斯鈣素1的表達對肺癌細胞A549細胞周期及凋亡的影響

李妮婭，左雪梅，李 莉，劉 華，杜玉珍

1.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院檢驗科，上海200233

2.上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院檢驗科，上海 200050

斯鈣素1的表達對肺癌細胞A549細胞周期及凋亡的影響

李妮婭1，左雪梅2，李 莉1，劉 華1，杜玉珍1

1.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院檢驗科，上海200233

2.上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院檢驗科，上海 200050

背景與目的：斯鈣素1（stanniocalcin l，STC1）在多種癌組織中表達上調(diào)，且與癌組織的惡性程度相關(guān)，但STC1在肺癌細胞中的分子作用機制尚不明確。本研究旨在探討STC1的表達對肺癌細胞A549細胞周期及凋亡的影響。方法：構(gòu)建STC1基因RNA干擾的肺癌細胞株A549-STC1-siRNA和對照細胞株A549-Vector，用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）和蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測A549-Vector及A549-STC1-siRNA細胞株的細胞周期蛋白基因CyclinA、CyclinB1、CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4，凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-xl及凋亡誘導基因Caspase-3、Bax、Bak、Bid的表達水平，用流式細胞術(shù)檢測STC1基因?qū)549細胞周期的影響，用原位末端標記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick-end labeling，TUNEL）檢測STC1基因?qū)549細胞凋亡的影響。結(jié)果：與A549-Vector細胞相比，A549-STC1-siRNA的細胞周期蛋白基因CyclinA、CyclinB1、CyclinD1、CyclinE、CDK2和CDK4在轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平上均顯著減少（P＜0.05），G0/G1期細胞比例明顯增加，S期及G2/M期細胞比例降低（P＜0.05），細胞周期受阻；A549-STC1-siRNA的凋亡抑制基因Bcl-2和Bcl-xl表達下調(diào)（P＜0.05），而凋亡誘導基因Caspase-3、Bax、Bak及Bid顯著上調(diào)（P＜0.05）；TUNEL實驗表明，A549-STC1-siRNA細胞的凋亡率明顯增加。結(jié)論：STC1基因的低表達可阻滯肺癌細胞A549的細胞周期，抑制細胞增殖，同時促進細胞凋亡。

斯鈣素1；RNA干擾；細胞周期；細胞凋亡

斯鈣素（stanniocalcin，STC）是一種最先在硬骨魚中被發(fā)現(xiàn)的糖蛋白激素，可調(diào)節(jié)鈣磷穩(wěn)定，防止血鈣過高。在哺乳動物細胞中STC基因可分為STC1和STC2，人類STC1定位于染色體的8p11.2-p21上，包含4個外顯子，可編碼247個氨基酸殘基的多肽［1-2］。STC1在哺乳動物心、肺、肝、腎、卵巢和甲狀腺等多種組織內(nèi)均有表達［3-4］，以旁分泌或自分泌形式參與多種生理過程的調(diào)節(jié)，如妊娠和血管生成等［5-6］。多項研究顯示，STC1在多種腫瘤組織中的表達量上調(diào)，并與腫瘤組織的惡性程度相關(guān)［7-11］，且在非小細胞肺癌患者外周血液中，STC1的表達量明顯高于其他肺部非腫瘤疾病患者與健康對照組［9］，因此推測STC1的表達與肺部腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。但既往的研究多基于組織和外周血蛋白水平，對STC1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的分子作用機制報道較少，因此本文擬通過RNA干擾實驗，探討在分子和細胞水平STC1基因表達對肺癌細胞A549細胞周期進程和凋亡的影響，進一步分析STC1在肺癌發(fā)展進程中的作用。

1　材料和方法

1.1 主要材料與試劑

肺癌A549和293T細胞購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）；細胞培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）購自美國Gibco公司；SYBR Green PCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司；感受態(tài)細胞DH5α和High Pure dNTPs購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國Omega公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；RNA干擾載體PLKO.1、PCMV-U6和PLKO.1-EGFP購自美國Addgene公司；鼠抗人STC1抗體購自美國Sigma公司；鼠抗人CyclinA、CyclinE、Bcl-xl、Bak和Bid購自英國Abcam公司；鼠抗人Capase-3、CDK2、CDK4、CyclinD1、CyclinB和GAPDH購自美國CST公司；鼠抗人Bcl-2和Bax抗體購自美國Santa Cruz公司。HRP標記羊抗鼠IgG購自碧云天生物技術(shù)研究所；0.25%胰蛋白酶購自基爾頓生物科技（上海）有限公司；TUNEL試劑盒購自瑞士Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

肺癌A549和293T細胞用含10%胎牛血清的DMEM，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 STC1 siRNA轉(zhuǎn)染A549細胞

針對STC1 mRNA的開放讀碼框（位點369～392），通過Ambion網(wǎng)站設(shè)計siRNA（5'-AATTCAAAAAGGGTGCAGGA AGAGTGCTACAGCAACCTACGTACTTGC TGTAGCACTCTTCCTGCACC-3'）和siRNANC（5'-AATTCAAAAAGGGTGCAGGAAGAGTGC TACAGCAACCTACGTACTTGCTGTAGCACTCTT CCTGCACC-3'）。經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司合成的siRNA溶解于退火緩沖液中，95 ℃水浴10 min后取出置于室溫自然冷卻，形成帶黏性末端的雙鏈。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒，將空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞作為對照組（A549-Vector）；STC1 siRNA與陰性siRNA分別與脂質(zhì)體按1∶2的比例轉(zhuǎn)染293T細胞，細胞培養(yǎng)48 h后收集慢病毒顆粒。慢病毒顆粒感染肺癌細胞A549，培養(yǎng)24～48 h后，篩選出STC1低表達的細胞株（A549-STC1-siRNA）。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測細胞周期蛋白基因和細胞凋亡相關(guān)基因的mRNA表達

收集肺癌A549-Vector和A549-STC1-siRNA細胞，總RNA按照Trizol試劑說明書進行提取，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA，配制RTFQ-PCR的反應(yīng)體系，相關(guān)基因的PCR引物見表1。反應(yīng)條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火及延伸45 s，40個循環(huán)。使用7 500 System SDS Software，選擇ddCt Study輸出數(shù)據(jù)，每個樣本都是3孔重復，使用時取各自Ct值的平均值，基因的相對表達分析采用2-ΔΔCt法計算。

1.2.4 蛋白［質(zhì)］印跡法（Western blot）檢測細胞周期蛋白基因及細胞凋亡相關(guān)基因的蛋白表達

收集肺癌細胞A549-Vector和A549-STC1-siRNA并抽提蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。20 μL蛋白經(jīng)10%PAGE膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，單次加入一抗STC1 1∶800、CyclinA 1∶300、CyclinB1 1∶20 000、CyclinD1 1∶2 000、CyclinE 1∶1 000、CDK2 1∶1 000、CDK4 1∶2 000、Bcl-2 1∶200、Bcl-xl 1∶1 000、Caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶150、Bak 1∶500和Bid 1∶500，室溫溫育2 h，TBST洗膜3次后加入HRP標記的二抗（1∶1 000稀釋），與膜37 ℃溫育1 h，用TBST洗滌3次后，經(jīng)ECL化學發(fā)光顯色、X光顯影并觀察結(jié)果。

表 1 RTFQ-PCR引物序列Tab. 1 RTFQ-PCR primer sequence

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化

1 000×g離心5 min，收集A549-Vector及A549-STC1-siRNA細胞，棄上清液，沉淀用含有胎牛血清的PBS溶液懸浮，后加入無水乙醇，置于-20 ℃冰箱內(nèi)固定細胞24 h以上；取出固定的樣品，再次3 000×g離心細胞30 s，棄上清液；用1 mL預冷的PBS將樣品洗滌2次；細胞沉淀用RNase A溶液懸浮后加入400 μL濃度為50 μL/mL的碘化丙啶溶液，避光染核10 min。用流式細胞儀進行細胞DNA含量的測定，確定細胞在各細胞周期中所占比例。

1.2.6 原位末端標記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick-end labeling，TUNEL）檢測細胞凋亡變化

培養(yǎng)好的A549-Vector及A549-STC1-siRNA細胞，經(jīng)多聚甲醛固定后，浸入胰蛋白酶內(nèi)消化40 min，PBS洗滌后加TUNEL反應(yīng)混合液，封口膜在37 ℃暗濕盒中反應(yīng)1 h，PBS洗滌3次，每次3 min；加POD于標本上，封口膜在37 ℃暗濕盒中反應(yīng)30 min，PBS洗滌3次，每次3 min；DAB染色3～10 min，自來水沖洗，蘇木精復染，0.1%鹽酸酒精分化，在顯微鏡下觀察，控制染色程度。抗熒光猝滅封片液封片后使用顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理

2　結(jié)　果

2.1 構(gòu)建STC1基因干擾的肺癌細胞A549-STC1-siRNA細胞株

通過Western blot檢測A549-Vector細胞及A549-STC1-siRNA細胞中STC1的表達量，結(jié)果顯示，與A549-Vector細胞相比，A549-STC1-siRNA細胞中STC1表達顯著降低（P＜0.05），干擾效率約為75%（圖1）。

圖 1 Western blot檢測A549-STC1-siRNA細胞系的STC1干擾效率Fig. 1 STC1 interference efficiency of A549-STC1-siRNA cells detected by Western blot

2.2 STC1基因低表達對A549細胞周期蛋白基因及凋亡相關(guān)基因表達的影響

在轉(zhuǎn)錄水平上RTFQ-PCR檢測的結(jié)果見圖2，以GAPDH基因作為內(nèi)參照，各基因表達量相對于GAPDH進行定量。與A549-Vector細胞相比，A549-STC1-siRNA細胞中CyclinA、CyclinB1、CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、Bcl-2和Bcl-xl基因表達水平降低，Caspase-3、Bax、Bak和Bid基因表達水平增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖 2 在轉(zhuǎn)錄本水平上STC1基因低表達對A549細胞周期蛋白和細胞凋亡相關(guān)基因表達差異的影響Fig. 2 Relative mRNA level of cell-cycle and apoptosis-related genes detected by RTFQ-PCR

Western blot檢測結(jié)果見圖3，以GAPDH蛋白作為內(nèi)參照，各蛋白表達量相對于GAPDH進行定量。A549-STC1-siRNA細胞中CyclinA、CyclinB1、CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4、Bcl-2和Bcl-xl蛋白表達量降低，Caspase-3、Bax、Bak和Bid蛋白表達量增高。與A549-Vector相應(yīng)蛋白表達量相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 STC1基因低表達對A549細胞周期的影響

流式細胞術(shù)檢測A549-Vector和A549-STC1-siRNA細胞周期見圖4。A549-STC1-siRNA細胞中G0/G1期細胞比例明顯增加（P＜0.05），S期及G2/M期細胞比例降低（P＜0.05），細胞周期阻滯于G0/G1期。

2.4 STC1低表達對A549細胞凋亡的影響

TUNEL檢測A549-Vector和A549-STC1-siRNA細胞的凋亡情況見圖5。與A549-Vector細胞株相比，A549-STC1-siRNA細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）。

圖 3 在蛋白水平上STC1基因低表達對A549細胞周期蛋白和細胞凋亡相關(guān)基因表達差異的影響Fig. 3 Relative protein level of cell-cycle- and apoptosis-related genes detected by Western blot

圖 4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期Fig. 4 Cell cycle detected by flow cytometry

圖 5 TUNEL法檢測A549-Vector和A549-STC1-siRNA細胞的凋亡情況Fig. 5 Apoptosis of cells detected by TUNEL assay

3　討　論

STC1與多種癌癥如RCC、甲狀腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌等的發(fā)生密切相關(guān)［7-11］，且在癌組織中含量越高，預示患者的預后越差［12-13］。目前，有研究認為，STC1可能參與腫瘤細胞的增殖與凋亡過程［7，14］，進而對癌癥的發(fā)展起調(diào)控作用。本研究顯示，STC1基因的低表達可減弱A549中細胞周期蛋白基因CyclinA、CyclinB1、CyclinD1、CyclinE、CDK2和CDK4的表達，導致細胞周期阻滯于G0/G1期；同時STC1基因的低表達還可下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2和Bcl-xl，上調(diào)凋亡誘導基因Caspase-3、Bax、Bak和Bid，促進細胞的凋亡進程。本研究在分子水平上，揭示了STC1與A549細胞周期和細胞凋亡變化的關(guān)聯(lián)性。

細胞周期失控是細胞增殖異常而導致癌變的重要原因，細胞周期的不同時相由不同的細胞周期蛋白控制，CyclinA、CyclinB1、CyclinD1和CyclinE可與CDK2和CDK4形成Cycin-CDK復合物，磷酸化不同的底物，調(diào)控細胞周期的不同階段，促進細胞周期的完整與循環(huán)過程。已有研究顯示，CyclinACDK2除參與細胞周期調(diào)控外，還可通過磷酸化Rad9來參與細胞凋亡［15］；CyclinB1、CyclinD1和CyclinE表達異?？蓪е录毎芷诋惓?，誘導腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［16-18］；干擾CDK4的表達能抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖［7，19］。本研究顯示，STC1基因表達的抑制可下調(diào)肺癌細胞A549中CyclinA、CyclinB1、CyclinD1、CyclinE、CDK2和CDK4的表達，影響細胞周期相關(guān)的信號通路，導致細胞停留G0/G1期，抑制癌細胞增殖。

細胞凋亡的發(fā)生受凋亡抑制基因和凋亡誘導基因調(diào)控。Bcl-2和Bcl-xl是凋亡抑制基因［18，20-21］，Caspase-3、Bax、Bak和Bid是凋亡誘導基因［17-18，22-23］。凋亡抑制基因的表達下調(diào)，同時凋亡誘導基因的表達上調(diào)，可促進細胞的凋亡。本研究顯示，STC1基因的低表達可抑制肺癌細胞A549凋亡抑制基因Bcl-2和Bcl-xl的表達，同時，刺激凋亡誘導基因Caspase-3、Bax、Bak和Bid的高表達，導致A549-STC1-siRNA細胞凋亡增加。

本研究在細胞和分子水平上揭示了抑制STC1基因表達，可阻滯肺癌細胞A549細胞周期進程和促進細胞凋亡，從而起到抑癌作用，同時也預示著STC1可能成為一個肺癌個性化治療的新方向，但本研究僅是STC1體外實驗的初探，在人體內(nèi)抑制STC1的表達是否能起到抑癌作用，有待進一步研究。

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Effects of stanniocalcin l on cell cycle and apoptosis of lung cancer A549 cells

LI Niya1， ZUO Xuemei2，LI Li1， LIU Hua1， DU Yuzhen1
（1.Department of Laboratory Medicine， Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People's Hospital， Shanghai 200233， China； 2.Department of Laboratory Medicine， Tongren Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 200050， China）
Correspondence to: DU Yuzhen E-mail: duyuzhen2005@163.com

Background and purpose: Stanniocalcin 1 （STC1） has been reported to be up-regulated in various cancer tissues， and related to malignancy degree of cancer. However， the molecular mechanism of STC1 in lung cancer cells is still not clear. This experiment aimed to investigate the effects of STC1 on cell cycle and apoptosis of lung cancer A549 cells. Methods: A549 cells were transfected with validated siRNA for STC1 A549-STC1-siRNA and a negative control vector RNA A549-Vector. The gene and protein expression of cell cycle-related genes， including CyclinA， CyclinB1， CyclinD1， CyclinE， CDK2 and CDK4， as well as apoptosis-inhibiting genes Bcl-2， Bcl-xl and apoptosis-inducing genes Caspase-3， Bax， Bak and Bid， were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （RTFQ-PCR） and Western blot. The cell cycle distribution was determined with flow cytometry. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick-end labeling （TUNEL） was used to detect cell apoptosis. Results: After transfection with STC1-siRNA， the gene and protein expression of CyclinA， CyclinB1， CyclinD1， CyclinE， CDK2 and CDK4 decreased significantly in A549 cells （P＜0.05）. The proportion of cells in G0/G1phase significantly increased，whereas the proportion of cells in S phase and G2/M phase decreased （P＜0.05）. The cell cycle was blocked at G0/G1phase. Furthermore， compared with that in A549-Vector， the gene and protein expression of Bcl-2 and Bcl-xl in A549-STC1-siRNA was reduced significantly （P＜0.05）， while the expression of apoptosis-inducing genes Caspase-3， Bax，Bak and Bid increased obviously （P＜0.05）. In addition， the percentage of apoptotic cells significantly increased in A549-STC1-siRNA compared with that in A549-Vector detected by TUNEL method. Conclusion: Down-regulation of STC1 by RNAi can block the cell cycle of A549 cells， inhibit cell proliferation， and promote cell apoptosis.

Stanniocalcin l； RNA interference； Cell cycle； Apoptosis

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.08.001

R734.2

A

1007-3639（2016）08-0641-07

上海巿衛(wèi)生計生委課題（201540118）。

杜玉珍 E-mail：duyuzhen2005@163.com

（2015-11-03

2016-03-05）