稀堿－濃鹽法提取硫酸軟骨素工藝條件的研究

付 瑩，王 鑫，于童童，徐麗萍

(1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院省高校食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱150076;2.華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，武漢430070)

硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate，簡稱CS)是一種酸性黏多糖，廣泛存在于哺乳動物的軟骨、喉骨、鼻骨和器官中，主要通過共價鍵與核心蛋白質(zhì)相連，以蛋白聚糖的形式存在.具有多種同分異構(gòu)體，根據(jù)硫酸基在半乳糖上的位置不同主要分為硫酸軟骨素A(CSA)和硫酸軟骨素B(CSC)[1].硫酸軟骨素為白色或微黃色粉末，具有吸濕性，易溶于水而成黏度較大的溶液，難溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑.硫酸軟骨素遇熱不穩(wěn)定，具有降血脂、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤及預防關(guān)節(jié)炎等重要生理功能[2－4].作為食品添加劑，硫酸軟骨素可用于食品的乳化、保濕和祛除異味.在化妝品中添加硫酸軟骨素，可調(diào)節(jié)皮膚的細胞代謝，促進營養(yǎng)的吸收，保持皮膚的水分和改善發(fā)質(zhì).因此，從低成本的豬軟骨中提取開發(fā)硫酸軟骨素食品及保健品具有十分廣闊的前景[5－7].

1 材料與方法

1.1 實驗材料

豬月牙骨，市售.

1.2 主要試劑與儀器

無水乙醇(天津市天博迪化工有限公司);氫氧化鈉(黑龍江阿城化學試劑廠);鹽酸(哈爾濱新達化工廠);氯化鈉(天津市精細化工開發(fā)開發(fā)中心);FZ102機型微型植物粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司);TDL80－2B型低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);恒溫水浴振蕩器(上海一恒科學儀器有限公司);DK－98－1型電子恒溫水浴箱(天津市泰斯特儀器有限公司);ALC－1100.2型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);便攜式pHS－3C型數(shù)字精密pH計(中國上海儀器廠);TU－1900型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)

1.3 實驗方法

1.3.1 浸取

稱取5份3 g豬軟骨，分別置于燒杯中，按照一定的料液比，加入一定體積分數(shù)的NaOH溶液，再根據(jù)總?cè)芤旱捏w積加入NaCl使溶液達到一定濃度，校正pH值為12～13，水浴振蕩24 h(溫度恒定)后過濾備用.

1.3.2 鹽酸鹽解

采用2 mol/L的HCl調(diào)節(jié)濾液pH值為7～8，升溫至80～90℃，保持20 min，冷卻靜置后過濾，得鹽解液.

1.3.3 除酸性蛋白

將鹽解液調(diào)節(jié)pH值為2～3，攪拌10 min，靜置.存放后過濾至澄清，調(diào)節(jié)pH值達到6.5，加2倍去離子水，使溶液的NaCl濃度為1 mol/L.

1.3.4 沉淀干燥

上述溶液加入95%的無水乙醇，使乙醇的體積分數(shù)達到50%～60%，存放至清，虹吸除上清液，沉淀抽干，并用無水乙醇洗3～4次，脫水干燥，即得硫酸軟骨素成品[8].

1.3.5 稀堿－濃鹽法提取硫酸軟骨素單因素條件的選擇

根據(jù)實驗條件和相關(guān)資料確定幾個對硫酸軟骨素得率有影響的因素，即堿液濃度、提取溫度、料液比和Na+濃度對硫酸軟骨素得率的影響.以選定的方法進行單因素實驗，即改變某一條件，固定其他條件，測定硫酸軟骨素得率[9].其結(jié)果也為正交試驗的進行奠定了基礎(chǔ).

1)堿液濃度單因素試驗

稱取5份3 g豬軟骨，分別置于燒杯中，按照1∶6的料液比，分別加入1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%的NaOH溶液，再根據(jù)總?cè)芤旱捏w積加NaCl使?jié)舛冗_到3.5 mol/L，校正pH值為12～13，控溫40℃，水浴振蕩24 h(溫度恒定)后過濾備用.按照1.3.2－1.3.4法進行鹽酸鹽解、除酸性蛋白、沉淀干燥等試驗得成品.

2)料液比單因素試驗

稱取5份3 g豬軟骨，分別置于燒杯中，分別按照1∶5，2∶11，1∶6，2∶13，1∶7的料液比，加入2%的NaOH溶液，再根據(jù)總?cè)芤旱捏w積加NaCl使?jié)舛冗_到3.5 mol/L，校正pH值為12～13，控溫40℃，水浴振蕩24 h(溫度恒定)后過濾備用.按照1.3.2及1.3.4法進行鹽酸鹽解、除酸性蛋白、沉淀干燥等試驗得成品.

3)Na+濃度單因素試驗

稱取5份3 g豬軟骨，分別置于燒杯中，按照1∶6的料液比，加入2%，的NaOH溶液，再根據(jù)總?cè)芤旱捏w積分加NaCl使?jié)舛确謩e達到2、2.5、3、3.5、4 mol/L，校正pH值為12～13，控溫40℃，水浴振蕩24 h(溫度恒定)后過濾備用.按照1.3.2及1.3.4法進行鹽酸鹽解、除酸性蛋白、沉淀干燥等試驗得成品.

4)提取溫度單因素試驗

稱取5份3g豬軟骨，分別置于燒杯中，按照1∶6的料液比，加入2%的NaOH溶液，再根據(jù)總?cè)芤旱捏w積加NaCl使?jié)舛冗_到3.5 mol/L，校正pH值為12～13，分別控溫25、30、35、40、45℃，水浴振蕩24 h(溫度恒定)后過濾備用.按照1.3.2～1.3.4法進行鹽酸鹽解、除酸性蛋白、沉淀干燥等試驗得成品.

1.3.6 硫酸軟骨素最佳工藝條件的選擇

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果與分析，選擇影響稀堿－濃鹽法提取硫酸軟骨素的四個主要因素分別為:堿液體積分數(shù)(A)、料液比(B)、Na+濃度(C)和提取溫度(D)，采用正交設(shè)計表L9(34)安排正交實驗.因素水平表見表1.

表1 正交實驗的因素和水平

1.3.7 定性定量分析實驗

1)硫酸軟骨素得率的計算其中:m為提取的硫酸軟骨粗品的質(zhì)量，g;M為豬軟骨原料的質(zhì)量，g.

2)紫外可見光譜檢測

取一定體積硫酸軟骨素標準或樣品溶液，置于10 mL具塞試管中，準確加入蒸餾水使溶液體積至1.00 mL，置于冰水浴中冷卻，然后分別加入6 mL濃硫酸，其間注意避免出現(xiàn)沸騰現(xiàn)象，蓋塞振蕩均勻后置于沸水中加熱20 min，取出放于冰水浴中冷卻.向水解后的溶液中加入0.20 mL咔唑溶液，搖勻后置于沸水中加熱15 min，顯色，取出迅速置于冰水浴中冷卻至室溫.采用無醛乙醇作空白溶液，用TU－1900型雙光束紫外分光光度計在400～600 nm波長范圍內(nèi)掃描確定硫酸軟骨素最大吸收波長.樣品溶液采用此方法測定最大吸收波長與標準品對照.

2 結(jié)果與討論

2.1 稀堿－濃鹽法提取硫酸軟骨素單因素結(jié)果與分析

選取影響稀堿－濃鹽法提取硫酸軟骨素效果的主要因素:堿液體積分數(shù)、料液比、Na+濃度、提取溫度，分別進行單因素實驗，以硫酸軟骨素得率為指標，確定各因素對硫酸軟骨素得率的影響，為正交試驗提供依據(jù).

2.1.1 堿液體積分數(shù)單因素實驗結(jié)果與分析

實驗結(jié)果顯示，隨著堿液體積分數(shù)的上升硫酸軟骨素的得率先逐漸升高然后逐漸下降.在堿體積分數(shù)為2%時Cs得率最高，隨著堿液體積分數(shù)大于2%時，硫酸軟骨素的釋出率逐漸降低，這可能是由于隨著堿液體積分數(shù)的增大，處于糖鏈還原端的糖基在堿性條件下，逐漸生成間糖酸和異糖酸而脫落降解，是Cs得率降低.因此，選定堿液體積分數(shù)為2%為最佳.見圖1.

圖1 堿液體積分數(shù)對硫酸軟骨素得率的影響

2.1.2 料液比單因素實驗結(jié)果與分析

實驗結(jié)果顯示，隨著料液比的提高硫酸軟骨素的得率先大幅上升然后逐漸下降.在料液比為1∶6時得率達到最高，但當料液比高于1∶6時，硫酸軟骨素的得率逐漸下降，故最佳料液比為1∶6左右.由于實驗是以3 g豬軟骨為原料的，如果料液比過小，溶劑量就相應(yīng)很少，導致溶液稠度較高，不利于多糖的浸出;所以在一定范圍內(nèi)，增大料液比可以使得原料與堿液充分發(fā)生反應(yīng)，降解更徹底，進而提高得率，但過高的料液比會使得堿液體積分數(shù)下降，從而也不利于硫酸軟骨素的浸提.見圖2.

圖2 料液比對硫酸軟骨素得率的影響

2.1.3 Na+濃度單因素實驗結(jié)果與分析

實驗結(jié)果顯示，隨著Na+濃度的升高Cs的得率先大幅上升保持一段平穩(wěn)后又大幅下降.Na+濃度在3 mol/L時硫酸軟骨素的得率達到最大.故最佳Na+濃度為3 mol/L左右.高濃度的鹽可使游離出的蛋白質(zhì)沉淀完全，鹽濃度不能過低，否則產(chǎn)品的澄清度就會下降，蛋白質(zhì)清楚不完全，導致硫酸軟骨素的得率減少.但過高濃度的鹽不僅會造成浪費，而且也會降低硫酸軟骨素的得率.見圖3.

圖3 Na+濃度對硫酸軟骨素得率的影響

2.1.4 提取溫度單因素實驗結(jié)果與分析

實驗結(jié)果顯示，浸取時溫度越高，膠原蛋白溶漲的速率越快，硫酸軟骨素就越容易解離出來.在提取溫度為40℃時，硫酸軟骨素的得率達到最高點，振蕩溫度繼續(xù)升高時，硫酸軟骨素的得率就逐漸下降，如果提取溫度大于50℃，溶液變?yōu)槌燃t色，說明硫酸軟骨素分解，嚴重影響最終得率.故最佳浸取提取溫度為40℃左右.見圖4.

圖4 提取溫度對硫酸軟骨素得率的影響

2.2 稀堿－濃鹽法提取硫酸軟骨素最佳條件結(jié)果與分析

通過正交實驗確定最佳提取方法，考察指標為硫酸軟骨素得率(%)，其實驗結(jié)果見表2.

表2 正交實驗的結(jié)果表

2.3 直觀分析

為了探索更好的實驗條件的取值方向，以各因素的水平為橫坐標，均值K為縱坐標繪制因素與水平直觀圖，結(jié)果見圖5.

圖5 直觀分析圖

通過比較正交試驗表中各因素的極差值(R)，由圖5可以看出，影響硫酸軟骨素得率因素順序為A＞D＞B＞C，最佳提取條件為A3B2C1D1，即2.5%NaOH溶液，料液比1∶6，Na+濃度2.5 mol/L，提取溫度35℃.

2.4 方差分析

對正交試驗做方差分析，分析出對實驗影響顯著的因素有哪幾項，其結(jié)果見表3.由表3可知，其中的堿液體積分數(shù)影響效果顯著.

表3 方差分析表

由表3的方差分析可知，各因素對稀堿－濃鹽法對硫酸軟骨素得率影響的大小順序為A＞D＞B＞C，即堿液體積分數(shù)＞提取溫度＞料液比＞Na+濃度，最佳的因素水平組合為A3B2C1D1，即2.5%NaOH溶液，料液比1∶6，Na+濃度2.5 mol/L，提取溫度35℃.經(jīng)驗證試驗得稀堿－濃鹽法提取硫酸軟骨素的得率為14.54%.

2.5 定性試驗結(jié)果與分析

如圖6.硫酸軟骨素標準溶液在400～600 nm波長范圍掃描可見硫酸軟骨素溶液在526 nm有最大吸收峰.樣品與標準品出峰位置一致，證明提取物質(zhì)為硫酸軟骨素.

圖6 硫酸軟骨素標品與樣品紫外掃描圖譜

3 結(jié)語

采用稀堿－濃鹽法提取豬軟骨中的硫酸軟骨素，考察不同因素(即堿液體積分數(shù)、料液比，提取溫度、Na+濃度)對其提取效果的影響，采用正交試驗確定最佳提取工藝并通過紫外光譜法對其進行檢測，得出以下結(jié)論:硫酸軟骨素的最佳提取工藝條件為:2.5%NaOH溶液，料液比1∶6，Na+濃度2.5 mol/L，提取溫度35℃.經(jīng)驗證試驗，硫酸軟骨素的得率為14.54%，由方差分析證明，堿液體積分數(shù)對硫酸軟骨素的得率影響效果顯著.通過紫外光譜法檢測，結(jié)果表明提取出物質(zhì)與硫酸軟骨素標準品峰形位置一致，進一步證明從豬軟骨提出的物質(zhì)是硫酸軟骨素.

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