重組人TRAIL蛋白聯(lián)合順鉑對人卵巢癌細胞生長及凋亡的影響

馮 忻，王彩霞，歐志英

1.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合腫瘤中心，廣東 廣州 510310

2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東 廣州 510623；

3.武警廣東總隊醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510507

重組人TRAIL蛋白聯(lián)合順鉑對人卵巢癌細胞生長及凋亡的影響

馮 忻1，2，王彩霞3，歐志英2

1.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合腫瘤中心，廣東 廣州 510310

2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東 廣州 510623；

3.武警廣東總隊醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510507

背景與目的：研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子的相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）可以增強化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用。本研究旨在探討TRAIL與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對體外培養(yǎng)的卵巢癌細胞SKOV3和OVCAR3生長凋亡的影響及可能的誘導(dǎo)機制。方法：利用MTT法和流式細胞儀檢測在順鉑和重組人TRAIL蛋白共同作用下，SKOV3和OVCAR3細胞的增殖抑制效應(yīng)及細胞凋亡程度；并應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測藥物處理后TRAIL死亡受體DR4、DR5的mRNA表達水平；同時用蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測DR4、DR5的蛋白表達水平。結(jié)果：SKOV3和OVCAR3細胞均對TRAIL蛋白敏感，隨著TRAIL蛋白濃度的升高，細胞的生長抑制率可達64%；而TRAIL與順鉑聯(lián)合用藥對兩種細胞的抑制率均達到92%以上，對細胞的增殖抑制呈現(xiàn)高效協(xié)同作用，與單獨用藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TRAIL和順鉑聯(lián)合組兩種細胞凋亡率分別為（31.50±0.79）%和（36.60±1.31）%，顯著高于單獨用藥組；RTFQ-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，SKOV3和OVCAR3細胞在TRAIL與順鉑聯(lián)合用藥后，死亡受體DR4、DR5表達水平均顯著上調(diào)。結(jié)論：在體外，TRAIL與化療藥物順鉑聯(lián)用能明顯抑制卵巢癌細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。TRAIL能明顯增強順鉑對卵巢癌細胞的敏感性，其誘導(dǎo)機制可能與死亡受體DR4、DR5表達水平上調(diào)有關(guān)。

卵巢癌；腫瘤壞死因子的相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體；順鉑；死亡受體；細胞凋亡

卵巢癌是嚴重危害女性健康的疾病之一，致死率較高，治療方法有手術(shù)治療、放療和化療等，其中以鉑類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是主要的治療手段。鉑類藥物的耐藥性及其極強的不良反應(yīng)，使尋找新的、更有效的殺滅腫瘤細胞的治療方法迫在眉睫。近年來，有關(guān)細胞凋亡的研究已成為尋找新的化療方法和提高化療療效的研究熱點。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）是一類導(dǎo)致細胞凋亡的重要細胞因子，TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）是TNF超家族中的新成員，能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，而對正常組織和細胞沒有明顯的毒性［1］。Sheridan等［2］的研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL可以增強化療藥物對人肝癌細胞的殺傷作用。對人肝癌細胞HepG2的研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL聯(lián)合化療藥物可以通過上調(diào)死亡受體DR5的表達誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，而死亡受體DR4的表達變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義［3］。前期的研究充分說明了TRAIL在細胞凋亡中的作用，其與化療藥物聯(lián)合對細胞的增殖抑制呈現(xiàn)高效協(xié)同作用。然而，TRAIL誘導(dǎo)凋亡作用的機制是否通過DR4或DR5的表達變化實現(xiàn)，在不同種類腫瘤細胞和不同研究成果上存在差異［4-5］。這就需要更深入地研究TRAIL對特定腫瘤細胞的殺傷作用及其機制。本實驗研究了TRAIL蛋白及化療藥物順鉑與TRAIL聯(lián)合作用對人卵巢癌細胞株SKOV3和OVCAR3生長及凋亡的影響。同時，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）和蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）研究化療藥物順鉑與TRAIL蛋白聯(lián)合作用對TRAIL死亡受體DR4、DR5表達水平的影響，最終證明TRAIL與順鉑聯(lián)合對卵巢癌細胞產(chǎn)生協(xié)同殺傷作用，為提高化療療效及進一步的臨床應(yīng)用提供了良好的實驗室基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1 實驗材料

重組人TRAIL蛋白購自德國PromoCell公司；MTT和二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）購自美國Sigma公司；RNA提取試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；RTFQ-PCR試劑盒購自美國Fermentas公司；DR4和DR5抗體及其二抗購自美國Santa Cruz公司；BCA蛋白定量試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光底物購自美國Pierce公司；引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成；Annexin V FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；酶標儀為Thermo Multiskan MK3；流式細胞儀為美國BD Accuri C6；RTFQ-PCR儀為ABI ViiA 7；卵巢癌細胞株SKOV3和OVCAR3購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所細胞庫。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT檢測細胞增殖

順鉑與不同濃度TRAIL蛋白聯(lián)合用藥抑制SKOV3和OVCAR3細胞生長量效曲線的測定：分別取對數(shù)生長期的SKOV3和OVCAR3細胞2.5×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后加入含有順鉑（5 μg/mL）和不同濃度TRAIL蛋白（0、10、20、 50、100、200和400 ng/mL）的培養(yǎng)基200 μL，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測吸光度（D490）值。同樣分別取對數(shù)生長期的SKOV3和OVCAR3細胞接種于96孔培養(yǎng)板，分為4組：空白對照組、TRAIL（200 ng/mL）組、順鉑組（5 μg/mL）和聯(lián)合用藥組（TRAIL 200 ng/mL+順鉑5 μg/mL），每組設(shè)4個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72、96和120 h后，MTT法檢測D490值。得到數(shù)值后按如下公式進行計算：細胞生長抑制率（%）=［1-（D試驗-D空白）/（D對照-D空白）］×100%。

1.2.2 流式細胞儀檢測TRAIL對SKOV3和OVCAR3細胞凋亡的影響

分別取對數(shù)生長期的SKOV3和OVCAR3細胞2.5×105個/孔接種于6孔板，分為4組：空白對照組、TRAIL組（200 ng/mL）、順鉑組（順鉑5 μg/mL）和聯(lián)合用藥組（TRAIL 200 ng/mL+順鉑5 μg/mL），每組3孔，溫箱中培養(yǎng)24 h后，收集細胞，以流式細胞儀測定各組細胞凋亡率，重復(fù)3次。

1.2.3 RTFQ-PCR檢測化療藥物對SKOV3和OVCAR3細胞DR4、DR5的mRNA表達水平的影響

細胞分組及處理同1.2.2。首先采用RNA提取試劑盒提取細胞的總RNA，用紫外分光光度計測定其濃度及純度。參照RTFQ-PCR的試劑盒操作說明，以上述準備好的總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。采用2×SYBR Green PCR Master Mix，以獲得的適量cDNA為模板，用25 μL反應(yīng)體系進行擴增，每個待測樣本設(shè)置3個平行樣本，分別檢測DR4和DR5基因，并以GAPDH基因為內(nèi)參照，具體的引物序列如下：

DR4-F：5'-GTGGCTGTGCTGATT GTCTGTT-3'；DR4-R：5'-GCGTTGCTCA GAATCTCGTTG-3'；DR5-F：5'-TCTCCCA CCTCAGCCATCCAA-3'；DR5-R：5'-CGAGA CCACCCTGAGCAACAT-3'；GAPDH-F：5'-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3'； GAPDH-R：5'-GCGGCGCAATACGAA TGCCCC-3'。

1.2.4 Western blot檢測化療藥物對SKOV3和OVCAR3細胞DR4和DR5的蛋白表達水平的影響

取細胞裂解液并用Western blot檢測DR4和DR5蛋白表達水平，掃描顯影條帶，采用Phoretix 2D軟件進行灰度值分析，以同一樣品的DR4、DR5與GAPDH條帶的灰度值比值作為DR4和DR5蛋白的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 12.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1 順鉑與不同濃度的TRAIL蛋白聯(lián)合作用對SKOV3和OVCAR3細胞生長的影響

在順鉑終質(zhì)量濃度為5 μg/mL的情況下，隨著TRAIL蛋白濃度的升高，其對SKOV3和OVCAR3細胞生長抑制率均升高，即細胞生長抑制率與TRAIL蛋白存在正相關(guān)的濃度-效應(yīng)關(guān)系。同時，在TRAIL質(zhì)量濃度為200 ng/mL時，兩種細胞的生長抑制率明顯升高（P＜0.05），故選擇200 ng/mL作為后續(xù)實驗TRAIL蛋白最佳工作濃度（圖1）。

圖 1 SKOV3和OVCAR3細胞在順鉑與不同濃度TRAIL作用下的生長抑制曲線Fig. 1 Inhibitory curves of SKOV3 and OVCAR3 cells at the different concentrations of cisplatin and TRAIL

2.2 順鉑與TRAIL蛋白聯(lián)合作用不同時間段對SKOV3和OVCAR3細胞生長的抑制效果

隨著藥物作用時間的逐漸延長，三組不同條件下的細胞在不同時間段的抑制率均與時間長短成正比關(guān)系，且三組用藥效果中聯(lián)合用藥組的抑制率升高更明顯（圖2），一定程度上說明順鉑與TRAIL蛋白的聯(lián)合使用具有協(xié)同效果。

2.3 TRAIL聯(lián)合順鉑對SKOV3和OVCAR3細胞凋亡的影響

收集細胞，采用Annexin V FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒染色后，使用BD Accuri C6流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。對SKOV3和OVCAR3各組細胞凋亡率進行統(tǒng)計分析，空白對照組為0.23±0.06和0.17±0.06，TRAIL組為9.20±0.44和7.56±1.25，順鉑組為12.80±0.76和10.60±0.78，聯(lián)合用藥組為31.50±0.79和36.60±1.31。順鉑和TRAIL蛋白均可引起細胞凋亡率增加，且當兩者同時存在時，促凋亡作用更加明顯，超過兩種藥物效果的疊加（P＜0.05），這從細胞凋亡率變化上驗證了順鉑與TRAIL蛋白的聯(lián)合使用具有協(xié)同效果（圖3）。

圖 2 順鉑與TRAIL蛋白聯(lián)合作用不同時間SKOV3和OVCAR3細胞的生長抑制曲線Fig. 2 The growth inhibitory curves of SKOV3 and OVCAR3 cells at different time by cisplatin and TRAIL protein

圖 3 TRAIL聯(lián)合順鉑對SKOV3和OVCAR3細胞凋亡的影響Fig. 3 The effect of TRAIL combined with cisplatin on apoptosis of SKOV3 and OVCAR3 cells

2.4 TRAIL聯(lián)合順鉑對SKOV3和OVCAR3細胞中DR4、DR5的mRNA表達水平的影響

使用RTFQ-PCR檢測DR4和DR5的mRNA表達情況，選取空白組樣品作為對照，其余樣品相對于這個樣品的相對表達量進行統(tǒng)計分析。DR4的mRNA表達情況為：在SKOV3細胞中，TRAIL組為3.56±0.30，順鉑組為4.64±0.23，聯(lián)合用藥組為13.60±0.31；在OVCAR3細胞中，TRAIL組為2.53±0.13，順鉑組為2.84±0.15，聯(lián)合用藥組為10.60±0.54。DR5的mRNA的表達情況為：在SKOV3細胞中，TRAIL組為2.81±0.24，順鉑組為2.96±0.14，聯(lián)合用藥組為8.51±0.36；在OVCAR3細胞中，TRAIL組為2.40±0.18，順鉑組為2.43±0.13，聯(lián)合用藥組為8.71±0.67。聯(lián)合用藥后SKOV3和OVCAR3細胞的DR4、DR5表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05，圖4）。三組間的上調(diào)變化趨勢與細胞凋亡率變化趨勢相似，說明細胞凋亡可能是通過死亡受體DR4和DR5的變化實現(xiàn)的。

2.5 TRAIL聯(lián)合順鉑對SKOV3和OVCAR3細胞中DR4和DR5蛋白表達水平的影響

通過Western blot分別檢測SKOV3和OVCAR3細胞在TRAIL和順鉑聯(lián)合作用下，其DR4和DR5蛋白表達的情況，實驗均重復(fù)3次（圖5）。對DR4和DR5蛋白表達的相對含量進行方差分析，結(jié)果見圖6。兩種細胞中TRAIL組和順鉑組的DR4和DR5蛋白表達均比空白對照組的高，而聯(lián)合用藥組的表達水平升高程度更明顯，說明TRAIL和順鉑兩種藥物對DR4和DR5蛋白表達水平的升高具有協(xié)同作用，三組間的蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。從蛋白水平上驗證了三組間DR4和DR5表達水平的變化，與RTFQ-PCR的結(jié)果相符。

圖 4 TRAIL聯(lián)合順鉑對SKOV3和OVCAR3 細胞 DR4、DR5的mRNA相對表達量結(jié)果Fig. 4 The relative expression levels of DR4 and DR5 mRNA in each group

圖 5 SKOV3和OVCAR3細胞的DR4和DR5蛋白表達情況Fig. 5 The expression levels of DR4 and DR5 in SKOV3 and OVCAR3 cells

圖 6 SKOV3和OVCAR3 細胞DR4和DR5蛋白的相對含量比較Fig. 6 The relative expression levels of DR4 and DR5 proteins in SKOV3 and OVCAR3 cells

3　討　論

TRAIL是新發(fā)現(xiàn)的TNF超家族成員，能迅速誘導(dǎo)表達TRAIL特異受體的細胞發(fā)生凋亡。目前發(fā)現(xiàn)的TRAIL受體有5種：死亡受體DR4和DR5（含有死亡結(jié)構(gòu)域并能向細胞內(nèi)傳遞死亡信號，當TRAIL與DR結(jié)合時可以誘導(dǎo)靶細胞凋亡）、誘騙受體DcR1和DcR2（當TRAIL與DcR結(jié)合時可以逃避TRAIL誘導(dǎo)的細胞凋亡）及可溶性受體OPG（主要起調(diào)節(jié)骨密度的功能）。TRAIL與死亡受體結(jié)合可選擇性地誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡，而對大多數(shù)正常細胞無明顯的殺傷作用［6］。這一特性使其成為尋找新的化療方法和提高化療療效的研究熱點。順鉑是臨床常用的化療藥物之一，具有抗癌譜廣、療效確切等特點，但其不良反應(yīng)嚴重且長期使用容易產(chǎn)生耐藥性。順鉑與其他抗癌藥物聯(lián)用，可以顯著抑制腫瘤細胞的生長增殖，成為眾多學(xué)者研究的熱點。如辛二酰苯胺異羥肟酸可以有效增強口腔鱗癌細胞對低劑量順鉑的敏感性，減少順鉑的使用量［7］。

陳儒新［8］研究TRAIL與卡鉑對人卵巢癌細胞A2780凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)TRAIL聯(lián)合卡鉑使細胞增殖受到明顯抑制，凋亡率升高。胡文獻等［9］使用杭白菊提取液和重組腺病毒介導(dǎo)的TRAIL基因聯(lián)合作用于人大腸癌細胞株DLD1，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡率和TRAIL的死亡受體DR4和DR5表達水平均顯著上調(diào)，推斷DR4和DR5在TRAIL誘導(dǎo)的細胞凋亡中起作用。本文研究了TRAIL與順鉑對兩種常見的卵巢癌細胞株SKOV3和OVCAR3凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)其對細胞的增殖抑制呈現(xiàn)高效協(xié)同作用，誘導(dǎo)凋亡機制可能與死亡受體DR4、DR5表達水平上調(diào)有關(guān)，這與Arts等［10］對臨床卵巢癌患者的研究結(jié)果相符。本研究進一步探討了TRAIL與鉑類化療藥物對卵巢癌細胞的促凋亡作用，豐富了已有研究成果。

目前，臨床上針對腫瘤的治療主要采用手術(shù)和放化療相結(jié)合的方法，但效果并不理想。放化療殺傷腫瘤細胞的同時也會對人體正常細胞產(chǎn)生殺傷作用，極大限制了其應(yīng)用。TRAIL以其高效低毒的生物學(xué)特點，給腫瘤治療帶來了新的希望。因此，充分研究TRAIL與其受體之間的關(guān)系，深入探討TRAIL與放化療聯(lián)合作用誘導(dǎo)凋亡的機制，為我們提供了一條治療腫瘤的新思路。

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Effect of recombinant human TRAIL protein combined with cisplatin on the growth and apoptosis of

human ovarian cancer cells

FENG Xin1，2， WANG Caixia3， OU Zhiying2
（1.TCM-Integrated Hospital of Southern Medical University， TCM-Integrated Cancer Center of Southern Medical University， Guangzhou 510310， Guangdong Province， China； 2.Guangzhou Women and Children's Medical Center， Guangzhou 510623， Guangdong Province， China； 3. Department of Gynaecology and Obstetrics， Armed Police Corps Hospital of Guangdong， Guangzhou 510507， Guangdong Province， China）
Correspondence to: FENG Xin E-mail: xinf@hotmail.com

Background and purpose: The study has found that tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand （TRAIL） can enhance the cytotoxic effect of chemotherapeutic drugs on tumor cells. The aim of our study was to investigate the effects of the tumor TRAIL and cisplatin combined application on the growth and apoptosis of human ovarian cancer cell lines SKOV3 and OVCAR3， and the possible mechanism. Methods: Under the combined application of cisplatin and TRAIL， MTT method and flow cytometry were used to detect the proliferation and apoptosis of SKOV3 of OVCAR3 cells； the mRNA expression levels of death receptors， DR4 and DR5， were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （RTFQ-PCR）. At the same time， the protein expression levels of DR4 and DR5 were detected by Western blot. Results: SKOV3 and OVCAR3 cells were sensitive to TRAIL protein， and with the increasing of TRAIL protein concentration， cell growth inhibitory rate up to 64%. When thecombination application of TRAIL and cisplatin， the inhibition rate of the two cells reached more than 92%， and the two drugs showed high synergistic effect， compared with the single drug group （P＜0.05）. Flowcytometry analysis indicated that the synergistic killing effect of TRAIL and cisplatin was mainly due to the cell apoptosis. RTFQ-PCR and Western blot detection results showed that the DR4 and DR5 were up-regulated under the combined application of TRAIL and cisplatin. Conclusion: In vitro， TRAIL and cisplatin combined application can significantly inhibit the proliferation of human ovarian cancer cells and induce tumor cell apoptosis. TRAIL can obviously enhance the sensitivity of cisplatin to tumor cells. The mechanism may be related to the increased death receptor DR4 and DR5 expression level.

Ovarian cancer； Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand； Cisplatin； Death receptor； Apoptosis

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.08.002

R737.31

A

1007-3639（2016）08-0648-07

廣東省自然科學(xué)基金項目（S2013010016011）。

馮 忻 E-mail：xinf@hotmail.com

（2015-04-07

2015-11-10）