江西煙區(qū)煙草黑脛病菌生理小種研究初報

張超群，周澤科，陳榮華，張根平，蔣軍喜

1 江西省煙葉科學(xué)研究所，南昌 330025；2 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南昌 330045；3 贛州市煙草科學(xué)研究所，贛州 341008；4 江西省瑞金市煙草分公司，瑞金 342500

江西煙區(qū)煙草黑脛病菌生理小種研究初報

張超群1，周澤科2，陳榮華3，張根平4，蔣軍喜2

1 江西省煙葉科學(xué)研究所，南昌 330025；2 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南昌 330045；3 贛州市煙草科學(xué)研究所，贛州 341008；4 江西省瑞金市煙草分公司，瑞金 342500

為進(jìn)一步明確江西煙區(qū)煙草黑脛病菌的生理小種及其分布，在江西省主要煙區(qū)采集煙草黑脛病病株樣品80個，從中分離純化出28個煙草黑脛病菌株。采用游動孢子懸浮液灌根接種鑒別寄主和TTZ培養(yǎng)基顏色反應(yīng)兩種方法鑒定其生理小種類型。結(jié)果表明，28個菌株對煙草品種L8具有較強的致病力，對N.nesophila無致病力，在TTZ培養(yǎng)基中皆呈現(xiàn)紅色反應(yīng)，表明其皆為1號生理小種。推測江西煙區(qū)煙草黑脛病為害病原菌主要為煙草黑脛病菌1號生理小種。

江西；煙草黑脛病菌；生理小種

煙草黑脛病是一種分布廣泛、為害嚴(yán)重的世界性煙草主要病害。1896年首次發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞的爪哇，此后迅速蔓延全世界[1]。20世紀(jì)60年代以來，美國、南非、印度、中國等主要產(chǎn)煙國對煙草黑脛病菌致病性及生理生化進(jìn)行了研究[2]。迄今為止，國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)0號、1號、2號、3號共4個煙草黑脛病生理小種[3-5]。朱賢朝等[6]在20世紀(jì)80年代對我國煙草黑脛病菌生理小種的研究發(fā)現(xiàn)，我國存在0號和1號生理小種及一個未鑒定出生理小種的致病型。種植抗病品種是防治此病最為有效的措施，在使用抗病品種時, 煙草黑脛病菌致病性發(fā)生變異的可能性是需要考慮的重要問題。在煙草種植歷史上,曾發(fā)生過因高毒力菌系或新小種出現(xiàn)而使一些抗病品種喪失對該病的抗性。如烤煙品種NC1071和白肋煙品系L8對煙草黑脛病菌0號小種是高度抗病的,但由于1號小種的出現(xiàn)而使該品種兒乎喪失使用價值[6]。

近年來，由于植煙品種結(jié)構(gòu)單一、栽培方式改變、長期施用單一藥劑防治等原因，造成煙草黑脛病菌生理小種種群結(jié)構(gòu)和種群數(shù)量的變化，使部分烤煙品種的抗病性發(fā)生改變、病原菌抗藥性增加[7-10]，煙草黑脛病發(fā)生日趨嚴(yán)重，對煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴(yán)重?fù)p失。江西省是我國的主要煙區(qū)之一，有關(guān)煙草黑脛病菌的生理分化雖有涉及，但未見系統(tǒng)研究報道。因此，研究江西煙區(qū)煙草黑脛病菌的生理小種及其分布，有助于為江西烤煙品種的合理布局和黑脛病的綜合防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

2011—2013年，于江西省主要產(chǎn)煙區(qū)采集具有典型癥狀的煙草黑脛病病株樣品80個，分離純化得到煙草黑脛病菌菌株28個。

1.2 病原菌分離

取典型的煙草黑脛病病株莖稈，用自來水洗凈后，于超凈工作臺內(nèi)用70%酒精擦拭莖桿后燒去殘留酒精，用消毒刀片從病健交接處切去莖桿表皮，切取5 mm × 5 mm大小的木質(zhì)部小塊組織6塊，轉(zhuǎn)移燕麥培養(yǎng)基上，將平板置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落長至合適大小后，從菌落邊緣挑取少量菌絲塊于燕麥培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，再從純化的菌落中挑取少量菌絲塊轉(zhuǎn)接于燕麥培養(yǎng)基斜面，30℃培養(yǎng)5 d后，加入已滅菌礦物油以保存菌種。礦物油的加入量為超過斜面1cm。

1.3 供試培養(yǎng)基

燕麥培養(yǎng)基[11]：燕麥片30 g，瓊脂18～20 g；燕麥片加入至1000 mL水中，加熱煮沸15～20 min，紗布過濾后加熔化好的瓊脂，水補足1000 mL，分裝滅菌 (121℃，20 min)。

TTZ固體培養(yǎng)基：高壓滅菌燕麥培養(yǎng)基冷卻至約45℃后，加入經(jīng)0.22 μm濾器除菌的0.05%(W/V)TTZ（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）。

TTZ液體培養(yǎng)基[12]：蔗糖30 g，檸檬酸20 g，CaCl21.0g，KNO32.0g，KH2PO40.67g，K2HPO40.33g，1% FeCl310滴，VB1 1 mg；加水補足至1 L，pH 5.5，121 ℃蒸汽滅菌30 min后，冷卻至約45℃后加入經(jīng)0.22 μm濾器除菌的0.05%(W/V) TTZ。

1.4 煙草黑脛病菌生理小種鑒定

1.4.1 TTZ培養(yǎng)基顏色反應(yīng)鑒定

根據(jù)煙草黑脛病菌在TTZ培養(yǎng)基中菌體顏色變化，對煙草黑脛病菌生理小種進(jìn)行鑒定。0號和1號生理小種在TTZ固體培養(yǎng)基和TTZ液體培養(yǎng)基中菌體由白色變?yōu)闇\紅色，而3號生理小種菌體顏色無變化。

(1) 在TTZ固體培養(yǎng)基上顏色變化

挑取各菌株菌落邊緣菌絲體接種到含TTZ固體培養(yǎng)基上，另接菌塊于不含TTZ的培養(yǎng)基上作為對照，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察菌體顏色變化。

(2) 在TTZ液體培養(yǎng)基上顏色變化

挑取各菌株菌落邊緣菌絲體接種到TTZ液體培養(yǎng)基中，另接菌塊于不含TTZ的普通培養(yǎng)液中作為對照。于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，72 h后觀察菌體顏色變化。

1.4.2 鑒別寄主鑒定

參照李振岐[13]鑒別寄主選擇標(biāo)準(zhǔn)和李斌[14]、劉廷利等[15]的方法，選擇NC1071、N. nesophila、L8和小黃金1025作為鑒別寄主，種子均為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。

采用傷根灌注法對鑒別寄主進(jìn)行接種。先用少量無菌水濕潤培養(yǎng)土，再用滅菌鑷子深插煙株周圍以達(dá)到傷根效果；用濃度為1×104cfu/mL的游動孢子懸浮液灌根接種6～8葉期煙株，每株灌注10 mL懸浮液，每處理3株，并設(shè)置3個重復(fù)，另設(shè)清水接種作為對照；將接種煙株置于28 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)光照培養(yǎng)，9 d后參照J(rèn)aarsveld[16]的煙草黑脛病病害分級標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計接種鑒別寄主的發(fā)病情況。各菌株在鑒別寄主上的反應(yīng)見表1。

表1 鑒別寄主對不同生理小種煙草黑脛病菌的反應(yīng)Tab.1 Reaction of differential hosts to different races of P.parasitica var. nicotianae

煙草黑脛病病害分級標(biāo)準(zhǔn)：

0級：全株無病。

1級：莖部病斑不超過莖圍的1/3，或1/3以下葉片凋萎。

3級：莖部病斑環(huán)繞莖圍的1/3至1/2，或1/3至1/2葉片輕度凋萎，或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑。

5級：莖部病斑超過莖圍的1/2，但未全部環(huán)繞莖圍，或1/2至2/3葉片凋萎。

7級：莖部病斑全部環(huán)繞莖圍，或2/3以上葉片凋萎。

9級：病株基本枯死。

2 結(jié)果與分析

28個菌株接種于TTZ固體培養(yǎng)基24 h后，菌絲體開始出現(xiàn)顏色變化，呈淡紅色；48 h后紅色范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，菌絲體顏色進(jìn)一步加深至紅色。28個菌株接種于TTZ液體培養(yǎng)基60 h后，菌絲體顏色呈淺紅色；72 h后菌絲體依舊為淺紅色，顏色未出現(xiàn)進(jìn)一步加深變化(見圖1)。根據(jù)顯色反應(yīng)可初步確定，28個供試菌株為生理小種0號或1號，而非生理小種3號。

圖1 部分煙草黑脛病菌株在TTZ培養(yǎng)基上顏色反應(yīng)Fig. 1 Color reaction of spme Phytophthora parasitica var. on TTZ medium nicotianae

表2可知：L8、小黃金1025的病情指數(shù)均在75以上，表現(xiàn)為感??；N. nesophila的病情指數(shù)均在25以下，表現(xiàn)為抗病。根據(jù)各鑒別寄主發(fā)病結(jié)果，28個供試菌株均屬生理小種1號，未發(fā)現(xiàn)0號生理小種存在。

表2 各供試菌株接種不同鑒別寄主發(fā)病病情指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果Tab. 2 Disease index statistic of differential hosts inoculated with the tested strains

3 小結(jié)與討論

28個菌株在TTZ固體和液體培養(yǎng)基上均能顯紅色，在TTZ固體培養(yǎng)基上顯示更快且顏色變化更明顯，初步確定了供試菌株為0號或1號生理小種。TTZ是標(biāo)準(zhǔn)氧化電位為80mV的氧化還原色素，當(dāng)其進(jìn)入菌體后，可作為氫受體被菌體內(nèi)脫氫輔酶上的氫還原，而由無色變?yōu)椴蝗苡谒姆€(wěn)定的紅色三苯甲腙。經(jīng)TTZ染色后，菌絲內(nèi)原生質(zhì)濃的部位變色通常較深，可能與該部位的脫氫酶含量高、活性強有關(guān)[17]。煙草黑脛病菌0號和1號生理小種的菌體內(nèi)含有能使TTZ還原的相關(guān)脫氫輔酶，而3號生理小種菌體內(nèi)則不具有此類脫氫酶，因而通過TTZ顯色反應(yīng)可將0號、1號小種跟3號小種區(qū)分開。

L8、NC1071、N.nesophila和小黃金1025因具有鑒別能力強、反應(yīng)靈敏和抗感分明等優(yōu)點而成為目前國內(nèi)外研究中采用相對較多的寄主組合之一。如朱賢朝[6]、李斌[14]、劉廷利[15]、李錫坤[18]等均采用該組合。本試驗結(jié)果表明該組合對0號、1號和3號生理小種菌株具有很強的鑒別能力，反應(yīng)明顯，抗感分明。

TTZ顯色反應(yīng)和鑒別寄主鑒定結(jié)果表明，江西煙區(qū)煙草黑脛病菌的優(yōu)勢種是1號生理小種，與苗圃[5]、王智發(fā)等[17]的鑒定結(jié)果基本一致，而與朱賢朝等[6]的鑒定結(jié)果有差異，這種差異是受接種方法影響、還是受環(huán)境條件影響或鑒別寄主基因型的影響所致，還有待進(jìn)一步研究。至于江西煙區(qū)是否還存在煙草黑脛病菌的其他生理小種類型，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大采樣范圍并進(jìn)行分析鑒定。同時，江西煙區(qū)在進(jìn)行品種布局時應(yīng)選擇對煙草黑脛病菌1號生理小種抗病的煙草品種為主，但仍不能忽視煙草品種對煙草黑脛病菌0號生理小種的抗性問題。

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Preliminary report of research onPhytophthora parasiticaphysiological races in tobacco growing areas in Jiangxi province

ZHANG Chaoqun1, ZHOU Zeke2, CHEN Ronghua3, ZHANG Genping4, JIANG Junxi2
1 Jiangxi Provincial Institute of Tobacco Leaf Science , Nanchang 330025, China;2 College of Agronomy, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China;3 Ganzhou Municipal Tobacco Research Institute, Ganzhou 341008, Jiangxi, China;4 Jiangxi Ruijin Municipal Tobacco Company, Ruijin 342500, Jiangxi, China

Physiological races of 28Phytophthoraparasiticavar.nicotianaestrains were isolated from 80 samples collected in tobacco growing areas of Xinfeng, Ruijin, Guangchang and other major areas of Jiangxi province, and were identi fi ed by zoospore suspension inoculation and TTZ color reaction. Results showed that all 28 strains were highly pathogenic to tobacco cultivar L8 but not to N．nesophilaand all of them presented red reaction on TTC medium, which indicated that all strains belong to physiological race 1.

Jiangxi;Phytophthoraparasiticavar.nicotianae; physiological race

張超群，周澤科，陳榮華，等. 江西煙區(qū)煙草黑脛病菌生理小種研究初報[J]. 中國煙草學(xué)報，2016,22（4）

國家煙草專賣局重點項目（110200902065）；江西省煙草專賣局科技項目“江西省煙草有害生物調(diào)查研究”（201001021）

張超群（1982—），農(nóng)藝師，碩士，主要從事煙草病蟲害防治研究, Email:chaoqunyc@163.com

蔣軍喜（1964—），博士，教授，主要從事植物病原鑒定及病害防治研究, Email：jxau@126.com

2014-10-20

:ZHANG Chaoqun, ZHOU Zeke, CHEN Ronghua, et al. Preliminary report of research onPhytophthoraparasiticaphysiological races in tobacco growing areas in Jiangxi province [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(4)