姜黃素類似物A13對小鼠肥大細(xì)胞瘤P815增殖及凋亡的影響

曹建成 郭 璐

1.浙江省湖州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，浙江湖州313000；2.浙江省湖州市第一人民醫(yī)院藥劑科，浙江湖州313000

姜黃素類似物A13對小鼠肥大細(xì)胞瘤P815增殖及凋亡的影響

曹建成1郭 璐2

1.浙江省湖州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，浙江湖州313000；2.浙江省湖州市第一人民醫(yī)院藥劑科，浙江湖州313000

目的研究姜黃素（CUR）類似物A13對小鼠肥大細(xì)胞瘤P815細(xì)胞增殖及凋亡的影響，了解其在體外的抗腫瘤價(jià)值，從而為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的開展提供依據(jù)。方法為檢測藥物對細(xì)胞的作用，將實(shí)驗(yàn)分為2.5、5、10 μmol/L A13組，10 μmol/L CUR組，二甲基亞砜（DMSO）對照組。P815細(xì)胞調(diào)整為6.25×103/mL、1.25×104/mL、2.5×104/mL三個(gè)細(xì)胞濃度。運(yùn)用四唑鹽溶液（MTT）法測定各組對三種細(xì)胞濃度P815細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞術(shù)（FCM）測定各組對細(xì)胞濃度為5×105/mL P815凋亡的影響。結(jié)果10 μmol/L A13組對6.25×103/mL、1.25×104/mL、2.5×104/mL三個(gè)細(xì)胞濃度下P815的抑制率與10 μmol/L CUR組比較差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。5 μmol/L A13組對細(xì)胞濃度為6.25×103/mL和2.5×104/mL的P815細(xì)胞的抑制率與10 μmol/L CUR組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。給藥12 h后，10 μmol/L A13組早期凋亡率與DMSO對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與10 μmol/L CUR組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論CUR類似物A13體外具有良好的促凋亡和抑制細(xì)胞增殖的能力，對于體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的開展具有更好的說服力。

姜黃素類似物A13；P815；增殖；凋亡

移植物抗宿主?。℅VHD）是一種異基因造血干細(xì)胞移植后主要的并發(fā)癥，是造成移植后非復(fù)發(fā)死亡的主要原因，嚴(yán)重威脅著患者的生存［1-2］。目前臨床使用的藥物都會因?yàn)橐种艷VHD作用很強(qiáng)，而破壞移植物抗腫瘤（GVL）的作用［3］，這就為我們進(jìn)行新藥的研究提供了一個(gè)新的方向，即降低GVHD的發(fā)生率，保留GVL作用。姜黃素（CUR）是一種從姜科植物姜黃等的根莖中提取得到的黃色色素，具有抗炎、抗腫瘤的藥理作用［4］，其對GVHD的治療作用目前研究較少，但其生物利用度和水溶性較差，不利于靜脈給藥、觀察療效，所以本研究通過結(jié)構(gòu)修飾和改造得到了生物利用度和水溶性更佳的A13。小鼠肥大細(xì)胞瘤P815作為一種白血病造模細(xì)胞，注入動物體內(nèi)后，在動物的白血病模型建立中能穩(wěn)定表達(dá)，造成白血病模型，所以較為常用［5］。前期筆者已驗(yàn)證A13的抗炎作用，所以了解A13體外對P815的作用對于進(jìn)行體內(nèi)的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)具有很重要的意義。

1 材料與方法

1.1 化合物和細(xì)胞

CUR類似物A13由浙江省生物有機(jī)與藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，相關(guān)結(jié)構(gòu)見圖1。P815細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

圖1 A13的結(jié)構(gòu)式

1.2 相關(guān)試劑

DMEM低糖培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；0.1 mol/L PBS（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；0.25%胰酶（Hyclone公司）；1× 105μg/mL雙抗（Hyclone公司）；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I（美國BD公司）；四唑鹽（MTT）粉末（廣州斯佳科技有限公司）；A13用DMSO溶解后配成50 mmol/L的貯存液置于4℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋至所需濃度。

1.3 主要儀器設(shè)備

滅菌鍋（蘇州江東精密儀器有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海森信公司）；酶標(biāo)儀（賽默飛世爾MK3杭州吉西今科學(xué)儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（貝克曼J-26XP上海寬為）；低溫冰箱（BCD216TXD海爾公司）；超低溫冰箱（FORMA702杭州寶誠公司）；電子天平（宇稱BSA224S）；超凈工作臺（BSC-1360IIA2哈東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；超濾管（Millipore公司）；流式細(xì)胞儀（BD公司）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

P815小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞為半懸浮生長細(xì)胞，培養(yǎng)于含有1.5 g/L碳酸氫鈉、4.5 g/L葡萄糖、10%胎牛血清、4 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。當(dāng)細(xì)胞生長到鋪滿培養(yǎng)瓶時(shí)進(jìn)行傳代。細(xì)胞傳代方法：使用滅菌移液槍吸取培養(yǎng)基輕輕吹打細(xì)胞，使貼于細(xì)胞瓶底的細(xì)胞全部脫落，成為單個(gè)懸浮細(xì)胞后，離心除去消化液，用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，分置其他無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入完全培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 MTT測活性

本實(shí)驗(yàn)使用MTT法測定CUR類似物A13抑制P815細(xì)胞生長的活性。①用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將對數(shù)生長期的P815細(xì)胞調(diào)節(jié)至濃度為6.25×103/mL、1.25×104/mL、2.5×104/mL，接種于96孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。②24 h后，將DMSO對照組、10 μmol/L CUR組和2.5、5、10 μmol/L A13組分別加入96孔板中，每3孔為一平行組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。③24 h后利用MTT試劑盒進(jìn)行操作，在570 nm波長下測其OD值，繪制對應(yīng)的抑制率-藥物濃度柱狀圖。抑制率=100%-（藥物組OD值-非處理組OD值）/非處理組OD值×100%。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測

本實(shí)驗(yàn)使用流式細(xì)胞儀法測定CUR類似物A13誘導(dǎo)P815細(xì)胞的凋亡率。①將對數(shù)生長期的P815細(xì)胞調(diào)節(jié)至濃度為5×105/mL，加入60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。②24 h后，將DMSO對照組、10 μmol/L CUR組和2.5、5、10 μmol/L A13組分別加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。③12 h后利用膜聯(lián)蛋白-V/碘化丙啶（FITC Annexin V）凋亡檢測試劑盒進(jìn)行操作，在流式細(xì)胞儀FL1和FL2波長下測其熒光強(qiáng)度，繪制對應(yīng)的凋亡率-藥物濃度曲線。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用SPSS 17.0軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CUR類似物A13體外抑制P815細(xì)胞增殖

為了解A13對P815細(xì)胞體外增殖的抑制情況，與CUR比較是否抑制細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，本研究將P815細(xì)胞設(shè)定三個(gè)濃度分別為6.25×103/mL、1.25× 104/mL、2.5×104/mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每次給藥都有3個(gè)平行孔。結(jié)果以抑制率來表示藥物對P815增殖能力的大小，結(jié)果數(shù)值越大，表示藥物抑制增殖的能力越強(qiáng)。10 μmol/L A13組對6.25×103/mL、1.25×104/mL、2.5× 104/mL三個(gè)細(xì)胞濃度下P815的抑制率與10 μmol/L CUR組比較差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。5 μmol/L A13組對細(xì)胞濃度為6.25×103/mL和2.5× 104/mL的P815細(xì)胞的抑制率與10 μmol/L CUR組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖2。

表1 三種細(xì)胞濃度下各實(shí)驗(yàn)組對P815細(xì)胞的抑制率（%，±s）

表1 三種細(xì)胞濃度下各實(shí)驗(yàn)組對P815細(xì)胞的抑制率（%，±s）

注：與10 μmol/L CUR組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；CUR：姜黃素

組別細(xì)胞濃度6.25×103/mL1.25×104/mL2.5×104/mL 2.5 μmol/L A13組5 μmol/L A13組10 μmol/L A13組10 μmol/L CUR組56.10±0.90 93.58±0.69*93.81±0.81**74.52±0.44 27.53±7.33 67.82±9.21 95.22±0.20**55.17±7.72 5.46±0.97 20.41±1.45*85.09±3.72**14.70±1.35

圖2 三種細(xì)胞濃度下各實(shí)驗(yàn)組對P815細(xì)胞的抑制率

2.2 CUR類似物A13體外誘導(dǎo)P815細(xì)胞凋亡

凋亡實(shí)驗(yàn)中，CUR類似物A13對P815細(xì)胞不僅可以促進(jìn)其凋亡，還存在著濃度依賴性，本研究以早期凋亡的百分率作為統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，給藥12 h后，10 μmol/L A13組早期凋亡率與DMSO對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與10 μmol/L CUR組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。圖3中橫縱坐標(biāo)為流式細(xì)胞儀中代表細(xì)胞的散射光和檢測通道。Annexin V單陽性細(xì)胞（Annexin V+PI-）為早期凋亡細(xì)胞，PI單陽性細(xì)胞（Annexin V-PI+）為死亡細(xì)胞，Annexin V和PI雙陽性細(xì)胞（Annexin V+PI+）為晚期凋亡細(xì)胞，AnnexinV和PI雙陰性細(xì)胞（AnnexinV-PI-）為正常存活細(xì)胞。

3 討論

CUR是從姜黃中提取的一種酚類色素，是一種具有降脂、抗炎、抗氧化、清除自由基、抗微生物、抗腫瘤以及對心血管系統(tǒng)消化系統(tǒng)等多種生物活性的天然多酚［6］，而其抗腫瘤作用日益引起人們的重視，它對多種腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖、轉(zhuǎn)移均有抑制活性，如結(jié)腸癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、皮膚癌等［7-9］，對血液系統(tǒng)惡性腫瘤的研究也已廣泛開展［10-11］。但其存在生物利用度低、水溶性較差等缺點(diǎn)，使其臨床應(yīng)用受到限制。有文獻(xiàn)報(bào)道，CUR被包裹為微乳時(shí)對血液腫瘤細(xì)胞同樣具有抗增殖和促凋亡的作用［12］。通過改變劑型可以增加CUR的生物活性，于是筆者對CUR展開了大量的結(jié)構(gòu)改造，以期能改善其生物活性及成藥性，通過前期篩選得到了目標(biāo)藥物A13。

表2 各組對5×105/mL P815細(xì)胞給藥12 h后早期凋亡率的影響（%，s）

表2 各組對5×105/mL P815細(xì)胞給藥12 h后早期凋亡率的影響（%，s）

注：與DMSO對照組比較，*P＜0.05；CUR：姜黃素；DMSO：二甲基亞砜

組別早期凋亡率2.5 μmol/L A13組5 μmol/L A13組10 μmol/L A13組10 μmol/L CUR組DMSO對照組5.00±2.51 6.00±0.57 10.00±1.00*4.66±1.76 3.00±1.52

圖3 各組給藥12 h后P815細(xì)胞凋亡流式分析

肥大細(xì)胞瘤P815細(xì)胞是一種DBA/2系小鼠來源的腫瘤細(xì)胞［13］，它的抗原背景較清楚，且其中一種抗原P1A是目前已知小鼠腫瘤中僅有的一個(gè)與人類腫瘤抗原MAGE基因家族表達(dá)相似的腫瘤抗原，使其成為腫瘤免疫學(xué)特別是腫瘤疫苗領(lǐng)域常用的細(xì)胞系之一。而本課題正是研究當(dāng)小鼠體內(nèi)存在血液腫瘤時(shí)，通過骨髓移植的手段，CUR類似物A13可以減少移植物抗宿主病，保留移植物抗腫瘤作用。

通過MTT實(shí)驗(yàn)可知，5、10 μmol/L A13在體外都具有一定的抑制細(xì)胞增殖的能力，那它是通過影響周期還是促進(jìn)細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞的生長的？有文獻(xiàn)報(bào)道，CUR能增加成纖維細(xì)胞G2/M的比例，減少S期來抑制細(xì)胞增殖［14］。前期周期實(shí)驗(yàn)提示，不同濃度的A13并不影響P815細(xì)胞的生長周期，并不存在周期特異性。細(xì)胞凋亡是為適應(yīng)環(huán)境變化的一種主動反應(yīng)過程，存在2個(gè)核心途徑，即外源性死亡受體途徑和內(nèi)源性線粒體途徑［9］，其主要受到Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等的調(diào)控。運(yùn)用Annexin V-FITC試劑盒的流式細(xì)胞技術(shù)是檢測細(xì)胞凋亡比較常用的手段，具有靈敏度高、可檢測出早期凋亡等特點(diǎn)。當(dāng)?shù)蛲鲩_始時(shí)，較早出現(xiàn)的凋亡特征之一是作為質(zhì)膜組分的磷脂酰絲氨酸從膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到膜外側(cè)而暴露于細(xì)胞表面。Annexin V分子是一種與磷脂酰絲氨酸有高親和力的磷脂結(jié)合蛋白，可結(jié)合胞外的磷脂酰絲氨酸，由于Annexin V標(biāo)記了熒光染料FITC，利用流式細(xì)胞儀便可靈敏地檢測出發(fā)生凋亡的細(xì)胞［15］。在本研究中，用不同濃度的A13處理P815細(xì)胞12 h后，結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞早期凋亡率增加，且呈劑量依賴型?？傊珹13作為CUR類似物提高了生物利用度和水溶性，但不具有影響細(xì)胞周期的能力，這為我們進(jìn)一步探討A13是通過哪種機(jī)制影響凋亡提供了方向。

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Effects of curcumin analogues A13 on the proliferation and apoptosis of mastocytoma cells P815 in mice

CAO Jiancheng1GUO Lu2
1.Department of Cardiology，the First People＇s Hospital of Huzhou City，Zhejiang Province，Huzhou313000，China；2.Department of Pharmacy，the First People＇s Hospital of Huzhou City，Zhejiang Province，Huzhou313000，China

ObjectiveTostudytheeffect of curcumin（CUR）analoguesA13onthe proliferation and apoptosis of mastocytoma cells P815 in mice，to understand its advantage of anti-tumor in vitro，so as to provide a basis for the start of experiments in vivo.Methods To detect the effect of drugs on cells，the experiment was divided into 2.5，5，10 μmol/L A13 group，10 μmol/L CUR group，dimethyl sulfoxide（DMSO）control group.The P815 cells were set as 6.25×103/mL，1.25×104/mL，2.5×104/mL three different concentrations.The methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）was used to detect the proliferation effects of all groups for three different concentrations of P815 cells.Furthermore，flow cytometry（FCM）was used to detect the apoptosis effects of all groups for 5×105/mL P815 cells.Results The inhibition rates of 10 μmol/L A13 group for 6.25×103/mL，1.25×104/mL，2.5×104/mL concentrations of P815 cells had highly statistically significant differences compared with 10 μmol/L CUR group（P＜0.01），the inhibition rates of 5 μmol/L A13 group for 6.25×103/mL，2.5×104/mL concentrations of P815 cells had statistically significant differences compared with 10 μmol/L CUR group（P＜0.05）. After administration for 12 h，the early apoptosis rate of 10 μmol/L A13 group had a statistically significant difference compared with DMSO control group（P＜0.05），which had no statistically significant difference compared with 10 μmol/L CUR group（P＞0.05）.Conclusion CUR analogues A13 has good advantages on promoting apoptosis and inhibiting proliferation in vitro，which has better persuasion for the experiment of anti-tumor in vivo.

Curcumin analogues A13；P815；Proliferation；Apoptosis

R285

A

1673-7210（2016）07（b）-0022-04

2016-02-13本文編輯：張瑜杰）