化風(fēng)丹血清藥物化學(xué)的初步研究Δ

向文英，楊　武，梅朝葉，王永林，李勇軍，黃　勇#（.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng)　55000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng)　55000；3.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴陽(yáng)　55000；.民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴陽(yáng)　55000）

化風(fēng)丹血清藥物化學(xué)的初步研究Δ

向文英1，2，3＊，楊武1，2，梅朝葉1，2，王永林1，李勇軍4，黃勇1#（1.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng)550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng)550004；3.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴陽(yáng)550004；4.民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴陽(yáng)550004）

目的：對(duì)化風(fēng)丹血清藥物化學(xué)進(jìn)行研究，初步探討其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：采用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用法，同時(shí)建立化風(fēng)丹提取物以及大鼠ig化風(fēng)丹（6 g/kg）、藥母（1.37 g/kg）、藥母陰性樣品（5.73 g/kg）提取物后含藥血清的指紋圖譜，分別在正、負(fù)離子檢測(cè)模式下通過(guò)比較化風(fēng)丹和含藥血清的指紋圖譜，初步鑒定化風(fēng)丹在大鼠血中移行成分及其代謝產(chǎn)物。結(jié)果：在負(fù)離子模式下含藥血清中共發(fā)現(xiàn)8個(gè)藥源性成分（其中3個(gè)為原型成分，5個(gè)可能為代謝產(chǎn)物），有6個(gè)來(lái)自藥母；在正離子模式下含藥血清中共發(fā)現(xiàn)9個(gè)藥源性成分（其中2個(gè)為原型成分，7個(gè)可能為代謝產(chǎn)物），有6個(gè)來(lái)自藥母。結(jié)論：初步確定了化風(fēng)丹的入血成分，其入血成分主要來(lái)自藥母。

血清藥物化學(xué)；化風(fēng)丹；藥母；指紋圖譜；含藥血清；移行成分；大鼠

化風(fēng)丹是由牛膽水、白附子、生半夏、生南星、生川烏、郁金、紫蘇葉、僵蠶、天麻等21味藥材組成的復(fù)方中藥制劑。方中以獨(dú)特發(fā)酵工藝制成的藥母（含牛膽水、白附子、生半夏、生南星、生川烏、郁金6味藥材）作為君藥，具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙、活血止痛之功效；天麻、全蝎、僵蠶、白附子等作為臣藥，具有化痰息風(fēng)，以增強(qiáng)藥母平肝、息風(fēng)、鎮(zhèn)痙的功效。該藥多用于風(fēng)痰閉阻、中風(fēng)偏癱、癲癇、面神經(jīng)麻痹等癥的治療，是受國(guó)務(wù)院保護(hù)的四大名藥之一[1]。

傳統(tǒng)中藥多為口服給藥，其有效物質(zhì)必須以血液為介質(zhì)輸送到靶點(diǎn)，因而給藥后的含藥血清才是真正起作用的“制劑”，血清中含有的成分才是中藥的體內(nèi)直接作用物質(zhì)[2]。化風(fēng)丹為復(fù)方純中藥制劑，在中藥組方配伍中君藥是針對(duì)病因病機(jī)與體質(zhì)的，是起主要治療作用的藥物；輔藥的作用是協(xié)助與加強(qiáng)主藥的功效。而拆方研究也是根據(jù)中醫(yī)藥理論中復(fù)方的組成原則，以達(dá)到精簡(jiǎn)方劑、增效減毒的目的。因?yàn)橹兴帍?fù)方是中醫(yī)臨床的基本形式，但是中藥復(fù)方成分復(fù)雜，很難明確其起治療作用的部位或成分，所以進(jìn)行中藥復(fù)方拆方研究有助于提高中藥質(zhì)量、指導(dǎo)臨床用藥[3]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)化風(fēng)丹的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其藥理作用機(jī)制研究相對(duì)薄弱，已成為化風(fēng)丹深層次開(kāi)發(fā)利用的技術(shù)瓶頸，因此，明確化風(fēng)丹的藥效物質(zhì)及作用機(jī)制具有重要意義，并可對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥提供重要依據(jù)。本文通過(guò)對(duì)化風(fēng)丹進(jìn)行血清藥物化學(xué)研究，為探討化風(fēng)丹的藥效物質(zhì)成分奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料

1.1儀器

Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF/MS）儀，包括自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD二極管陣列檢測(cè)器、二元泵（美國(guó)Agilent公司）；EL204電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；Allegra64R低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）。

1.2藥品與試劑

化風(fēng)丹（批號(hào)：20150601，規(guī)格：0.12 g/丸）、藥母（褐黑色固體）和由除藥母外其他藥材制成的粉末狀藥母陰性樣品（遵義廖元和堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20150401）；乙腈（德國(guó)默克股份兩合公司，色譜純）；甲醇（天津歐密科化學(xué)試劑有限公司，色譜純）；水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3動(dòng)物

健康SD成年大鼠，SPF級(jí)，♂，體質(zhì)量（300±20g，購(gòu)自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK（渝）2012-0008]。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

稱取研碎的化風(fēng)丹成品、藥母和藥母陰性樣品各50g，加入12倍量50%甲醇，回流提取2h，過(guò)濾，重復(fù)提取3次，合并濾液，旋蒸回收甲醇至無(wú)醇味，并濃縮制備成含生藥量均為0.6g/ml的提取藥液，冷藏備用。

2.2空白血清和含藥血清的制備

取健康SD大鼠40只，隨機(jī)分為空白組、化風(fēng)丹組、藥母組和藥母陰性樣品組，每組10只。大鼠禁食不禁水12 h后，根據(jù)文獻(xiàn)[4]和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，化風(fēng)丹組大鼠ig化風(fēng)丹提取物6 g/kg，藥母組大鼠ig藥母提取物1.37g/kg，藥母陰性樣品組大鼠ig藥母陰性樣品提取物5.73g/kg，空白組大鼠ig等體積蒸餾水，每天給藥2次，連續(xù)給藥3d。末次給藥后1.5 h于股動(dòng)脈取血，37℃水浴至上層有黃色液體析出后取出，以離心半徑為8cm、5000r/min離心10min，分離血清。同組大鼠血清合并以消除個(gè)體差異，然后置于－20℃條件下保存，備用。

2.3血清藥品預(yù)處理

取大鼠含藥血清和空白血清各1ml，分別加入4ml甲醇，渦旋2min、超聲10min后以離心半徑為8cm、15 000r/min低溫離心10min，取上清液，37℃氮?dú)獯蹈?。再加?ml甲醇于吹干樣品中，按上述處理方法二次沉淀蛋白，取上清液于37℃ 氮?dú)獯蹈珊?，加?00μl甲醇復(fù)溶，渦旋2min，超聲10min，再次低溫離心10min。取上清液，即為含藥血清樣品和空白血清樣品，供血清藥物化學(xué)研究用。

2.4分析條件

2.4.1色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（100mm×2.1 mm，1.8μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）（梯度洗脫：0～7min，10%B～25%B；7～10 min，25%B～45%B；10～15min，45%B～65%B；15～18min，65%B～100%B）；流速：0.30ml/min；柱溫：40.0℃；進(jìn)樣量：2μl。

2.4.2質(zhì)譜條件電噴霧離子源，掃描方式為正、負(fù)離子掃描（ESI－、ESI+，m/z：100～1 000）；毛細(xì)管電壓為4.5kV；錐孔電壓為150V；離子源溫度為110℃；霧化氣（N2）壓力為1.2 bar，流速為8.0 L/min，溫度為200℃；準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定采用甲酸鈉校正標(biāo)準(zhǔn)液，校正模式選用Enhanced Quadratic。數(shù)據(jù)分析采用Metabolite Detect軟件，運(yùn)用此軟件將空白血清色譜圖從含藥血清色譜圖扣除，得到其差異圖譜。

2.5血清指紋圖譜共有峰的標(biāo)定

取“2.2”項(xiàng)下含藥血清樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后分別進(jìn)行UPLC-Q-TOF/MS分析。通過(guò)對(duì)6份來(lái)自不同大鼠的含藥血清的指紋圖譜進(jìn)行分析，在大鼠血清中共標(biāo)定出9個(gè)共有峰（A1～A9），結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.6方法學(xué)考察

2.6.1重復(fù)性取“2.2”項(xiàng)下化風(fēng)丹含藥血清樣品5份，血清樣品按“2.3”項(xiàng)下方法處理后分別進(jìn)行測(cè)定。以A7號(hào)峰為參照峰，記錄各峰的保留時(shí)間和峰面積，并計(jì)算各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，A1～A9號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均在1%（n＝5）以內(nèi)，其相對(duì)峰面積的RSD均在10%（n＝5）以內(nèi)，表明該方法的重復(fù)性較好。

圖1　正離子檢測(cè)模式下標(biāo)定的血清樣品共有峰Fig 1　Common peak of serum samples under positive ion mode

2.6.2精密度取“2.2”項(xiàng)下化風(fēng)丹含藥血清混合樣品1份，按“2.3”項(xiàng)下處理后分析方法分別進(jìn)行測(cè)定。以A7號(hào)峰為參照峰，記錄各峰的保留時(shí)間和峰面積，并計(jì)算各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，A1～A9號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均在1%（n＝5）以內(nèi)，其相對(duì)峰面積的RSD均在10%（n＝5）以內(nèi)，表明精密度較好。

2.6.3穩(wěn)定性取“2.2”項(xiàng)下化風(fēng)丹含藥血清混合樣品1份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，分別考察放置0、3、6、9、12 h后樣品的穩(wěn)定性。以A7號(hào)峰為參照峰，記錄各峰的保留時(shí)間和峰面積，并計(jì)算各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，A1～A9號(hào)峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均在1%（n＝5）以內(nèi)，其相對(duì)峰面積的RSD均在10%（n＝5）以內(nèi)，表明樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7正、負(fù)離子檢測(cè)模式下化學(xué)成分及血清樣品分析

2.7.1正離子檢測(cè)模式下取離心后化風(fēng)丹提取物以及按“2.3”項(xiàng)下處理后的各血清樣品，分別按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行UPLC-Q-TOF/MS分析。通過(guò)化風(fēng)丹成品提取物溶液的正離子色譜圖和參考文獻(xiàn)[5-9]，得到化風(fēng)丹提取液正離子檢測(cè)模式下質(zhì)譜信息。與化風(fēng)丹提取物樣品液保留時(shí)間比較，化風(fēng)丹含藥血清色譜圖中8、9號(hào)色譜峰所表征的成分為原型入血成分。與藥母含藥血清、藥母陰性樣品含藥血清色譜圖比較，認(rèn)定9個(gè)血中移行成分中2、4、6、7、8、9號(hào)色譜峰所表征的成分來(lái)自于君藥藥母；1號(hào)色譜峰所表征的成分來(lái)自于藥母陰性樣品；而2、4、6號(hào)色譜峰所表征的成分在藥母和藥母陰性樣品中都有貢獻(xiàn)。結(jié)果表明藥母和藥母陰性樣品對(duì)化風(fēng)丹在體內(nèi)的直接作用物質(zhì)均有貢獻(xiàn)。色譜圖詳見(jiàn)圖2、質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。

2.7.2負(fù)離子檢測(cè)模式下取離心后化風(fēng)丹提取物以及按“2.3”項(xiàng)下處理后的各血清樣品，分別按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)行UPLC-Q-TOF/MS分析。通過(guò)化風(fēng)丹成品提取物溶液的負(fù)離子色譜圖和參考文獻(xiàn)[10-11]，得到化風(fēng)丹提取液負(fù)離子檢測(cè)模式下質(zhì)譜信息。與化風(fēng)丹提取物樣品保留時(shí)間比較，化風(fēng)丹含藥血清色譜圖中6、7、8號(hào)色譜峰所表征的成分為原型入血成分。與藥母含藥血清、藥母陰性樣品含藥血清與空白血清差異圖譜相比較，認(rèn)定8個(gè)血中移行成分中2、3、5、6、7、8號(hào)色譜峰所表征的成分來(lái)自于君藥藥母；1號(hào)色譜峰所表征的成分來(lái)自于藥母陰性樣品；而2、3號(hào)色譜峰所表征的成分在藥母和藥母陰性樣品中都有貢獻(xiàn)。除了3個(gè)入血原型成分外，其他5個(gè)色譜峰所表征的成分可能為大鼠口服藥物提取樣品液后其在體內(nèi)轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物或機(jī)體對(duì)藥物產(chǎn)生的應(yīng)激成分。色譜圖詳見(jiàn)圖3、質(zhì)譜信息見(jiàn)表2。

3　討論

UPLC是高效液相色譜分析方法中的一種突破性分析方法，具有對(duì)復(fù)雜樣品的超高分離能力、超高分析速度和超高分析靈敏度，極大地提高了分析工作的效率和質(zhì)量；而Q-TOFMS是高分辨串聯(lián)質(zhì)譜，能夠精確分析相對(duì)分子質(zhì)量以及可能的分子式與結(jié)構(gòu)[12]。而本研究采用UPLC與Q-TOF/MS聯(lián)用建立了一種高效、準(zhǔn)確、快速地分析復(fù)雜中藥體系化學(xué)成分的方法，充分合理地將液相色譜強(qiáng)大的分離能力和質(zhì)譜的高分辨特點(diǎn)運(yùn)用在復(fù)方中藥體系中。在該方法的分析條件下，18 min內(nèi)就能將化合物分離完畢。在15 min前有機(jī)相的洗脫梯度是在65%以下，梯度比例轉(zhuǎn)換緩慢；在15～18 min，有機(jī)相的洗脫梯度由65%至100%，梯度比例轉(zhuǎn)換較快，導(dǎo)致色譜圖中基線存在向上飄移的現(xiàn)象，但這對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生太大影響。

圖2　化風(fēng)丹提取物及血清樣品液正離子檢測(cè)模式色譜圖Fig 2　The positive ion mode chromatogram of Huafengdan extract and drug-cuntaining serum

表1　化風(fēng)丹提取物樣品液正離子檢測(cè)模式色譜峰歸屬表Tab 1　The positive ion mode chromatogram peak of Huafengdan extract

化風(fēng)丹為純中藥復(fù)方制劑，因其所含化學(xué)成分復(fù)雜難以區(qū)分且各成分含量差異大，難以對(duì)含藥血清中化合物進(jìn)行認(rèn)定以及標(biāo)準(zhǔn)品難以獲取等原因給其血清分析帶來(lái)極大困難[13]。含藥血清中的原型成分和代謝成分最有可能成為化風(fēng)丹的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。在本試驗(yàn)中，筆者采用正、負(fù)離子掃描方式對(duì)化風(fēng)丹提取物樣品液進(jìn)行全掃描，其在正、負(fù)離子模式下均有響應(yīng)且成分較多。正離子模式下多為生物堿，主要由藥母提供；負(fù)離子模式下主要由藥母陰性樣品提供，多為黃酮類。從血清樣品分析結(jié)果得出，化風(fēng)丹含藥血清中都有入血成分存在，而且有較多代謝產(chǎn)物產(chǎn)生。且化風(fēng)丹血清樣品在正、負(fù)離子模式下入血原型成分多與君藥藥母入血原型成分相一致，所以化風(fēng)丹入血原型成分可能主要由君藥藥母貢獻(xiàn)。本次研究將為進(jìn)一步明確化風(fēng)丹藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。

圖3　化風(fēng)丹提取物及血清樣品液負(fù)離子檢測(cè)模式色譜圖Fig 3　The negative ion mode chromatogram of Huafengdan extract and drug-cuntaining serum

表2　化風(fēng)丹提取物樣品液負(fù)離子檢測(cè)模式色譜峰歸屬表Tab 2　The negative ion mode chromatogram peak of Huafengdan extract

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（編輯：林靜）

Serum Pharmacochemistry Study on Huafengdan

XIANG Wenying1，2，3，YANG Wu1，2，MEI Chaoye1，2，WANG Yonglin1，LI Yongjun4，HUANG Yong1（1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics，Guiyang 550004，China；2.School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；3.National Engineering Research Center of Miao’s Medicines，Guiyang 550004，China；4.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM，Ministry of Education，Guiyang 550004，China）

OBJECTIVE：To study the serum pharmacochemistry of Huafengdan，and to investigate its active component base preliminarily.METHODS：UPLC-Q-TOF/MS was used to establish the fingerprints of Huafengdan and drug-containing serum of rats after intragastric administration of extract of Huafengdan（6 g/kg），Yaomu（1.37 g/kg）and Yaomu negative sample（5.73 g/ kg）.The fingerprints of Huafengdan and drug-containing serum were compared under positive and negative ion model，in order to preliminarily indentify the components absorbed into blood and metabolites of Huafengdan.RESULTS：Under negative ion model，8 drug-induced constituents（3 prototype components，5 possible metabolites）were found in drug-containing serum，6 of which were from Yaomu.Under positive ion model，9 drug-induced constituents（2 prototype components，7 possible metabolites）were found in drug-containing serum，6 of which were from Yaomu.CONCLUSIONS：The components absorbed into blood of Huafengdan are confirmed preliminarily and mainly come from Yaomu.

Serum pharmacochemistry；Huafengdan；Yaomu；Fingerprint；Drug-containing serum；Absorbed component；Rats

R285.5

A

1001-0408（2016）28-3911-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.07

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（No.2013BAI11B01）；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開(kāi)發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目（No.黔科合重G字〔2013〕4001）；貴州省高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升計(jì)劃（No.黔教合協(xié)同創(chuàng)新字〔2013〕04）；貴州省研究生卓越人才計(jì)劃項(xiàng)目（No.黔教研合ZYRC字〔2014〕012）

＊碩士研究生。研究方向：藥動(dòng)學(xué)。E-mail：852017994@qq.com

教授，碩士生導(dǎo)師，博士。研究方向：中藥活性成分及新藥開(kāi)發(fā)研究。電話：0851-6908899。E-mail：Hujie51619@sina.cn

（2016-01-12

2016-06-15）