漆酶轉(zhuǎn)化對氨基苯胂酸的研究

師元元，季躍飛，陸雋鶴

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京　210095）

漆酶轉(zhuǎn)化對氨基苯胂酸的研究

師元元，季躍飛，陸雋鶴*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京210095）

為全面了解對氨基苯胂酸（ARS）在環(huán)境中的歸趨，研究了ARS在漆酶與鄰苯二酚或丁香酸兩種腐植酸模型化合物共同存在時的轉(zhuǎn)化過程及產(chǎn)物鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在漆酶-ARS單一體系中，漆酶并不能降解ARS；當(dāng)體系中加入鄰苯二酚或者丁香酸時，ARS的降解效果顯著，且漆酶-鄰苯二酚體系中ARS的轉(zhuǎn)化更加徹底。在反應(yīng)過程中，鄰苯二酚和丁香酸首先在漆酶的作用下氧化成為1，2-醌和1，4-醌，然后分別和ARS發(fā)生親核加成反應(yīng)，形成聚合物，產(chǎn)物中均沒有發(fā)現(xiàn)砷酸基團的脫落，始終以有機胂形態(tài)存在。

對氨基苯胂酸；漆酶；鄰苯二酚；丁香酸；親核加成

師元元，季躍飛，陸雋鶴，等.漆酶轉(zhuǎn)化對氨基苯胂酸的研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2016，35（4）：706-710.

SHI Yuan-yuan，JI Yue-fei，LU Jun-he，et al.Transformation of p-arsanilic acid by laccase catalyzed oxidative processes［J］.Journal of Agro-Environment Science，2016，35（4）：706-710.

對氨基苯胂酸（p-arsanilic，ARS）是一種飼料添加劑，具有良好的促生長和廣譜殺菌作用，被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)［1］。ARS不易在動物體內(nèi)累積，80%～90%的ARS幾乎以藥物原型隨糞便排出體外［2］。這些ARS通過糞便施肥進入土壤，可以被植物吸收；也可以通過吸附、淋溶等途徑在環(huán)境中發(fā)生遷移，進入到地表水和地下水；還可以在物理、化學(xué)和微生物等因素的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)變?yōu)檫w移能力更強、毒性更大的三價和五價的無機砷化合物［3］，對環(huán)境造成嚴重污染。王付民等［4］對廣東省長期使用ARS為飼料添加劑的15個大型豬場的周圍環(huán)境進行了調(diào)查，結(jié)果表明，周邊長期使用豬糞為肥料的甘薯地土壤的砷含量高達25.83～55.51 mg·kg-1，遠遠大于自然界砷的背景值，而甘薯根內(nèi)的總砷含量高達國家規(guī)定的最高檢出限0.5 mg·kg-1的3～6倍。

近用來，氧化耦合反應(yīng)對環(huán)境中有機污染物歸趨的研究日益引起學(xué)術(shù)界的關(guān)注。氧化耦合反應(yīng)是指帶有酚或者苯胺官能團的化合物被氧化形成自由基或者醌類中間體，再通過共價鍵相互聚合［5］。這類反應(yīng)一般由某些天然金屬氧化物以及由植物或真菌分泌的體外氧化酶催化。氧化耦合反應(yīng)被認為在土壤腐殖化過程中起著重要作用，是土壤有機質(zhì)生成的主要機制之一［6］。過氧化物酶和酚氧化酶是最重要的兩大類能夠催化氧化耦合反應(yīng)的細胞體外酶。漆酶（Laccase）是一種常見的含銅多酚氧化酶，主要由漆樹或真菌分泌產(chǎn)生，它以氧氣作為電子受體，能催化氧化酚類、苯胺類等底物［7］。漆酶在廢水處理、生物漂白、有機污染控制等方面都具有重要的應(yīng)用［8］。

在漆酶作用下環(huán)境中苯胺類污染物可與腐植酸分子通過共價鍵形成結(jié)合態(tài)殘留［9］。在此過程中，漆酶首先氧化腐植酸分子中的苯酚結(jié)構(gòu)單元，將其轉(zhuǎn)化為醌類中間體，后者和苯胺類污染物發(fā)生親核加成反應(yīng)。根據(jù)加成位點的不同，又可分為1，2-加成和1，4-加成兩種途徑［10-11］。例如，鄰苯二醌中間體傾向于和苯胺通過1，4-加成進行聚合［11］，而對苯醌傾向于和苯胺類物質(zhì)發(fā)生1，2-加成［9，12］，然后進一步脫水生成Shiff堿。ARS也是苯胺類化合物，因此可以推測，ARS進入土壤后可能在酶或者金屬氧化物作用下，與土壤有機質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，本研究正是建立在這一假設(shè)的基礎(chǔ)之上。故選取鄰苯二酚和丁香酸模擬腐植酸的反應(yīng)活性，分別研究它們在漆酶存在下與ARS相互反應(yīng)的可能性，并結(jié)合質(zhì)譜（MS）和紅外光譜（FTIR）分析技術(shù)，對反應(yīng)的主要產(chǎn)物進行分析鑒定，探討反應(yīng)機理。本研究對探明ARS在環(huán)境中的歸趨具有重要意義，同時可為基于漆酶催化氧化的污染修復(fù)技術(shù)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

主要實驗試劑：Trametes versicolor菌漆酶（Sigma-Aldrich）、ARS（Sigma-Aldrich）、鄰苯二酚與丁香酸均購自國藥化學(xué)試劑公司、2-2’-連氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）（Sigma-Aldrich），甲醇為進口色譜純。所有溶液均用超純水（＞18.2 M贅）配置。

主要實驗儀器：日立L-2000型高效液相色譜儀；安捷倫G6410B型質(zhì)譜儀；布魯克-傅立葉紅外光譜儀（德國）；Varian Cary50紫外-可見分光光度計；SL1002N型電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；UP-10A型純水機（南京前沿儀器設(shè)備有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1酶活性的測定

采用紫外分光光度法以ABTS為底物測定漆酶活性［13］。分別取3 mL 0.3 mmol·L-1ABTS溶液（pH 3.8）和0.01 mL漆酶溶液加入1 cm比色皿中，配成混合溶液，檢測其在420 nm下吸光度的變化速率，重復(fù)3次，取平均值。漆酶酶活力單位（Act）定義為每分鐘氧化1 mol ABTS所需要的酶量，unit·mL-1。酶活性根據(jù)下式計算，其中r表示漆酶催化氧化ABTS產(chǎn)物在波長420 nm處的吸光度的變化速率，0.036為ABTS氧化產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)。

1.2.2反應(yīng)設(shè)計

反應(yīng)在30 mL玻璃瓶中進行，反應(yīng)液中含有ARS和一種腐植酸模型化合物（鄰苯二酚或丁香酸），ARS初始濃度為10滋mol·L-1，漆酶濃度1 unit·mL-1，加入0.01 mol·L-1檸檬酸-磷酸鹽緩沖液控制pH為6.8。反應(yīng)在室溫下進行，反應(yīng)過程中通過磁力攪拌器不斷攪拌來保證反應(yīng)所需氧氣。待反應(yīng)2 h后取樣0.5 mL，迅速用0.5 mL甲醇混合，使酶失活，終止反應(yīng)，利用高效液相色譜儀分析樣品中ARS的含量，每組樣品均設(shè)置未加酶液的底物溶液作為空白對照。并通過改變鄰苯二酚或丁香酸的濃度，分別考查它們對ARS轉(zhuǎn)化的影響。選擇6個不同鄰苯二酚和丁香酸濃度，分別為5、10、20、30、40、50滋mol·L-1，并分別在10、20、30、40、50、60 min后取樣分析。

1.3ARS的定量分析

樣品中ARS濃度采用高效液相色譜儀進行分析。采用C18反相色譜柱（Hitachi Lachrom，5滋m×250 mm），流動相采用V甲醇（1%乙酸）頤V水（1%乙酸）=20頤80等梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，進樣量為10滋L，紫外檢測器進行檢測。

1.3.1反應(yīng)產(chǎn)物MS分析

反應(yīng)在150 mL三角瓶中進行，ARS的初始濃度設(shè)為10滋mol·L-1，鄰苯二酚或丁香酸濃度為10滋mol· L-1，漆酶為1 unit·mL-1，待反應(yīng)30 min后，向反應(yīng)液中滴加3 mol·L-1的H2SO4溶液，將反應(yīng)液pH調(diào)節(jié)至2以下。再利用C18固相萃取柱（SPE）進行萃取，最后加入3 mL甲醇洗脫。設(shè)置未加入酶液的底物溶液作為空白對照。經(jīng)SPE萃取得到的樣品利用安捷倫G6410B型質(zhì)譜儀進行分析。質(zhì)譜入件為：電噴霧離子源（ESI）負離子模式檢測，利用氮氣作干燥氣，流速保持在10 L·min-1，干燥氣溫度350益。

1.3.2產(chǎn)物的FTIR分析

此反應(yīng)液準備同上，最后將反應(yīng)30 min的樣品經(jīng)冷凍干燥48 h后，利用傅里葉紅外光譜儀鑒定，測定入件為：波數(shù)范圍400～4000 cm-1，分辨率4 cm-1，光闌8 mm，掃描時間16 s。進行背景掃描后，將樣品KBr片放入樣品架，再放入樣品腔進行掃描，得到紅外光譜圖。

2　結(jié)果與討論

2.1ARS在漆酶催化作用下的轉(zhuǎn)化

ARS具有苯胺結(jié)構(gòu)，理論上可作為漆酶底物。但是當(dāng)1 unit·mL-1的漆酶和10滋mol·L-1的ARS溶液混合后，在1 h內(nèi)溶液中ARS濃度并未發(fā)生變化，如圖1所示，兩者之間的反應(yīng)并不明顯。當(dāng)溶液中加入50滋mol·L-1的鄰苯二酚或丁香酸時，ARS濃度迅速降低，反應(yīng)10 min后，ARS的濃度由初始的10滋mol· L-1分別降低到2.6、1.1滋mol·L-1左右。而預(yù)實驗表明不加漆酶的溶液中ARS并沒有和鄰苯二酚或丁香酸發(fā)生反應(yīng)。由此可以推測，鄰苯二酚或丁香酸和漆酶反應(yīng)生成的氧化產(chǎn)物對ARS的轉(zhuǎn)化起到了關(guān)鍵作用。圖2所示為ARS在含有不同濃度的鄰苯二酚或丁香酸溶液中的轉(zhuǎn)化。ARS的轉(zhuǎn)化率隨著共存的鄰苯二酚或丁香酸濃度的增加而增加，當(dāng)兩者濃度比達到1頤5時，ARS的轉(zhuǎn)化可達95%以上。對比鄰苯二酚和丁香酸，顯然后者對ARS的轉(zhuǎn)化更有效，在濃度比為1頤1時，鄰苯二酚溶液中ARS轉(zhuǎn)化率接近80%，而丁香酸溶液中的ARS轉(zhuǎn)化率僅為32%。

另外，在反應(yīng)過程中溶液的顏色發(fā)生了明顯變化，如圖3所示。鄰苯二酚存在時，反應(yīng)液由無色漸漸轉(zhuǎn)變成淺粉色；丁香酸存在時，反應(yīng)液則由無色逐漸轉(zhuǎn)變成米黃色。溶液顏色的變化表明反應(yīng)產(chǎn)生了顯色的官能團。由此推斷，反應(yīng)導(dǎo)致了ARS和鄰苯二酚或者丁香酸通過某種方式結(jié)合，生成了具有共軛結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。

圖1　漆酶、鄰苯二酚和丁香酸對ARS轉(zhuǎn)化的影響Figure 1　Effects of catechool and syringic acid on ARS removals

圖2　不同濃度的腐植酸模型化合物對ARS的影響Figure 2　Transformation of ARS at different concentrations of humic constituents

圖3　不同體系的顏色變化Figure 3　Changes of color after reaction

2.2產(chǎn)物分析

首先，本實驗利用FTIR對ARS的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進行了初步分析，采用全透射模式測定，結(jié)果如圖4所示（圖4a是ARS、鄰苯二酚及產(chǎn)物的紅外圖譜；圖4b為ARS、丁香酸及產(chǎn)物的紅外圖譜）。由圖4a可以看出，鄰苯二酚和ARS的產(chǎn)物在1720 cm-1處出現(xiàn)了較強的吸收峰，對應(yīng)于C=O伸縮振動；同時，鄰苯二酚的兩個較尖的O-H伸縮振動峰（3200～3450 cm-1）消失，而且ARS中-NH2伸縮振動峰在3400 cm-1處有所偏移。由此可推測產(chǎn)物中具有腫胺基團，因而反應(yīng)發(fā)生在ARS的氨基上。根據(jù)新生成的碳氮鍵及碳氧雙鍵，可以推斷ARS與鄰苯二酚氧化生成的醌之間生成了共價鍵。

丁香酸和ARS的產(chǎn)物在波數(shù)為1110、1643、1743 cm-1處同樣出現(xiàn)了較強的伸縮振動峰（圖4b），分別對應(yīng)于-OCH3、C=N、C=O的伸縮振動。不同于鄰苯二酚的是，產(chǎn)物出現(xiàn)了C=N雙鍵特征峰（1643 cm-1），表明可能生成了Shiff堿，同時產(chǎn)物中-COOH官能團的特征峰消失。由此推斷，丁香酸在漆酶的作用下氧化脫羧反應(yīng)形成了醌，后者和ARS的氨基反應(yīng)生成Shiff堿。

為了進一步明確產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，本實驗利用ESI/MS對ARS的產(chǎn)物進行分析，采用負離子模式，結(jié)果如圖5所示。圖5a為鄰苯二酚、ARS和漆酶混合溶液的質(zhì)譜，圖中出現(xiàn)了m/z 321.8的產(chǎn)物峰，與之對應(yīng)的物質(zhì)的分子量為323，為奇數(shù)。由此推測，該物質(zhì)含有N原子，而N原子來源于ARS。因此可以判斷，m/z 321.8由ARS的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物所產(chǎn)生。結(jié)合該產(chǎn)物的分子量，以及FTIR圖譜顯示含有的仲胺基團以及羰基這一特征，可推測此化合物是由ARS和鄰苯二醌發(fā)生親核加成的產(chǎn)物。鄰苯二酚被漆酶氧化形成了鄰苯二醌，然后ARS分子中的氨基進攻羰基的茁碳原子，發(fā)生1，4-加成，反應(yīng)過程如圖6a所示。

丁香酸、ARS和漆酶反應(yīng)混合液的質(zhì)譜如圖5b所示，和對照相比，MS圖出現(xiàn)了新峰m/z 366.2，其對應(yīng)化合物的分子量為367。同樣結(jié)合該產(chǎn)物的分子量與紅外圖譜顯示的C=N雙鍵，可以確定產(chǎn)物是一個Shiff堿。由ARS和一個羰基化合物縮合而成，后者由丁香酸在漆酶氧化脫羧生成。該反應(yīng)為1，2-親核加成，其過程如圖6b所示。

目前，我國還沒有禁止ARS的使用，排放到環(huán)境中的ARS是相當(dāng)可觀的，而且它的降解途徑的研究局限于微生物降解和光降解［14-15］。

圖4　ARS與腐植酸模型化合物產(chǎn)物的傅里葉紅外光譜圖Figure 4　ATR-FTIR spectra of reaction products of ARS in presence of model humics

圖5　腐植酸模型化合物存在時ARS的反應(yīng)產(chǎn)物Figure 5　MS of reaction products of ARS in presence of model humic

3　結(jié)論

在漆酶的作用下，ARS可以和鄰苯二酚或丁香酸通過共價鍵耦合形成聚合物。這一過程中鄰苯二酚或丁香酸首先在漆酶氧化下轉(zhuǎn)化為醌，產(chǎn)生缺電子碳位，隨后和ARS分子中的氨基發(fā)生親核加成反應(yīng)。由于類似鄰苯二酚或丁香酸的結(jié)構(gòu)單元在土壤有機質(zhì)分子中十分常見，而漆酶以及具有類似作用的過氧化物酶或者金屬氧化物在自然界中也普遍存在，通過共價鍵和土壤有機質(zhì)生成結(jié)合態(tài)殘留可能是ARS在土壤環(huán)境中的一個重要轉(zhuǎn)化途徑。

圖6　漆酶-腐植酸模型化合物體系催化氧化ARS的反應(yīng)機制Figure 6　Reaction pathway of ARS in laccase-model humic catalyzed treatment processes

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Transformation of p+arsanilic acid by laccase catalyzed oxidation process

SHI Yuan-yuan，JI Yue-fei，LU Jun-he*
（1.College of Resources and Environmental Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

p-Arsanilic acid（ARS），a veterinary feed additive promoting growth，may contaminate the environment.In the present study，transformation of ARS by laccase catalyzed oxidation process was investigated in the presence of catechol and syringic acid as representative humic constituents.Laccase alone could not decompose ARS.However，the presence of catechol or syringic acid facilitated ARS transformation.Fourier transform infred spectra（FTIR）and mass spectra（MS）analysis revealed that ARS was degraded via the formation of covalent bonds with quinone intermediates upon oxidation of catechol and syringic acid by laccase.In general，the reaction was a nucleophilic addition process with the aniline N acting as necleophile attacking the琢-carbon of the carbonyl group in the quinone molecules.The present findings suggest a transformation pathway of ARS in environment in addition to biodegradation and photolysis.

p-arsanilic；laccase；catechol；syringic acid；necleuphilic addition

X53

A

1672-2043（2016）04-0706-05

10.11654/jaes.2016.04.014

2015-11-15

江蘇高?！绖輰W(xué)科建設(shè)工程資助項目（PAPD）

師元元（1990—），女，河北保定人，碩士研究生，從事水污染控制研究。E-mail：2014103040@njau.edu.cn

陸雋鶴E-mail：jhlu@njau.edu.cn