基于關(guān)聯(lián)分析發(fā)掘煙草高鉀優(yōu)異等位變異

樊文強(qiáng)，孫鑫，楊愛國，程立銳，張忠鋒，任民

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,青島 266101；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院,北京 100081

基于關(guān)聯(lián)分析發(fā)掘煙草高鉀優(yōu)異等位變異

樊文強(qiáng)1，2，孫鑫1，2，楊愛國1，程立銳1，張忠鋒1，任民1

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,青島 266101；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院,北京 100081

采用全基因組454個SSR位點(diǎn)對96份烤煙種質(zhì)資源進(jìn)行了群體分型,獲得有效等位變異1038個。NJ聚類分析將供試材料分為3個類群,群體結(jié)構(gòu)分析表明,當(dāng)K=3時(shí),ΔK值最大。同時(shí)對該供試材料在4個環(huán)境進(jìn)行了煙葉鉀含量測定,其頻率符合正態(tài)分布。采用混合線性模型（MLM）,進(jìn)行了標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)分析,獲得11個煙草鉀含量的關(guān)聯(lián)標(biāo)記。通過不同基因型的鉀含量對比,獲得5個高鉀優(yōu)異等位變異。為驗(yàn)證這些優(yōu)異等位變異,本研究又利用這5個關(guān)聯(lián)標(biāo)記掃描了其他130份煙草種質(zhì),獲得了一致的結(jié)果。表明可以利用這5個高鉀等位變異對煙草種質(zhì)資源進(jìn)行定性篩選,促進(jìn)煙草高鉀種質(zhì)的利用和品種選育。

煙草；高鉀；關(guān)聯(lián)分析；SSR標(biāo)記；優(yōu)異等位變異

鉀是植物中重要的礦物質(zhì)元素,參與了眾多生理活動,例如酶的活化、氣孔開閉、膜電勢的維持以及滲透調(diào)節(jié)等,并且占了植物干重的10 %[1-2]。目前已從擬南芥等物種中克隆到一系列與鉀積累、代謝有關(guān)的基因[3-4],可以分為2大類,即鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體和鉀離子通道[5]。通常情況下,鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白承擔(dān)了植物對鉀的高親和吸收轉(zhuǎn)運(yùn),而鉀離子通道蛋白則承擔(dān)植物對鉀的低親和吸收轉(zhuǎn)運(yùn)[6]。煙草是典型的喜鉀作物,鉀也是煙草吸收最多的一種礦質(zhì)元素,并對提高煙葉的燃燒性,改善煙葉品質(zhì),減少焦油產(chǎn)生均有重要作用[7-8],因此,常用煙葉中的鉀含量作為煙葉質(zhì)量評價(jià)的重要標(biāo)準(zhǔn)[9]。已有研究證實(shí),植物鉀營養(yǎng)效率具有可遺傳性,其遺傳模式既有單基因控制,又有多基因控制[10-12]。在煙草中的研究也發(fā)現(xiàn),不同煙草品種對鉀的吸收利用效率存在顯著的遺傳差異[13-14]。因此篩選鉀營養(yǎng)高效種質(zhì),培育高鉀品種是提高煙葉鉀含量的一條有效途徑。我國有著非常豐富的煙草種質(zhì)資源,截止到2011年,國家煙草種質(zhì)資源庫中己編目的種質(zhì)數(shù)量多達(dá)5,267份,其中烤煙為2,203份[15]。但是直接對庫存種質(zhì)進(jìn)行煙葉鉀含量的測定存在著成本高、周期長、工作量大的困難,在現(xiàn)有條件下無法實(shí)現(xiàn)。近年來分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,為利用相應(yīng)的標(biāo)記在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開展種質(zhì)資源的分子篩選提供了可能。當(dāng)前已經(jīng)在煙草上開展了大量的分子遺傳研究,分析了煙草種質(zhì)群體的遺傳多樣性,構(gòu)建了高密度的遺傳連鎖圖譜,對多種重要性狀開展了遺傳定位和QTL研究[16-20]。但利用分子標(biāo)記開展煙草高鉀含量種質(zhì)資源篩選的研究還未見報(bào)道。為此本研究利用近年來在植物數(shù)量遺傳研究中發(fā)展較為迅速的關(guān)聯(lián)分析技術(shù),在一個烤煙自然群體上開展了煙葉鉀含量的標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)分析研究,篩選了關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的優(yōu)異等位變異,探索并建立了一個能用于煙草高鉀種質(zhì)篩選的分子標(biāo)記篩選技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試群體構(gòu)建

以煙草核心種質(zhì)為基礎(chǔ),從國家煙草種質(zhì)資源庫中挑選了96份烤煙品種（簡稱群體Ⅰ,表1）用于煙草鉀含量表型變異的關(guān)聯(lián)分析及其分子評價(jià)模型構(gòu)建。于2012～2013年分別種植在西昌市大興鄉(xiāng)和諸城市相州鎮(zhèn)。田間栽培及各項(xiàng)管理措施均一致,于煙葉成熟期采收中部葉片,制備調(diào)制后煙葉樣品。為驗(yàn)證本研究發(fā)掘的高鉀優(yōu)異等位,又篩選了130份烤煙種質(zhì)（簡稱群體Ⅱ）,其中引進(jìn)種質(zhì)、育成種質(zhì)和地方種質(zhì)分別為51份、28份和51份。于2014年種植于諸城市相州鎮(zhèn),其田間栽培、各項(xiàng)管理措施及煙葉樣品制樣方法均與群體Ⅰ一致。

表1 96份材料群體Tab.1 Population including 96 materials

1.2 供試群體煙葉樣品的鉀含量測定

烤后煙葉樣品均送至農(nóng)業(yè)部煙草產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心進(jìn)行鉀含量測定。檢測方法參照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《YC/T 217-2007》。檢測的儀器為SAN++連續(xù)流動分析儀（荷蘭SKALAR公司）和410型火焰光度計(jì)（英國Sherwood公司）。

1.3 供試SSR標(biāo)記

本研究采用多態(tài)性SSR 位點(diǎn)共454個,均勻分布于煙草全基因組24個連鎖群。引物序列來自煙草高密度SSR遺傳連鎖圖譜[16]。

1.4 DNA提取

采用 TIANGENE? Plant Genomic DNA Kit（天根生化科技（北京）有限公司）進(jìn)行供試材料全基因組DNA的提取。

1.5 PCR擴(kuò)增及電泳檢測

PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳參照任民[19]的方法。PCR儀為Thermal Cycler Model 9902（美國Applied Biosystems ABI公司）,電泳儀電泳電源為DYY-12型（北京六一儀器廠）。用稍加改進(jìn)的 NaOH 銀染方法[21]對電泳后的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行染色顯影。

1.6 數(shù)據(jù)分析

供試群體的鉀含量表型變異數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行整理,并計(jì)算平均值、變異系數(shù)等。表型變異的顯著性檢驗(yàn)采用SPSS 18.0的one-way ANOVA[22]進(jìn)行。供試群體的遺傳多樣性分析采用PowerMarker V3.25[23]軟件,并計(jì)算個體間的Nei[24]遺傳距離,最后使用MEGA5.2中鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建聚類圖。進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析時(shí),首先采用STRUCTURE 2.3.4軟件分析供試材料的群體結(jié)構(gòu)[25],其中Length of burn-in period 和 Number of MCMC Peps after Burnin 均設(shè)為 100,000 次,K設(shè)置為1-7,通過計(jì)算 ΔK值確定亞群數(shù)[26],獲得Q矩陣；接下來利用SPAGeDi-1.3d[27]軟件計(jì)算供試群體的家系關(guān)系Kinship矩陣；最后將Q矩陣、Kinship矩陣、SSR群體分型信息以及供試群體的鉀含量表型變異數(shù)據(jù)代入TASSEL 2.1[28]軟件中的混合線性模型 (mixed linear model,MLM, Q+K 模型),選擇P3D計(jì)算方式和EMMA分析方法進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試群體鉀含量表型變異統(tǒng)計(jì)分析

對供試群體Ⅰ各年點(diǎn)煙葉鉀含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)群體Ⅰ鉀含量的頻率分布符合正態(tài)分布（圖1）,Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)中Z值為0.85,P值為0.46。在相同的年份中,西昌煙葉樣品的鉀含量平均值均大于諸城煙葉樣品的鉀含量平均值,但是西昌煙葉的鉀含量變異系數(shù)小于諸城相應(yīng)樣品的變異系數(shù)（表2）。對供試群體Ⅱ的煙葉樣品鉀含量統(tǒng)計(jì)分析表明,其頻率分布同樣符合正態(tài)分布,Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)的Z值為0.72,P值為0.68,平均值為1.68 %,變幅為0.89 %-2.95 %,變異系數(shù)28.2 %。

圖1 96份烤煙各年點(diǎn)鉀含量正態(tài)分布圖Fig.1 Normal distribution map of potassium content of 96 materials in different years at different sites

表2 96份烤煙各年點(diǎn)的鉀含量的統(tǒng)計(jì)分析Tab.2 Statistics of potassium content of 96 materials in different years at different sites

2.2 供試群體I的遺傳多樣性及其群體結(jié)構(gòu)分析

利用分布于煙草高密度遺傳圖譜[16]24條連鎖群中的454個多態(tài)性SSR標(biāo)記對供試群體進(jìn)行了標(biāo)記分型。隨后對各位點(diǎn)的等位變異頻率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì),過濾5 %的稀有等位變異后,有多態(tài)性的位點(diǎn)為417個。從上述417個位點(diǎn)中共檢測到1038個等位變異,平均每個位點(diǎn)為2.5個,變幅為2～6個；標(biāo)記的平均PIC為0.299,變幅為0.044～0.698。NJ聚類分析表明,群體可被劃分為3個亞群（圖2）,隨后又對供試群體Ⅰ進(jìn)行了群體結(jié)構(gòu)分析,從圖3中可看出,當(dāng)K=3時(shí),ΔK的值最大,說明該群體存在3種遺傳背景。

圖2 96份材料NJ聚類圖Fig.2 NJ dendrogram of 96 materials

圖3 ΔK的變化趨勢Fig.3 Tendency of ΔK

2.3 群體I的鉀含量標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)分析

利用417個具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記及群體Ⅰ4個環(huán)境的鉀含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,共發(fā)掘到顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記11個（-log(P-value )＞ 2.5,圖4）。其中標(biāo)記PT61367的-log(P-value)最高,為4.455,位于9號連鎖群,其余標(biāo)記分布在1、3、4、9、13、14、17、20、23、24號連鎖群上。

圖4 417個標(biāo)記的Manhanttan圖Fig.4 Manhanttan plot of 417 markers

2.4 高鉀含量優(yōu)異等位變異的篩選

對關(guān)聯(lián)到的11個位點(diǎn)進(jìn)行了各等位位點(diǎn)間表型差異的顯著性檢驗(yàn)和年點(diǎn)分布規(guī)律的統(tǒng)計(jì),最終篩選到5個標(biāo)記PT61367、PT51364、PT30132、PT55319、PT53362（表3）。這5個位點(diǎn)等位基因間的鉀含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且在4個環(huán)境間規(guī)律一致。標(biāo)記PT30312的等位變異數(shù)量最多,為5個,但只有1個等位變異可以作為高鉀優(yōu)異等位變異；標(biāo)記PT55319有3個等位變異,其中有2個等位變異均可作為優(yōu)異等位變異；其余3個標(biāo)記的等位變異數(shù)量均為2,其中1個為優(yōu)異等位變異。

表3 構(gòu)建模型的入選標(biāo)記Tab.3 Selected markers used to construct the model

2.5 高鉀等位變異與群體鉀含量的關(guān)系

對表3中5個位點(diǎn)的優(yōu)異等位數(shù)量在群體Ⅰ中的分布進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)（表4）,可將供試群體Ⅰ分成6組。隨后對6組材料進(jìn)行了進(jìn)一步的合并和統(tǒng)計(jì)分析。將具有0到1個優(yōu)異等位變異的材料劃分為一組,簡稱組A；將具有2到3個優(yōu)異等位變異的材料劃分為第二組,簡稱組B；將具有4到5優(yōu)異等位變異的材料劃分為第三組,簡稱組C。利用上述分組方法對群體Ⅰ四個環(huán)境的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),由圖5A可知,各小組鉀含量的高低順序?yàn)榻MC＞組B＞組A。組C鉀含量分別比組B、組A提高了16.7 %和31.5 %,同時(shí)各組之間鉀含量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并且在各環(huán)境中煙葉樣品鉀含量的規(guī)律依然是組C＞組B＞組A(圖5B)。上述研究表明,隨著供試材料中優(yōu)異等位變異位點(diǎn)數(shù)量的增加,供試材料煙葉鉀含量的平均值也呈增加趨勢。由此,可以利用上述規(guī)律進(jìn)行煙草高鉀種質(zhì)資源的分子篩選。

表4 96份烤煙品種的優(yōu)異等位數(shù)量Tab.4 Number of favorable alleles in 96 materials

圖5 群體I中各小組的鉀含量直方圖Fig.5 Histogram of potassium content of each group in populationⅠ

2.6 高鉀等位變異的煙草種質(zhì)篩選驗(yàn)證

應(yīng)用群體Ⅱ?qū)ι鲜鲡浐糠肿雍Y選技術(shù)進(jìn)行適用性驗(yàn)證。同樣方法將群體Ⅱ分成相應(yīng)的3組(圖6),組A到組C供試品種的平均鉀含量依次增加,分別為1.55 %、1.72 %和1.96 %,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組C鉀含量的平均水平比組B提高了13.7 %,比組A提高了26.1%,組B又比組A提高了10.9 %。由此可知,結(jié)果與分析2.5中所描述的優(yōu)異等位變異數(shù)量與群體鉀含量水平的關(guān)系在1個新的種質(zhì)群體中依然成立,初步證明了利用結(jié)果與分析2.4中的5個高鉀等位變異進(jìn)行煙草高鉀種質(zhì)群體篩選的可行性。

圖 6 群體Ⅱ中各小組的鉀含量直方圖Fig.6 Histogram of potassium content of each group in population Ⅱ

3 討論

3.1 分子標(biāo)記技術(shù)在種質(zhì)資源篩選中的應(yīng)用

與形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和生化標(biāo)記相比,分子標(biāo)記可以直接揭示基因組上DNA的多態(tài)性,準(zhǔn)確度高,穩(wěn)定性好。同時(shí),分子標(biāo)記輔助選擇還具有省時(shí)省力的特點(diǎn),在動植物遺傳育種研究中具有良好的應(yīng)用前景[29-37]。本研究利用分子標(biāo)記開展高鉀煙草種質(zhì)資源篩選的技術(shù)和策略,發(fā)掘了5個高鉀優(yōu)異等位變異：標(biāo)記PT61367的101等位變異、標(biāo)記PT51364的102等位變異、標(biāo)記PT30132的103等位變異、標(biāo)記PT55319的101&103等位變異和標(biāo)記PT53362的101等位變異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)供試群體煙葉鉀含量有隨優(yōu)異等位變異數(shù)量增多而增加的趨勢,并用其他的130份烤煙種質(zhì)對上述趨勢的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明該方法有良好的穩(wěn)定性,可以用于煙草高鉀種質(zhì)的分子篩選。

3.2 煙草高鉀種質(zhì)資源的分子標(biāo)記輔助篩選方法

本研究發(fā)掘到的上述5個煙草高鉀優(yōu)異等位變異,在種質(zhì)資源發(fā)掘時(shí),可以首先利用這5個標(biāo)記定性的進(jìn)行分子篩選,然后再通過田間實(shí)際檢測,定量每個種質(zhì)的鉀含量水平,從而實(shí)現(xiàn)提高種質(zhì)資源的發(fā)掘效率,節(jié)約科研成本的目的。具體實(shí)施方法如下,首先確定對照品種,通過本研究發(fā)現(xiàn),可以用烤煙品種V2和云煙2號做陽性對照,翠碧一號和革新三號做陰性對照；其次提取烤煙種質(zhì)資源群體的全基因組DNA,并利用PT61367、PT51364、PT30132、PT55319、PT53362等5個標(biāo)記對供試材料的DNA進(jìn)行分型；最后,依據(jù)對照統(tǒng)計(jì)每個供試材料優(yōu)異等位變異的數(shù)量,僅從中挑選具有4～5個優(yōu)異等位變異的煙草種質(zhì),即為高鉀煙草種質(zhì)群體。

3.3 問題與展望

煙草鉀含量屬于典型的數(shù)量性狀,表型變異由多個基因控制[38]。張海萍[34]認(rèn)為在分子標(biāo)記輔助育種中,多個標(biāo)記的聯(lián)合使用可以提高性狀選擇的準(zhǔn)確性。依靠本研究所用的5個SSR標(biāo)記,在群體水平上可以獲得較好的選擇效果。但是由于目前所獲得的還僅是目標(biāo)性狀的關(guān)聯(lián)標(biāo)記,而非調(diào)控基因位點(diǎn),以及標(biāo)記與基因之間還存在一定的遺傳距離等原因,尚不能精確的應(yīng)用于個體的鑒定。為此,在下一步的研究中還需在關(guān)聯(lián)位點(diǎn)附近深入發(fā)掘調(diào)控?zé)煵葩浐窟z傳變異的基因位點(diǎn),開發(fā)功能標(biāo)記,進(jìn)一步提升標(biāo)記的選擇效率。另外,在更精細(xì)的水平上,還要考慮不同生態(tài)環(huán)境與基因之間的互作關(guān)系。必要時(shí),可隨目標(biāo)栽培環(huán)境不同,調(diào)整用于篩選的分子標(biāo)記,以實(shí)現(xiàn)更優(yōu)的鑒定效果。

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Exploring high-potassium favorable allele mutation of tobacco based on genome-wide association analysis

FAN Wenqiang1,2, SUN Xin1,2, YANG Aiguo1, CHENG Lirui1, ZHANG Zhongfeng1, REN Min1
1 Key Laboratory of Tobacco Genetic Improvement and Biotechnology, Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China;2 Postgraduate School, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

1038 e ff ective alleles were obtained by screening 96 tobacco germplasm based on 454 polymorphic SSR loci. Neighbor-Joining cluster analysis showed that there existed 3 groups in 96 lines, of which ΔK was highest when K was equal to 3. Potassium content of the 96 lines was simultaneously tested in 4 cultivated environments and its frequency was in line with normal distribution. 11 SSR markers associated with potassium content in tobacco leaves were gained through genome-wide association analysis based on mixed liner model. 5 high-potassium alleles were developed by comparing potassium content in di ff erent alleles. Another 130 tobacco lines were screened with the 5 associated SSR markers to have further vindicated the feasibility of using the 5 SSR markers to screen high-potassium germplasm and thus to improve the quality of tobacco breeding and selection.

tobacco; high-potassium; association analysis; SSR marker; favorable allele mutation

樊文強(qiáng),孫鑫,楊愛國,等. 基于關(guān)聯(lián)分析發(fā)掘煙草高鉀優(yōu)異等位變異[J]. 中國煙草學(xué)報(bào),2016,22（2）

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201203091）；煙草重要性狀基因發(fā)掘及功能標(biāo)記開發(fā) (110201301008)

樊文強(qiáng)（1990—）,在讀碩士研究生,方向?yàn)闊煵葩浳辙D(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的定位與發(fā)掘,Email：fanwenqiang2015QD@163.com

任民（1979—）,博士,副研究員,研究方向?yàn)闊煵莘肿佑N,Tel: 0532-88702169,Email：renmin@caas.cn

2015-07-25

：FAN Wenqiang, SUN Xin, YANG Aiguo, et al. Exploring high-potassium favorable allele mutation of tobacco based on genome-wide association analysis[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016, 22(2)