血漿miR-92a與骨肉瘤預(yù)后相關(guān)性研究

孟 偉，張 力，黎健偉，危 敏

1.南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所，廣東 廣州 510515；

2.解放軍535醫(yī)院介入科，湖南 懷化 418008；

3.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，廣東 廣州 510515；

4.深圳市南山區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518054

血漿miR-92a與骨肉瘤預(yù)后相關(guān)性研究

孟 偉1，張 力2，黎健偉3，危 敏4

1.南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所，廣東 廣州 510515；

2.解放軍535醫(yī)院介入科，湖南 懷化 418008；

3.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，廣東 廣州 510515；

4.深圳市南山區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518054

背景與目的：骨肉瘤是兒童和年輕成人最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，目前尚無高特異度、高靈敏度的預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)。該研究旨在探討血漿miR-92a表達(dá)水平與骨肉瘤臨床病理及預(yù)后的關(guān)系。方法：收集30例健康體檢者和45例骨肉瘤患者術(shù)前及術(shù)后血漿，通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測(cè)血漿miR-92a水平。以術(shù)前miR-92a≥5為界限，將骨肉瘤患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。結(jié)果：骨肉瘤患者血漿miR-92a水平顯著高于正常體檢人群，患者術(shù)前miR-92a水平遠(yuǎn)高于術(shù)后?；颊咝g(shù)前miR-92a表達(dá)水平與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小和組織學(xué)類型等無關(guān)，而與Enneking分期、腫瘤壞死率和肺轉(zhuǎn)移相關(guān)。Kaplan-Meier分析高表達(dá)miR-92a的骨肉瘤預(yù)后差（P=0.035）。結(jié)論：骨肉瘤患者血漿miR-92a表達(dá)水平與生存率相關(guān)，可能是骨肉瘤一項(xiàng)有價(jià)值的預(yù)后指標(biāo)。

骨肉瘤；miR-92a；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，高發(fā)于青少年，中位發(fā)病年齡為14.6歲，是青少年發(fā)病率排名第二的原發(fā)惡性腫瘤，占惡性骨腫瘤19%，年發(fā)病率約為3/100萬，具有侵襲性生長(zhǎng)和快速血道播散的特點(diǎn)，惡性程度高，早期轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后差［1-2］。近年來，臨床上雖然對(duì)手術(shù)方式及手術(shù)前、后化療等綜合治療方法已有一定的改進(jìn)，但患者的5年生存率仍不足70%。骨肉瘤早期臨床癥狀無特異性，且病情進(jìn)展較快，一旦出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，5年生存率降至30%以下，尋找能夠在早期診斷及能夠?qū)崿F(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)疾病的預(yù)后相關(guān)指標(biāo)具有重要意義。miRNA是一類短鏈非編碼小RNA，可于體液及分泌物中穩(wěn)定表達(dá)，已有大量研究報(bào)道，miRs可作為多種疾病尤其是各種腫瘤的良好標(biāo)志物［3-5］。多項(xiàng)研究顯示，miR-92a在乳腺癌、胃癌和肺癌等多種腫瘤中起原癌基因的作用［6-8］，但在骨肉瘤中的報(bào)道較少。本研究旨在探討其與骨肉瘤預(yù)后的相關(guān)性。

1　資料和方法

1.1 臨床資料

收集南方醫(yī)院骨科2005年1月—2010年1月臨床資料完整的、術(shù)后病理確診原發(fā)性骨肉瘤的患者術(shù)前及術(shù)后血漿標(biāo)本。使用EDTA-K2抗凝管采集所有血漿標(biāo)本，30 min內(nèi)，4 ℃，3 000×g，離心10 min，取上層血漿，移至1.5 mL EP管中，為進(jìn)一步去除細(xì)胞成分，4 ℃，11 000×g，離心10 min 后，將血漿移至新的1.5 mL EP管中，置于-80 ℃冰箱保存。45例患者中，男性28例，女性17例，男女性別比為1.64∶1?；颊吣挲g9～51歲，中位年齡15歲。腫瘤部位：股骨14例，脛腓骨9例，肱骨8例，其他部位14例。按照Enneking外科分期：Ⅱ期32例，Ⅲ期13例。另隨機(jī)取本院體檢后6個(gè)月內(nèi)未發(fā)現(xiàn)腫瘤的30例健康人血漿作為對(duì)照。全部患者均采用電話或定期門診隨訪，中位隨訪時(shí)間36個(gè)月。

1.2 主要試劑及方法

miR抽提試劑盒miR Vana?購自美國Ambion公司，按說明書提取總miRNA。加入DEPC水20 μL，振蕩溶解RNA，采用美國Thermo公司的NanoDrop ND-2000微量核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)RNA濃度。miRNA反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，步驟根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，以U6為內(nèi)參。miR-92a的反轉(zhuǎn)錄引物序列為：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC GGCAATTCAGTTGAGTCAGGCCG-3'；miR-92a的RTFQ-PCR引物序列順義鏈為：5'-GC TGAGTATTGCACTTGTCCCG-3'；反義鏈為：5'-GTGTCGTGGAGTCGGCAA-3'。反應(yīng)體系見表1。

表 1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系Tab. 1 The reverse transcription reaction system

采用ABI 7900 RTFQ-PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)復(fù)孔，記錄每個(gè)孔中熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)，即Ct值，計(jì)算3個(gè)孔Ct值的平均值作為最終結(jié)果。將反應(yīng)物置于PCR儀中，37 ℃反應(yīng)60 min，85 ℃反應(yīng)5 min，獲得cDNA用于進(jìn)一步擴(kuò)增，并置于-20 ℃保存。RTFQ-PCR反應(yīng)體系見表2。RTFQ-PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。miRNA表達(dá)水平的計(jì)算方法：以U6作為內(nèi)參照，計(jì)算miR-92a相對(duì)表達(dá)值2-ΔΔCt。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。健康人與骨肉瘤患者miR-92a水平比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，骨肉瘤患者術(shù)前和術(shù)后miR-92a水平對(duì)比采用配對(duì)t檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank非參數(shù)檢驗(yàn)，并繪制生存曲線；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1 骨肉瘤患者和健康體檢者血漿miR-92a表達(dá)水平對(duì)比結(jié)果

45例骨肉瘤患者術(shù)前血漿miR-92a表達(dá)水平明顯高于健康體檢者（P=0.000），F(xiàn)值為84.543；術(shù)后血漿miR-92a表達(dá)水平均明顯下降，但仍高于健康體檢者（P=0.010），F(xiàn)值為7.052。術(shù)前和術(shù)后患者miR-92a水平比較相關(guān)系數(shù)為0.592，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，表3）。

表 2 RTFQ-PCR反應(yīng)體系Tab. 2 RTFQ-PCR reaction system

表 3 骨肉瘤患者和健康體檢血漿miR-92a表達(dá)Tab. 3 The expression of miR-92a in the plasma from the physical examination and osteosarcoma patients

表 3 骨肉瘤患者和健康體檢血漿miR-92a表達(dá)Tab. 3 The expression of miR-92a in the plasma from the physical examination and osteosarcoma patients

Group　Case number　miR-92a expression level Osteosarcoma Pre-operation　45　3.92±0.97 Post-operation　45　1.84±0.51 Physical examination　30　1.07±0.34

2.2 miR-92a表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

45例骨肉瘤患者以術(shù)前血漿miR-92a≥5為分界線，分為低表達(dá)組（n=30，3.04±0.78）。與高表達(dá)組（n=15，5.66±0.470）與患者性別、年齡、腫瘤部位、病理類型無關(guān)，腫瘤大小、組織學(xué)類型及腫瘤壞死率無關(guān)，而與Enneking疾病分期及有無轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（表4）。

2.3 miR-92a表達(dá)與骨肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，miR-92a低表達(dá)組患者的3年生存率為50%（15/30），而高表達(dá)患者的3年生存率為20%（3/15）。miR-92a低表達(dá)的患者中位生存時(shí)間為28.26個(gè)月，顯著長(zhǎng)于高表達(dá)的患者（22.26個(gè)月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.035，圖1）。

表 4 骨肉瘤患者血漿miR-92a表達(dá)與臨床參數(shù)之間的關(guān)系Tab. 4 The relationship between the expression of miR-92a in plasma and the clinical characteristics in osteosarcoma patients

圖 1 45例骨肉瘤患者Kaplan-Meier生存分析Fig. 1 Kaplan-Meier survival analysis of the 45 osteosarcoma patients

3　討　論

骨肉瘤是最常見的骨原發(fā)惡性腫瘤。近年來新輔助化療的實(shí)施，足量、密集、長(zhǎng)程的術(shù)后輔助化療等新的治療理念和方案的推進(jìn)，使骨肉瘤患者預(yù)后的5年生存率從不足30%提高到接近70%。但骨肉瘤惡性程度高，早期就發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，10%～20%的患者在首診時(shí)就已經(jīng)發(fā)生了肺轉(zhuǎn)移。隨著CT、MRI和PET/CT等臨床影像技術(shù)的不斷提高，早期轉(zhuǎn)移灶的發(fā)現(xiàn)率已顯著提高，但影像學(xué)儀器精度限制了微小病灶的檢出。尋找高靈敏度、高特異度的疾病預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)具有重要的臨床意義和價(jià)值。

miRNA是一類長(zhǎng)度只有22 nt的短單鏈內(nèi)源性RNA，通過與靶基因3'-或5'-UTR區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后對(duì)靶基因表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，其表達(dá)具有嚴(yán)格的時(shí)空和組織特異性。miRNA廣泛參與細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖、代謝和凋亡等生物過程。miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要的調(diào)控作用，在腫瘤組織和腫瘤患者體液中穩(wěn)定高表達(dá)，并有很強(qiáng)的特異性。血漿中的miRNA被稱為循環(huán)miRNA，被認(rèn)為是一類具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值的分子標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。血漿標(biāo)本采樣容易，患者依從性好，可作為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的指標(biāo)。miR-92a屬于miR-17-92a基因簇，該基因簇是脊椎動(dòng)物非常保守的典型多順反子miRNA基因簇，定位于13q31.3，在多種腫瘤中均高表達(dá)并發(fā)揮原癌基因的作用。miR-17-92a基因簇的各個(gè)miRNA可協(xié)同發(fā)揮作用，也可單獨(dú)發(fā)揮調(diào)控作用，其靶基因多為腫瘤抑制因子。Olive等［9］的研究結(jié)果顯示，miR-92a過表達(dá)可導(dǎo)致c-Myc異常高表達(dá)，促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞過度增殖，抑制p-53依賴性凋亡。Manni等［10］的研究結(jié)果顯示，miR-92a靶向調(diào)控p63基因的表達(dá)，在骨髓瘤細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-92a可顯著促進(jìn)瘤細(xì)胞增殖。Ghosh等［11］分離了B細(xì)胞型慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟hronic lymphocyte leukemia，CLL）患者的白血病細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-92a顯著升高，并靶向調(diào)控與HIF-1α降解密切相關(guān)的VHL基因，而HIF-1α與p300和磷酸化的STAT3結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)及分泌，維持CLL細(xì)胞惡性增殖。Al-Nakhle等［12］的研究結(jié)果顯示，miR-92a調(diào)節(jié)ERβ參與乳腺癌細(xì)胞惡性增殖。Haug等［13］的研究結(jié)果顯示，miR-92a直接靶向負(fù)調(diào)控腫瘤抑制因子Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)因子DKK家族的Dickkopf-3（DDK3），miR-92a表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性增殖密切相關(guān)。Ren等［7］的研究結(jié)果顯示，胃癌組織高表達(dá)miR-92a，可作為胃癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。Tan等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-92a基因簇的水平與肝癌惡性增殖及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。miR-17-92a基因簇的表達(dá)受原癌基因c-Myc表達(dá)調(diào)節(jié)，這個(gè)反饋環(huán)調(diào)節(jié)腫瘤組織的發(fā)生、發(fā)展。本研究檢測(cè)骨肉瘤患者術(shù)前及術(shù)后血漿miR-92a表達(dá)水平的變化，并對(duì)比健康體檢人與之的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，手術(shù)前患者血漿miR-92a均值為3.92±0.97，手術(shù)后骨肉瘤患者miR-92a血漿均值顯著下降，為1.84±0.51，但是仍高于健康人群（1.07±0.34）。

本研究根據(jù)術(shù)前miR-92a≥5作為分界線，將患者劃分為miR-92a高表達(dá)組和低表達(dá)組，發(fā)現(xiàn)miR-92a表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小及組織學(xué)類型無明顯關(guān)系，而與Enneking分期及肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。miR-92a低表達(dá)骨肉瘤分期：ⅡA期22個(gè)（73.33%），ⅡB/Ⅲ期8個(gè)（26.67%）；而高表達(dá)者分期：ⅡA期5個(gè)（33.33%），ⅡB/Ⅲ期10個(gè)（66.67%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）。miR-92高表達(dá)骨肉瘤患者80%有轉(zhuǎn)移（12/15），而低表達(dá)患者的轉(zhuǎn)移率為43.33%（13/30），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.019）。本研究結(jié)果還顯示，miR-92a高表達(dá)者的3年生存率及中位生存時(shí)間顯著短于miR-92a低表達(dá)者，提示miR-92a高表達(dá)的患者預(yù)后較差。本研究結(jié)果提示，miR-92a可能參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展，且影響患者的預(yù)后，可能是潛在的骨肉瘤預(yù)后預(yù)測(cè)因子。

［1］ FRIEBELE J C， PECK J， PAN X， et al. Osteosarcoma: a metaanalysis and review of the literature ［J］. Am J Orthop （Belle Mead NJ）， 2015， 44（12）: 547-553.

［2］ BISHOP M W， JANEWAY K A， GORLICK R. Future directions in the treatment of osteosarcoma ［J］. Curr Opin Pediatr， 2016， 28（1）: 26-33.

［3］ NUGENT M. MicroRNA and bone cancer ［J］. Adv Exp Med Biol， 2015， 889: 201-230.

［4］ HATA A， KASHIMA R. Dysregulation of microRNA biogenesis machinery in cancer ［J］. Crit Rev Biochem Mol Biol， 2016， 51（3）: 121-34.

［5］ WANG J， YANG M， LI Y， et al. The role of micrornas in the chemoresistance of breast cancer ［J］. Drug Dev Res， 2015，76（7）: 368-374.

［6］ GU Y Q， GONG G， XU Z L， et al. miRNA profiling reveals a potential role of milk stasis in breast carcinogenesis ［J］. Int J Mol Med， 2014， 33（5）: 1243-1249.

［7］ REN C， WANG W， HAN C， et al. Expression and prognostic value of miR-92a in patients with gastric cancer ［J］. Tumour Biol， 2016. ［Epub ahead of print］.

［8］ ZHAO J， FU W， LIAO H， et al. The regulatory and predictive functions of miR-17 and miR-92 families on cisplatin resistance of non-small cell lung cancer ［J］. BMC Cancer，2015， 15: 731.

［9］ OLIVE V， SABIO E， BENNETT M J， et al. A component of the mir-17-92 polycistronic oncomir promotes oncogenedependent apoptosis ［J］. Elife， 2013， 2: e00822.

［10］ MANNI I， ARTUSO S， CARECCIA S， et al. The microRNA miR-92 increases proliferation of myeloid cells and by targeting p63 modulates the abundance of its isoforms ［J］. FASEB J， 2009， 23（11）: 3957-3966.

［11］ GHOSH A K， SHANAFELT T D， CIMMINO A， et al. Aberrant regulation of pVHL levels by microRNA promotes the HIF/ VEGF axis in CLL B cells ［J］. Blood， 2009， 13（22）: 5568-5574.

［12］ AL-NAKHLE H， BURNS P A， CUMMINGS M， et al. Estrogen receptor ｛beta｝1 expression is regulated by miR-92 in breast cancer ［J］. Cancer Res， 2010， 70（11）: 4778-4784.

［13］ HAUG B H， HENRIKSEN J R， BUECHNER J， et al. MYCN-regulated miRNA-92 inhibits secretion of the tumor suppressor DICKKOPF-3 （DKK3） in neuroblastoma ［J］. Carcinogenesis， 2011， 32（7）: 1005-1012.

［14］ TAN W， LI Y， LIM S G， et al. miR-106b-25/miR-17-92 clusters: polycistrons with oncogenic roles in hepatocellular carcinoma ［J］. World J Gastroenterol， 2014， 20（20）: 5962-5972.

Correlation of miR-92a in plasma with prognosis in osteosarcoma

MENG Wei1， ZHANG Li2， LI Jianwei3， WEI Min4
（1.Institute of Genetic Engineering， Southern Medical University， Guangzhou 510515，Guangdong Province， China； 2.Department of Interventional Radiology， 535 Hospital of PLA， Huaihua 418008， Hunan Province， China； 3.Department of Orthopaedics， Nanfang Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510515， Guangdong Province， China； 4.Clinical Laboratory， Nanshan Maternity and Child Healthcare Hospital， Shenzhen 518054， Guangdong Province， China）Correspondence to: WEI Min E-mail: mengwei_126@126.com

Background and purpose: Osteosarcoma is the most common primary malignant bone tumor in the children and young adults. Until now， there is no prognostic indicator with high specificity and high sensitivity. This study investigated the relationship between miR-92a level in palsma and clinical pathological characteristics， as well as the prognosis in osteosarcoma. Methods: The plasma from 30 healthy volunteers who underwent physical examination and from 45 cases of osteosarcoma before and after operation were collected. The miR-92a level was detected by realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction （RTFQ-PCR） method. According to the relative expression ≥5 of miR-92a， the osteosarcoma patients were divided into 2 groups: miR-92a high expression group and low expression group. Results: The miR-92a level in palsma from osteosarcoma is significantly higer than that from healthy volunteers. Before surgery， the miR-92a level was markedly higher than after surgery. There was no correlation between the miR-92a level and the gender， age， tumor location， tumor size and histological type. However， significant correlation was found with Enneking grade， tumor cell necrosis rate and lung metastasis. Compared with the low-expression group， high miR-92a expression was associated with a significantly shorter overall survival using Kaplan-Meier analysis （P=0.035）. Conclusion: The results suggest a significant relationship between miR-92a and survival ratio. miR-92a expression level may be a useful prognostic indicator in osteosarcoma.

Osteosarcoma； miR-92a； Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.08.005

R738.1

A

1007-3639（2016）08-0670-05

危 敏 E-mail：mengwei_126@126.com

（2016-02-01

2016-04-01）