)量，加入一定量的冰生理鹽水，采用勻漿器將組織充分勻漿，制備10%組織勻漿，低溫離心20 min，用微量移液器吸取上清液，備用。按照試劑盒說(shuō)明書操作分別測(cè)定血清和肝組織中SOD活性、MDA含量以及肝組織中LPF含量。

2.3各組大鼠肝組織病理變化觀察[8]

各組大鼠摘取肝臟后，取部分肝組織用生理鹽水沖洗表面血液，放入10%中性福爾馬林溶液中固定48 h后取出，用梯度濃度的酒精逐級(jí)脫水，浸蠟包埋，制備肝臟組織病理切片。行蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下行組織形態(tài)學(xué)觀察，分析各組大鼠肝臟細(xì)胞形態(tài)及組織病理變化。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均以±s表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1 各組大鼠血清SOD活性、MDA含量測(cè)定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清SOD活性顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，復(fù)方葛根片低、高劑量組大鼠SOD活性顯著升高（P＜0.05或P＜ 0.01），中、高劑量組大鼠MDA含量顯著降低（P＜0.01），結(jié)果詳見表1。

表1　各組大鼠血清中SOD活性、MDA含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝8）Tab 1　The activity of SOD and contents of MDA in serum of rats in each group（±s，n＝8）

表1　各組大鼠血清中SOD活性、MDA含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝8）Tab 1　The activity of SOD and contents of MDA in serum of rats in each group（±s，n＝8）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

MDA，nmol/mg 8.46±0.79 11.92±1.07＊11.68±0.63 9.35±0.85##8.57±1.28##組別正常組模型組復(fù)方葛根片低劑量組復(fù)方葛根片中劑量組復(fù)方葛根片高劑量組SOD，u/mg 239.05±9.76 161.37±12.44＊179.13±5.62#193.08±11.59 222.69±8.36##

3.2 各組大鼠肝組織中SOD活性和MDA、LPF含量測(cè)定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中SOD活性顯著降低（P＜0.01），MDA、LPF含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，復(fù)方葛根片中、高劑量組大鼠SOD活性顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），低、中、高劑量組大鼠MDA、LPF含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果詳見表2。

表2　各組大鼠肝組織中SOD活性和MDA、LPF含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝8）Tab 2　The activity of SOD and contents of MDA，LPF in liver tissue of rats in each group（±s，n＝8）

表2　各組大鼠肝組織中SOD活性和MDA、LPF含量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝8）Tab 2　The activity of SOD and contents of MDA，LPF in liver tissue of rats in each group（±s，n＝8）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

LPF，μg/g 0.373±0.045 0.862±0.038＊0.601±0.017#0.532±0.013#0.437±0.015##組別正常組模型組復(fù)方葛根片低劑量組復(fù)方葛根片中劑量組復(fù)方葛根片高劑量組SOD，U/mg 225.51±6.17 144.09±7.55＊170.55±2.56 181.75±4.43#196.37±4.49##MDA，nmol/mg 4.95±0.28 7.26±0.61＊6.05±0.19#5.54±0.32##5.11±0.68##

3.3各組大鼠肝組織病理變化觀察結(jié)果

各組大鼠肝組織病理變化觀察結(jié)果見圖1。

圖1　各組大鼠肝組織病理變化觀察結(jié)果（HE，×200）A.正常組；B.模型組；C.復(fù)方葛根片高劑量組；D.復(fù)方葛根片中劑量組；E.復(fù)方葛根片低劑量組Fig 1　Histological sections of liver tissue of rats in each group（HE，×200）A.normal group；B.model group；C.Compound puerarin tablet highdose group；D.Compound puerarin tablet medium-dose group；E.Compound puerarin tablet low-dose group

正常組大鼠肝臟細(xì)胞中淋巴細(xì)胞少，凋亡細(xì)胞罕見，雙核細(xì)胞約6個(gè)/高倍視野（HPF），詳見圖1A；模型組大鼠肝臟細(xì)胞中淋巴細(xì)胞多于正常組，散在凋亡細(xì)胞增多，匯管區(qū)灶性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肝血竇散在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，詳見圖1B；復(fù)方葛根片高劑量組大鼠肝臟細(xì)胞中淋巴細(xì)胞少于正常組，凋亡細(xì)胞罕見，雙核細(xì)胞約6個(gè)/HPF，詳見圖1C；復(fù)方葛根片中劑量組大鼠肝臟細(xì)胞中少數(shù)匯管區(qū)可見灶性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，凋亡細(xì)胞少見，雙核細(xì)胞約3～5個(gè)/HPF，詳見圖1D；復(fù)方葛根片低劑量組大鼠肝臟細(xì)胞中可見凋亡細(xì)胞，部分匯管區(qū)可見灶性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肝血竇淋巴細(xì)胞多于中劑量組，雙核細(xì)胞約3～4個(gè)/HPF，詳見圖1E。

4　討論

衰老的特征是機(jī)體所有組織穩(wěn)態(tài)的逐漸失衡，導(dǎo)致其對(duì)各種刺激、壓力的反應(yīng)能力和功能下降，并使機(jī)體病變和死亡的風(fēng)險(xiǎn)大大增加[9]。肝臟是人體新陳代謝的主要器官，參與人體中各種物質(zhì)的合成、分解、代謝、排泄等，當(dāng)肝臟功能紊亂時(shí)，整個(gè)機(jī)體都會(huì)受到影響。隨著年齡的增長(zhǎng)，肝臟會(huì)發(fā)生許多結(jié)構(gòu)和功能的變化[10]，包括肝臟體積縮小、肝血流灌注量減少、肝細(xì)胞增大、細(xì)胞核大小不均和假毛細(xì)血管化等[11]，這些變化可導(dǎo)致肝臟的抵抗能力、貯備能力和再生能力下降。

自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為自由基氧化損傷是衰老過(guò)程中細(xì)胞損傷的主要原因，機(jī)體代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一系列活性氧簇（ROS），同時(shí)，機(jī)體內(nèi)存在抗氧化防御體系以清除過(guò)多的自由基。在正常生理狀態(tài)下，自由基的產(chǎn)生與清除是動(dòng)態(tài)平衡的，但隨著年齡的增長(zhǎng)，體內(nèi)抗氧化防御功能逐漸減退，自由基的動(dòng)態(tài)平衡被打破，過(guò)多的自由基可引發(fā)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞功能損傷，從而產(chǎn)生衰老現(xiàn)象[12-13]。

SOD是機(jī)體中重要的抗氧化酶，可清除自由基，在防止機(jī)體氧化損傷、抗衰老等方面具有重要作用[14]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化代謝的毒性終產(chǎn)物，能破壞細(xì)胞或細(xì)胞器生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，影響生物膜功能。同時(shí)測(cè)定兩者含量可以更好地反映機(jī)體抗氧化損傷的能力。LPF又稱老年素，是溶酶體作用后剩余的不再能被消化的物質(zhì)形成的殘余體，多沉積于神經(jīng)、心肌、肝臟等組織的衰老細(xì)胞中，且其積累量隨年齡的增長(zhǎng)而增多，是衰老的重要指征之一[15]。

現(xiàn)代研究表明，復(fù)方葛根片處方中的葛根、丹參中含有大量的抗氧化損傷有效成分，如葛根素、丹參多酚酸等，其可有效增強(qiáng)機(jī)體清除自由基能力，降低脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，抑制自由基攻擊細(xì)胞生物膜中不飽和脂肪酸而引起的氧化損傷[16-17]。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)方葛根片具有抗氧化損傷的能力，同時(shí)可改善肝臟功能，且高劑量抗衰老作用更明顯。各組大鼠肝組織病理變化結(jié)果表明，高劑量復(fù)方葛根片可使肝臟細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)至正常水平。

綜上所述，復(fù)方葛根片對(duì)老齡大鼠的肝臟具有抗衰老作用，能增強(qiáng)抗肝臟氧化損傷能力，減少凋亡細(xì)胞的產(chǎn)生，增加再生細(xì)胞的數(shù)量。本文可為復(fù)方葛根片在抗衰老方面的作用提供依據(jù)。

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（編輯：劉明偉）

Effects of Compound Puerarin Tablet on the Regeneration and Apoptosis of Liver Cells in Aged Rats

WANG Feifei1，LI Yunjiang1，YANG Wenchao1，LU Qikang1，YU Yanli2（1.College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China；2.Dept.of Pharmacy，General Hospital of Jinan Military Command，Jinan 250031，China）

OBJECTIVE：To investigate the effects of Compound puerarin tablet on the regeneration and apoptosis of liver cells in aged rats.METHODS：40 rats were randomly divided into normal group，model group（normal saline，10 ml/kg），Compound puerarin tablet low-dose，medium-dose and high-dose groups[200，400，800 mg（crude drug）/kg]，8 for each group.Except for normal group，aging model was induced in those groups by irrigation gastric administration of D-galactose solution[250 mg/（kg·d）] at 9 o’clock every morning；they were given relevant medicine at 15 o’clock every afternoon，ig，for 8 weeks.The contents of SOD and MDA in serum and liver，and the content of hepatic lipofuscin（LPF）in liver were determined by related kit operation procedure；the pathological change of liver tissue was observed in rats.RESULTS：Compared with normal group，the activity of SOD in serum and liver decreased significantly in model group，while the contents of MDA and LPF increased significantly（P＜0.01）；the number of leukomonocyte in liver of rats increased significantly，and scattered apoptotic cells increased；lymphocyte periportal focal and scattered infiltration of hepatic sinusoids were found in model group.Compared with model group，the activity of SOD in serum of rats increased significantly in Compound puerarin tablet low-dose and high-dose groups（P＜0.05 or P＜0.01），while the content of MDA in serum of rats decreased significantly in medium-dose and high-dose groups（P＜0.01）；the content of SOD in liver tissue increased significantly in medium-dose and high-dose groups（P＜0.05 or P＜0.01），while the contents of MDA and LPF in liver tissue decreased significantly in low-dose，medium-dose and high-dose groups（P＜0.05 or P＜0.01）；in low-dose，medium-dose and high-dose groups，the number of leukomonocyte decreased and apoptotic cells were rare，while the number of binucleate cells increased.CONCLUSIONS：Compound puerarin tablet can enhance liver cell regeneration and reduce cell liver apoptosis in aged rats.

Compound puerarin tablet；Anti-aging；Liver；Cell regeneration；Cell apoptosis；Rats

R285.5

A

1001-0408（2016）28-3942-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.16

＊碩士研究生。研究方向：中藥質(zhì)量控制與藥理研究。電話：0531-51665173。E-mail：13793197726@163.com

主任藥師，碩士。研究方向：中藥質(zhì)量控制與藥理研究。電話：0531-51666293。E-mail：yuyanli323@sohu.com

（2016-06-02

2016-08-16）