基于逐步回歸分析何首烏中核苷類成分

羅益遠(yuǎn)，劉娟秀，劉訓(xùn)紅,*，蘭才武，徐 力，侯 婭，馬 陽

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.貴州昌昊中藥發(fā)展有限公司研發(fā)部，貴州 凱里 556000；3.揚(yáng)州市藥品檢驗(yàn)所化學(xué)室，江蘇 揚(yáng)州 225000）

基于逐步回歸分析何首烏中核苷類成分

羅益遠(yuǎn)1，劉娟秀1，劉訓(xùn)紅1,*，蘭才武2，徐 力3，侯 婭1，馬 陽1

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.貴州昌昊中藥發(fā)展有限公司研發(fā)部，貴州 凱里 556000；3.揚(yáng)州市藥品檢驗(yàn)所化學(xué)室，江蘇 揚(yáng)州 225000）

分析何首烏中10 種核苷類成分，探討10 種核苷類成分含量對總核苷含量的影響程度。采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿-線性離子阱質(zhì)譜技術(shù)測定何首烏中10 種核苷類成分的含量，應(yīng)用逐步回歸分析方法得到10 種核苷類成分含量對總核苷含量影響程度的最優(yōu)方程。結(jié)果顯示何首烏核苷類成分中以尿苷、腺嘌呤、鳥苷、胞苷含量較高；逐步回歸分析顯示尿苷、胞苷和胸苷含量對總核苷含量的影響最為顯著。尿苷、胞苷和胸苷含量可標(biāo)示總核苷作為何首烏藥材質(zhì)量評價(jià)的一項(xiàng)指標(biāo)，為何首烏藥材質(zhì)量的多指標(biāo)評價(jià)體系構(gòu)建提供科學(xué)依據(jù)。

何首烏；超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿-線性離子阱質(zhì)譜；逐步回歸分析；核苷；堿基

何首烏為蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥塊根，享有我國傳統(tǒng)重要的“四大仙草”之一的美譽(yù)。性苦、甘、澀，微溫。具有解毒、截瘧、消癰、潤腸通便的功效，主要用于瘰疬、瘡癰、久瘧體虛、腸燥便秘[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明：何首烏具有抗衰老、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、保肝、止痛抗菌等作用[2]。對何首烏的功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究主要集中于二苯乙烯苷類[3-4,7]、蒽醌類[5-7]、黃酮類[7-9]、磷脂類[10-11]、無機(jī)元素[12-13]等。大量研究證實(shí)，核苷類成分是生物細(xì)胞維持生命活動(dòng)的基本組成元素，具有廣泛的生理活性，如抗腫瘤、抗病毒、基因治病、免疫調(diào)節(jié)、改善腦細(xì)胞代謝等多種生物活性[14-17]，在食品、化妝、醫(yī)藥方面有著巨大應(yīng)用潛力[18-22]；還有學(xué)者認(rèn)為核苷可能是補(bǔ)益中藥的共同物質(zhì)基礎(chǔ)[23]。因此核苷可作為何首烏的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，以此作為藥材質(zhì)量評價(jià)的一項(xiàng)指標(biāo)具有一定科學(xué)性。

逐步回歸法是在前進(jìn)法和后退法基礎(chǔ)上，進(jìn)行雙向篩選的一種方法。每引入一個(gè)變量，都要對回歸方程中每一個(gè)自變量的作用做顯著性檢驗(yàn)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)自變量的作用無顯著性意義時(shí)，即行剔除，盡可能將回歸效果顯著地自變量選入回歸方程[24-25]。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿-線性離子阱質(zhì)譜技術(shù)同時(shí)測定何首烏藥材中10 種核苷類成分的含量，結(jié)合逐步回歸分析法分析10 種核苷類成分對總核苷含量的影響，以探討標(biāo)示總核苷作為何首烏藥材質(zhì)量評價(jià)的優(yōu)化指標(biāo)，從而為何首烏藥材質(zhì)量的多指標(biāo)評價(jià)體系構(gòu)建提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

何首烏藥材均為實(shí)地采集或購自當(dāng)?shù)厮幉墓?，藥材編號及來源如下：S1-四川產(chǎn)（益大藥店提供，批號：110722），S2-江蘇句容產(chǎn)（南京中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本館提供），S3-廣東高州產(chǎn)（北京同仁堂南京店提供，批號：130513287），S4-貴州凱里產(chǎn)（南京宣德堂中醫(yī)門診藥房提供），S5-浙江臨安產(chǎn)、S6-安徽亳州產(chǎn)、S7-重慶豐都產(chǎn)、S8-四川阿壩產(chǎn)（益豐大藥房提供，批號：131103），S9-湖北英山產(chǎn)。所有樣品均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉訓(xùn)紅教授鑒定為何首烏Polygonum multifl orum Thunb.的塊根。留樣憑證保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室。

對照品尿嘧啶（批號：100469-200401）、鳥嘌呤（批號：140631-200904）、尿苷（批號：887-200202）、腺嘌呤（批號：110886-200001）、肌苷（批號：40669-201104）、腺苷（批號：110879-200202）（純度均＞98%） 中國食品藥品檢定研究院；胞苷（批號：100982718）、鳥苷（批號：1001103046）、胸苷（批號：1001182663）（純度均＞98%） 美國Sigma公司；2’-脫氧胞苷（批號：YSJ-04024）（純度＞98%） 上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；水為超純水由Millipore純水器制備；甲醇（色譜純） 德國默克公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC-20ADXR系列高效液相色譜（配有溶劑脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器） 日本Shimadzu公司；API 4000四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀（配有離子噴霧接口） 美國AB SCIEX公司；KQ-500B超聲波清洗機(jī)（超聲功率500 W、40 kHz） 昆山超聲儀器有限公司；BSA2245型電子分析天平（十萬分之一）、ME36S型電子分析天平（百萬分之一） 德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3C18（2.1 mm×150 mm，3 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A相）-5 mmol/L醋酸銨（含0.1%冰醋酸B相）；梯度洗脫：0～4.5 min，3%～4% A；4.5～8 min，4%～18% A；8～10 min，18% A；10～10.1 min，18%～3% A；10.1～13 min，3% A。柱溫35 ℃，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離；電離模式：正離子化；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測；離子化溫度：650 ℃。噴霧電壓：5 500 V；霧化氣流速：65 L/min；輔助氣流速：65 L/min；氣簾氣流速：30 L/min。10 種核苷的質(zhì)譜具體參數(shù)見表1。

表1 優(yōu)化的質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 Optimized MS/MS parameters for the determination of 10nucleosides and nucleobases

1.3.3 對照品溶液制備

精密稱取一定量的尿嘧啶、鳥嘌呤、胞苷、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、胸苷、腺苷、2’-脫氧胞苷對照品，分別加水配制成一定質(zhì)量濃度的對照品儲(chǔ)備液。取各對照品儲(chǔ)備液適量，置10 mL量瓶中，加水定容，配制成尿嘧啶、鳥嘌呤、胞苷、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、胸苷、腺苷、2’-脫氧胞苷質(zhì)量濃度分別為10.76、10.30、7.51、10.48、9.64、10.37、9.72、8.74、10.94、9.11 μg/mL的混合對品照標(biāo)溶液。

1.3.4 供試品溶液制備

取一定量的樣品粉碎，過80 目篩。精密稱定干燥質(zhì)量恒定的樣品粉末1.0 g，置于25 mL具塞錐形瓶中，加入10 mL超純水，稱量，室溫條件下超聲提取60 min后取出，放冷以超純水補(bǔ)足質(zhì)量損失，提取液13 000 r/min離心10 min，取出上清液并保存于4 ℃，使用時(shí)用0.22 μm的微孔濾膜濾過，即得。

1.3.5 樣品含量測定

取各何首烏供試品溶液按照上述條件測定，根據(jù)相應(yīng)線性關(guān)系計(jì)算供試樣品中10 種核苷的含量。

1.3.6 樣品數(shù)據(jù)的建立

何首烏藥材中總核苷類及10 種核苷類成分（尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、胸苷、腺苷、2’-脫氧胞苷）的含量。設(shè)總核苷含量（10 種核苷類成分含量的總和）為因變量Y，核苷類成分（尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、胸苷、腺苷、2’-脫氧胞苷）的含量為自變量（分別為X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10）組成樣品數(shù)據(jù)集。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

Waters Atlantis T3C18色譜柱，其采用三官能團(tuán)C18烷基鍵合相，保證鍵合密度能提升極性化合物的保留并且100%水相流動(dòng)相兼容，對強(qiáng)極性物質(zhì)有很好地保留，本實(shí)驗(yàn)選擇T3色譜柱進(jìn)行分離。另外，實(shí)驗(yàn)中對流動(dòng)相（甲醇-水、乙腈-水、甲醇-（含0.1%甲酸）醋酸胺、乙腈-（含0.1%甲酸）醋酸胺）、流速、柱溫等進(jìn)行考察，最終確定了最佳的色譜條件見1.3.1節(jié)。考慮到同時(shí)檢測多種核苷及堿基，因此選擇正離子模式作為質(zhì)譜的離子化模式。在優(yōu)化的色譜條件下，各化合物的分離度均大于1.5。

2.2 供試品制備方法的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中對提取溶劑（水、30%及50%甲醇溶液）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、提取方法（回流、超聲處理）及提取時(shí)間（15、30、45、60 min）進(jìn)行了單變量的考察。結(jié)果表明，水作為最適合的溶劑可以提取出更多待測物；超聲提取效果比回流提取好，且方便易行；因此以水作溶劑，超聲提取。料液比和提取時(shí)間優(yōu)化后分別為料液比1∶10、60 min。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限和定量限

精密吸取1.3.3節(jié)混合對照品溶液0.05、0.1、0.5、2.0、5.0、10.0 mL，置10 mL量瓶中，定容搖勻。精密吸取5 μL，按1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，以對照品的峰面積（y）對相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍；以各化合物的信噪比等于3時(shí)相對應(yīng)的質(zhì)量濃度確定為最低檢測限，以各化合的信噪比等于10時(shí)相對應(yīng)的質(zhì)量濃度確定為最低定量限，結(jié)果見表2。

表2 10種核苷標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限和定量限Table 2 Calibration curves, limits of detection (LODs) and limits ofquantification (LOQs) of 10 nucleosides and nucleobases

2.3.2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Precision, repeatability, stability and recoveries of thedeveloped method

由表3可見，精密吸取同一混合對照品溶液分別重復(fù)進(jìn)樣5 次，分別計(jì)算10 種核苷類成分的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，均符合精密度實(shí)驗(yàn)要求，說明儀器精密度良好；取同一樣品，按照樣品制備方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，重復(fù)測定5 次，計(jì)算各核苷類成分的含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，均符合實(shí)驗(yàn)規(guī)定，表明該方法重復(fù)性良好；取同一樣品制備供試品溶液，分別在1、3、6、12、24 h測定10 種核苷類成分的含量并計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

取已知含量的樣品（6 份），精密稱定，置錐形瓶中，分別精密加入一定量的尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、2’-脫氧胞苷、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、胸苷、腺苷的對照品溶液，根據(jù)1.3.4節(jié)方法制備加樣回收率供試溶液，根據(jù)樣品測定方法進(jìn)樣，計(jì)算各核苷類成分的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示該方法的準(zhǔn)確度良好，可以滿足日常樣品的分析要求（表3）。

2.4 樣品含量結(jié)果

取各何首烏供試樣品中10種核苷的含量，測定結(jié)果見表4。10種核苷類成分提取離子色譜圖見圖1。

表4 何首烏中核苷類成分含量（n=2）Table 4 Contents of nucleosides in samples of Polygoni multiflori Raddiixx (n=2))

圖1 10種核苷對照品（A）、樣品（B）的提取離子流圖Fig.1 Extracted ion chromatograms (EIC) of standard mixture (A) and sample (B)

2.5 10 種核苷類成分含量對總核苷含量的影響程度分析

由于何首烏藥材中總核苷的含量是由7 種核苷和3 種堿基成分含量組成。因此采用逐步回歸分析方法，分析何首烏藥材中10 種核苷類成分對總核苷含量的影響程度并得到最優(yōu)的回歸方程。

2.5.1 逐步回歸分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對表4中數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸分析，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示：在引入和剔除的標(biāo)準(zhǔn)分別為0.05和0.10時(shí)采用逐步回歸法，在全部10 個(gè)自變量中，僅X4、X2、X8對Y有重要的影響進(jìn)入方程，其余7 個(gè)自變量對Y影響均不顯著被剔除，即何首烏藥材中尿苷、胞苷及胸苷的含量對總核苷含量的影響顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其次，負(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.999，決定系數(shù)R2=0.998，說明在逐步擬合的線性回歸方程的因變量（總核苷的含量）能被自變量解釋的占99.8%，其他因素及偶然因素的原因僅占0.2%。由表6可知，經(jīng)過逐步分析得到最優(yōu)回歸方程為Y=1.404X4+0.825X2-6.045X8+44.791。

表5 模式概述Table 5 Model summary

表6 回歸分析中的系數(shù)Table 6 Coefficients of regression equation

2.5.2 回歸方程的顯著性檢驗(yàn)

逐步回歸分析中的F檢驗(yàn)是檢驗(yàn)總體回歸方程中假定的因變量Y與自變量X1、X2……Xm的線性關(guān)系是否顯著，是否可以用線模型來描述因變量和自變量之間的關(guān)系，由表7可知，F(xiàn)=706.057，P=0.000＜0.05。說明在顯著水平為0.05的情況下回歸方程通過F檢驗(yàn)，說明線性回歸效果顯著，逐步回歸方程具有統(tǒng)計(jì)意義。

表7 方差分析Table 7 Analysis of variance (ANOVA) of regression equation

3 結(jié) 論

何首烏樣品含量分析比較顯示：何首烏藥材核苷類成分中，以尿苷、腺嘌呤、鳥苷、胞苷的含量相對較高，尿嘧啶、肌苷、胸苷、腺苷、鳥嘌呤、2’-脫氧胞苷的含量相對較低；不同產(chǎn)地或商品藥材中10 種核苷類成分含量及其總量具有一定差異。逐步回歸分析結(jié)果顯示，尿苷、胞苷及胸苷的含量對總核苷的含量影響顯著，因此，尿苷、胞苷和胸苷可標(biāo)示總核苷作為何首烏藥材質(zhì)量評價(jià)的一項(xiàng)指標(biāo)，從而為何首烏藥材質(zhì)量的多指標(biāo)評價(jià)體系構(gòu)建提供科學(xué)依據(jù)。

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Analysis of Nucleosides and Nucleobases of Polygonum multifl orum by Stepwise Regression Analysis

LUO Yiyuan1, LIU Juanxiu1, LIU Xunhong1,*, LAN Caiwu2, XU Li3, HOU Ya1, MA Yang1
(1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China; 2. Research and Development Department, Guizhou Chang Hao Chinese Medicine Co. Ltd., Kaili 556000, China; 3. Department of Chemistry, Yangzhou Institute for Drug Control, Yangzhou 225000, China)

This study analyzed 10 nucleosides and nucleobases in Polygonum multifl orum Radix and explored their effects on the total content of nucleosides. Ten nucleoside and nucleobases in Polygonum multifl orum Radix were simultaneously determined by ultra-performance liquid chromatography-tandem triple-quadrupole linear ion trap mass spectrometry (QTRAP UPLC-MS/MS). The optimal equation describing total nucleoside content as a function of 10 nucleoside and nucleobases was established by stepwise regression analysis. The results showed that the contents of uridine, adenine, guanosine and cytidine were higher in Polygoni multifl ori Radix. Stepwise regression analysis showed that uridine, cytidine and thymidine had the most significant effects on the total content of nucleoside. The contents of uridine, cytidine and thymidine can be used as an indicator the quality of for Polygonum multifl orum Radix based on total nucleoside, and provide a scientific basis for constructing multiindicator quality evaluation system for Polygonum multifl orum Radix.

Polygoni multifl ori Radix; ultra-performance liquid chromatography-tandem triple-quadrupole linear ion trap mass spectrometry (QTRAP UPLC-MS/MS); stepwise regression analysis; nucleosides; nucleobases

10.7506/spkx1002-6630-201602018

S896.4

A

1002-6630（2016）02-0104-05

羅益遠(yuǎn), 劉娟秀, 劉訓(xùn)紅, 等. 基于逐步回歸分析何首烏中核苷類成分[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 104-108. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201602018. http://www.spkx.net.cn

LUO Yiyuan, LIU Juanxiu, LIU Xunhong, et al. Analysis of nucleosides and nucleobases of Polygonum multiflorum by stepwise regression analysis[J]. Food Science, 2016, 37(2): 104-108. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201602018. http://www.spkx.net.cn

2015-03-14

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAI13B04）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（ysxk-2014）

羅益遠(yuǎn)（1989—），男，碩士研究生，主要從事中藥品質(zhì)評價(jià)研究。E-mail：luoyiyuan0012@sohu.com

*通信作者：劉訓(xùn)紅（1959—），男，教授，碩士，主要從事中藥鑒定與品質(zhì)評價(jià)研究。E-mail：liuxunh1959@sohu.com