GC-O與GC-MS結(jié)合分析竹蓀牛肉香精中的揮發(fā)性成分

劉廷竹，黃明泉，鄒青青，李 娟，吳繼紅，肖 陽

（北京工商大學(xué) 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

GC-O與GC-MS結(jié)合分析竹蓀牛肉香精中的揮發(fā)性成分

劉廷竹，黃明泉，鄒青青，李 娟，吳繼紅，肖 陽*

（北京工商大學(xué) 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

采用同時蒸餾萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)，通過雙柱定性對竹蓀牛肉香精中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，并通過譜庫檢索和保留指數(shù)比對，共計從竹蓀牛肉香精中鑒定出化合物169 種，其中醇類26 種、醛類21 種、酮類9 種、酸類18 種、酚類4 種、酯類4 種、醚類6 種、烴類49 種、雜環(huán)及其他類32 種，其中十六醛、丁香酚、β-倍半水芹烯、茴香腦、β-紅沒藥烯、α-姜烯、油醇等相對含量較大；通過氣相色譜-嗅覺測定法，采用芳香萃取物稀釋分析法對其特征風(fēng)味成分進(jìn)行了分析，共鑒定出33 種特征成分，其中2-甲基-3-呋喃硫醇、α-蓽橙茄烯、反-佛手甘油烯、反式石竹烯，紅沒藥醇對牛肉香精風(fēng)味貢獻(xiàn)相對較大。

竹蓀牛肉香精；同時蒸餾萃??；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)；氣相色譜-嗅聞儀聯(lián)機(jī)；揮發(fā)性成分

竹蓀（Dictyophora indusiata）是一大類竹蓀屬真菌的總稱，中國食用竹蓀歷史悠久。竹蓀風(fēng)味氨基酸含量相對較高，脂肪含量相對較低[1-2]。同時，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)竹蓀具有多種作用，比如增強(qiáng)免疫、保護(hù)肝臟及抗輻射、降血脂、抗氧化等[3-6]。另外，竹蓀中的揮發(fā)性成分在中性至堿性條件下具有一定的抑菌作用，對實(shí)驗(yàn)用的肉類、蛋白類和淀粉類食品實(shí)驗(yàn)效果良好，而且研究發(fā)現(xiàn)抑菌成分在高溫高壓也相對比較穩(wěn)定[6]，具有廣泛的使用范圍[7]。

在熱反應(yīng)牛肉香精制備[8]中，竹蓀的添加能夠賦予其獨(dú)特的風(fēng)味；同時，竹蓀的抑菌作用會使牛肉香精的保質(zhì)期延長[9]，具有一定的市場潛力。

本課題組曾用竹蓀作為原料之一，開發(fā)了一種熱反應(yīng)牛肉香精，該香精香味和口感都比較好[9]。本實(shí)驗(yàn)是對該牛肉香精的香氣成分進(jìn)行分析研究。首先以二氯甲烷和乙醚為溶劑，采用同時蒸餾萃?。╯imultaneous distillation extraction，SDE）法對竹蓀牛肉香精中的香氣成分進(jìn)行萃取，然后采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）法對揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析檢測。最后通過氣相色譜-嗅覺（gas chromatographyolfactometry，GC-O）測定法，采用芳香萃取物稀釋分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）法[10]對其特征香成分進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牛肉（背腰肉） 市購；長裙竹蓀 四川宜賓市長寧縣；牛油（食用級） 天津牧羊油脂牛脂廠；胰酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（均為食品級） 諾維信生物技術(shù)有限公司；牛骨素（清湯）、復(fù)合料（肉桂、花椒、生姜、洋蔥、丁香、肉豆蔻、八角）、酵母浸膏 北京中融百鳴生物有限公司；D-木糖（生化試劑）、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、半胱氨酸（均為食品級）、葡萄糖（分析純）、VB1、水解植物蛋白液、二氯甲烷、無水乙醚、無水硫酸鈉（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

N-E VA P T M 1 1 1 1 2位干浴氮吹儀 美國Organomation Associates公司；SDE裝置 北京玻璃儀器廠；電動攪拌器 北京浩?？苾x科技有限公司；7890N-5975c、6890N-5973I GC-MS聯(lián)用儀、6890 GC裝置（配有氫火焰離子檢測器） 美國安捷倫公司；Sniffer 9000嗅聞裝置組成 瑞士Brechbuhler公司。

1.2 方法

1.2.1 熱反應(yīng)牛肉香精的制備

參照文獻(xiàn)[8]制備了相應(yīng)的熱反應(yīng)牛肉香精，牛肉香精的制備過程如下。

在100 mL的四口瓶中添加長裙竹蓀粉末用量0.175 g（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.50%）、牛油1.00 g（2.86%）、氯化鈉2.10 g（6.00%）、木糖0.175 g（0.50%）、復(fù)合料0.700 g（2.00%）、甘氨酸0.140 g（0.40%）、谷氨酸0.070 0 g（0.20%）、丙氨酸0.070 0 g（0.20%）、VB10.035 0 g（0.10%）、牛骨素2.10 g（6.00%）、酵母浸膏0.700 g（2.00%）、1∶1牛肉酶解物19.3 g（55.00%）、水解植物蛋白液3.50 g（10.00%）、半胱氨酸0.210 g（0.60%）和葡萄糖0.350 g（1.00%），添加蒸餾水使體系的質(zhì)量為35.0 g。將四口瓶置于電動攪拌器下進(jìn)行熱反應(yīng)，100 ℃條件下回流1 h，冷卻，即得竹蓀牛肉香精。

1.2.2 揮發(fā)性香味成分GC-MS分析

1.2.2.1 SDE制備樣品

取100 g樣品和50 mL去離子水于250 mL圓底燒瓶中，取無水乙醚80 mL于另一250 mL圓底燒瓶中，分別置于SDE裝置的重相側(cè)和輕相側(cè)，（萃取溶劑為二氯甲烷時，水相置于輕相側(cè)，二氯甲烷置于重相側(cè)）。水相一側(cè)135 ℃油浴加熱；萃取溶劑一側(cè)50 ℃水浴加熱。待兩相都開始沸騰后，開始計時，2 種溶劑分別萃取2 h。收集合并2 種溶劑的萃取液，加入適量無水硫酸鈉，密封，-20 ℃保存過夜，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至1 mL，氮?dú)獯祾咧?.5 mL左右。-20 ℃密封保存，待分析。

1.2.2.2 6890N-5973i GC-MS分析條件

GC條件：DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣（He）流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比20∶1；氣相進(jìn)樣口溫度240 ℃；傳輸線溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度35 ℃，保持1 min，以2 ℃/min升至90 ℃，保持5 min，再以2 ℃/min升至120 ℃，保持5 min，再以4 ℃/min升至165 ℃，保持6 min，再以4 ℃/min升至180 ℃，保持3 min，最后以15 ℃/min升至240 ℃，保持5 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源250 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 20～450；掃描模式為全掃描；溶劑延遲時間3.0 min。

1.2.2.3 7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀分析條件

GC條件：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣（He）流速1.0 mL/min；進(jìn) 樣量1 μL；不分流；進(jìn)樣口溫度260 ℃；傳輸線溫度280 ℃；升溫程序：起始溫度35 ℃，以2.5 ℃/min升至80 ℃，保持3 min，再以2 ℃/min升至120 ℃，保持5 min，再以2.5 ℃/min升至180 ℃，保持5 min，再以7 ℃/min升至240 ℃，最后以15 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～550；掃描模式為全掃描；溶劑延遲時間3.0 min。

1.2.3 揮發(fā)性香味成分的GC-O分析

1.2.3.1 AEDA方法

將萃取濃縮物用二氯甲烷按體積比1∶3、1∶9、1∶27、1∶81、1∶243進(jìn)行系列稀釋，每次稀釋后注入1 μL到GC-O進(jìn)行分析，直到評價員在Sniffer 9000末端不再聞到氣味則停止稀釋。AEDA法是通過計算每種香味化合物的香氣稀釋因子（flavor dilition，F(xiàn)D，初始樣品中香味化合物的濃度與最大稀釋后的樣品中該化合物的濃度比值）來判斷各化合物的香氣貢獻(xiàn)大小。

1.2.3.2 GC-O分析條件

DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣（He）；柱流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比20∶1；進(jìn)樣口溫度240 ℃；升溫程序與6890N-5973i GC-MS相同。

1.2.4 定性定量分析

竹蓀牛肉香精的定性分析主要采用譜庫檢索（NIST 11），并結(jié)合保留指數(shù)，使用雙柱共同進(jìn)行分析鑒定。雙柱定性，利用了在不同極性色譜柱上樣品分子的出峰順序不同的原理，在非極性柱上，是按照沸點(diǎn)由低到高順序，而在極性柱上主要由化合物的結(jié)構(gòu)決定。雙柱定性避免了只用一根色譜柱分析存在的分離局限性。采用峰面積歸一化法確定化合物相對含量。同時結(jié)合GC-O，對竹蓀牛肉香精的風(fēng)味活性成分進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹蓀牛肉香精揮發(fā)性成分的定性定量分析

圖1 竹蓀牛肉香精DB-WAX柱（A）、HP-5柱（B）分析總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile components separated on DB-WAX column (A) and HP-5 column (B)

以二氯甲烷、乙醚為溶劑，采用SDE法，所得萃取液經(jīng)濃縮后通過GC-MS進(jìn)行雙柱定性分析，相應(yīng)的質(zhì)譜總離子流圖如圖1所示，分析鑒定結(jié)果如表1所示，GC-O分析香氣成分及特點(diǎn)見表2。

表1 SDE結(jié)合GC-MS分析長裙竹蓀牛肉香精揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components inDictyophora indusiiaattaa beef flavoorr extracted by SDE and identified by GC-MS

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

由表1可知，用乙醚、二氯甲烷2 種溶劑，采用SDE法結(jié)合GC-MS聯(lián)機(jī)分析，由HP-5柱共鑒定出122 種化合物，其中醇類21 種、醛類16 種、酮類4 種、酸類6 種、酯類3 種、醚類3 種、酚類4 種、烴類42 種、雜環(huán)類及其他23 種；由DB-WAX柱共鑒定出107 種化合物，其中醇類18 種、醛類14 種、酮類7 種、酸類14 種、酯類1 種、醚類6 種、酚類1 種、烴類27 種、雜環(huán)類及其他19 種。HP-5柱為弱極性色譜柱，樣品分子主要是按照沸點(diǎn)由低到高順序出峰，DB-WAX柱為強(qiáng)極性色譜柱主要由化合物的結(jié)構(gòu)決定。對于一些結(jié)構(gòu)比較接近的，比如烴類，DB-WAX柱難以將其很好的分離開。所以HP-5柱比DBWAX柱的測得化合物組分要多。

通過2 種溶劑萃取，共計從竹蓀牛肉香精中鑒定出169 種化合物，其中醇類26 種、醛類21 種、酮類9 種、酸類18 種、酯類4 種、醚類6 種、酚類4 種、烴類49 種、雜環(huán)及其他類32 種，相對含量較大的有丁香酚、棕櫚酸、β-紅沒藥烯、α-姜黃烯、β-紅沒藥烯、油醇、肉豆蔻酸、β-倍半水芹烯、α-姜烯、正十八醛等。與一般的牛肉香精[11-15]相比，烯烴類化合物種類相對較多，原因可能與加入的原料竹蓀有關(guān)[16-18]；醛、酸、酚等類化合物數(shù)量基本一致。另外，有57 種化合物未在其他相關(guān)牛肉香精文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，其中6-甲基-5-庚烯-2-酮、2,5-二甲基-1,5-己二烯-3,4-二醇、桉葉醇、9-異長葉烯酮、α-欖香醇、α-綠葉烯、長葉蒎烯、菖蒲二烯、β-綠葉烯、吲哚、異香橙烯環(huán)氧化合物在其他牛肉香精中未發(fā)現(xiàn)，卻在竹蓀中有發(fā)現(xiàn)[16-18]，因此推測這些化合物來源于竹蓀。

本實(shí)驗(yàn)鑒定出21 種醛類化合物，醛類主要來自于脂肪氧化和斯特雷克爾（Strecker）氨基酸反應(yīng)[19]。一般C6～C12飽和脂肪族醛稀釋條件下具有令人愉悅的香氣，如壬醛和癸醛，具有強(qiáng)烈的脂肪、花香、柑橘香氣[20]；月桂醛和肉豆蔻醛具有花香、水果香、奶香。酮類主要由熱降解和美拉德反應(yīng)生成[21]，主要包含3-羥基-2-丁酮、2,3-戊二酮、2,3-丁二酮。這幾種酮在牛肉香精香氣成分中早有報道[21]。

醇類一般由脂肪氧化或者由羰基化合物還原生成[13]。還有一部分來自辛香料中，比如芳樟醇、香葉醇、桉葉醇，橙花叔醇、攬香醇等在姜[22]中有發(fā)現(xiàn)。

酸類化合物一般由脂類降解和對應(yīng)的醇、醛氧化形成，在一定范圍內(nèi)可以增加牛肉風(fēng)味，但如果含量過大，則酸氣過重容易產(chǎn)生異味[21]。

醇和脂肪酸縮合形成酯。一般認(rèn)為內(nèi)酯和硫酯對肉風(fēng)味相對其他類型酯貢獻(xiàn)大[23]。內(nèi)酯一般由含羥基的脂肪酸經(jīng)脫水環(huán)化生成[24]，這類化合物具有令人愉悅的花香，果香，奶香氣味[20]。比如γ-戊內(nèi)酯具有水果和椰子香氣。

醚類化合物、酚類化合物大多來自加入的辛香料中，如具有茴香、辛香、甘草香的茴香腦主要來自花椒[25]；如具有甜的花香和辛香的丁香酚，可由辛香料中的丁香帶入。

雜環(huán)化合物也是牛肉香精重要的香味成分，它們主要來源于氨基酸和還原糖之間的美拉德反應(yīng)[20,24,26-27]，如圖2所示。

圖2 2 氨基酸和還原糖之間的美拉德反應(yīng)Fig.2 Maillard reaction of amino acids and reducing sugar

除此之外在該香精中還檢測到種類比較多的烯烴類物質(zhì)，比如鑒定出來的α-蒎烯、石竹烯、α-姜烯、D-檸檬烯、β-水芹烯、3-蒈烯等化合物，都是與熱反應(yīng)過程中加入的辛香料和竹蓀有關(guān)。

2.2 竹蓀牛肉香精的特征風(fēng)味成分分析

通過GC-O測定，采用AEDA法對竹蓀牛肉香精特征風(fēng)味成分進(jìn)行了嗅聞分析，結(jié)果見表2。

表2 竹蓀牛肉香精揮發(fā)性成分的GC-O分析結(jié)果Table 2 Results obtained for GC-O analysis of volatile components inDictyophora indusiata beef flavor

由表2可知，通過GC-O分析，采用AEDA法對竹蓀牛肉香精特征風(fēng)味成分進(jìn)行了分析，檢測到33 種香氣活性化合物，嗅聞到許多不同的氣味，包括青草味、燒烤味、藥味、牛肉香味、蔥味等，其中有14 種，其FD在3～243之間，包括α-蓽澄茄烯、2-甲基-3-呋喃硫醇、反-佛手甘油烯、反式石竹烯、紅沒藥醇、松油醇、γ-杜松稀、β-紅沒藥烯、α-金合歡烯、己酸、3-甲基噻吩醛、4-甲氧基苯甲醛和一種未知化合物。由FD可以看出，其中2-甲基-3-呋喃硫醇、α-蓽澄茄烯、反-佛手甘油烯、反式石竹烯、紅沒藥醇具有相對比較高的FD（log3FD≥2）值，對該牛肉香精的整體風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)。2-甲基-3-呋喃硫醇這種化合物可以通過多種途徑形成，比如可以由核糖和半胱氨酸之間的Maillard反應(yīng)形成[20]，也可以通過硫胺素的熱降解形成[28]。這種化合物已被鑒別為牛肉中最關(guān)鍵的香味活性化合物[29]。α-蓽橙茄烯、反式石竹烯可能來自花椒[25]，紅沒藥醇主要來自生姜[30]中，反-佛手甘油烯可能來自于八角茴香[31]?？梢娦料懔咸砑拥姆N類和含量對牛肉香精香味成分有比較大的影響。正辛醛、2-甲氧基-5-甲基噻吩、6-甲基-5-庚烯-2-酮、甲酸、2-乙?；秽?、丙酸等log3FD小于1，說明這些物質(zhì)對牛肉香精的香氣影響比較小。綜上，2-甲基-3-呋喃硫醇、α-蓽橙茄烯、反-佛手甘油烯、反式石竹烯、紅沒藥醇對牛肉香精的風(fēng)味具有關(guān)鍵性的影響。

3 結(jié) 論

采用乙醚和二氯甲烷作為溶劑，通過SDE萃取，然后進(jìn)行GC-MS分析。研究結(jié)果表明，使用不同的毛細(xì)管柱，GC-MS最后分離檢測的物質(zhì)種類有差別。2 種毛細(xì)柱共鑒定出169 種化合物，其中醇類26 種、醛類21 種、酮類9 種、酸類18 種、酯類4 種、醚類6 種、酚類4 種、烴類49 種、雜環(huán)及其他類32 種，其中含量較大的有十六醛、丁香酚、β-倍半水芹烯、茴香腦、β-紅沒藥烯、α-姜烯、油醇等。其中有57 種物質(zhì)未在其他相關(guān)牛肉香精文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，這些物質(zhì)主要來自辛香料和竹蓀中。

通過GC-O，采用AEDA對竹蓀牛肉香精特征成分進(jìn)行了嗅聞分析，結(jié)果說明，2-甲基-3-呋喃硫醇、α-蓽橙茄烯、反-佛手甘油烯、反式石竹烯、紅沒藥醇對牛肉香精的風(fēng)味具有關(guān)鍵性的影響。

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Analysis of Volatile Compounds in Dictyophora indusiata-Fortified Beef Flavor by GC-MS and GC-O

LIU Tingzhu, HUANG Mingquan, ZOU Qingqing, LI Juan, WU Jihong, XIAO Yang*
(Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Volatile compounds of the new Dictyophora indusiata-fortified beef flavor were analyzed by simultaneous distillation extraction (SDE) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results showed that by NIST 11 Mass Spectral Library searching and retention index comparison, a total of 169 compounds, including 26 alcohols, 21 aldehydes, 9 ketones, 18 organic acid, 4 phenols, 4 esters, 6 ethers, 49 hydrocarbons, 32 amines and others, were identified when ether and dichloromethane were used as the solvents. Among the compounds identified, the contents of anethole, α-zingiberene, β-sesquiphellandrene, β-bisabolene, eugenol, oleyl alcohol and n-hexadecanal were higher. Then the SDE extract was analyzed by GC-olfactometry (GC-O), and the aroma-active compounds were identified by aroma extract dilution analysis (AEDA). A total of 33 compounds, including 2-methyl-3-furanthio, α-cubebene, trans-bergamot glycerin ene, β-caryophyllen and bisabolol, were identified, which made higher contributions to the flavor of the D. indusiata beef flavor.

Dictyophora indusiata beef flavor; simultaneous distillation extraction; gas chromatography-olfactometry (GC-O); gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); volatile components

10.7506/spkx1002-6630-201602016

TS207.3

A

1002-6630（2016）02-0092-07

劉廷竹, 黃明泉, 鄒青青, 等. GC-O與GC-MS結(jié)合分析竹蓀牛肉香精中的揮發(fā)性成分[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 92-98. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602016. http://www.spkx.net.cn

LIU Tingzhu, HUANG Mingquan, ZOU Qingqing, et al. Analysis of volatile compounds in Dictyophora indusiata-fortified beef flavor by GC-MS and GC-O[J]. Food Science, 2016, 37(2): 92-98. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201602016. http://www.spkx.net.cn

2015-05-04

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471665）；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計劃項(xiàng)目（CIT & TCD 201404034）

劉廷竹（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橄憔懔系姆治雠c應(yīng)用。E-mail：liutingzhuu@163.com

*通信作者：肖陽（1967—），男，高級實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)榛瘖y品、食品分析檢測。E-mail：xiaoy@btbu.edu.cn