HBV核苷（酸）類似物耐藥突變及其檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用

巢薇何寶玉

·綜述·

HBV核苷（酸）類似物耐藥突變及其檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用

巢薇★何寶玉

目前，可供臨床應(yīng)用的抗慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的核苷（酸）類似物［nucleos（t）ide analogs，NAs］包括拉米夫定（lamivudine，LAM）、替比夫定（telbivudine，LdT）、阿德福韋酯（adefovir，ADV）、恩替卡韋（entecavir，ETV）及替諾福韋酯（tenofovir，TDF），NAs作為病毒逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，可抑制HBV DNA復(fù)制擴(kuò)增。由于HBV屬于高基因變異率病毒，NAs長期治療后，選擇壓力下使耐藥病毒株成為優(yōu)勢株，影響治療效果。因此，為防治CHB抗病毒治療中耐藥的發(fā)生，弄清楚其耐藥機(jī)制及變異的監(jiān)測及診斷十分必要。本文總結(jié)了近年來發(fā)現(xiàn)的常見突變位點(diǎn)，并比較了幾種臨床應(yīng)用的突變監(jiān)控及檢測技術(shù)，對耐藥突變進(jìn)行早期、快速檢測具有重要臨床意義，使慢性HBV感染的監(jiān)測達(dá)到最優(yōu)化。

核苷（酸）類似物；耐藥突變；乙型肝炎病毒；慢性乙型肝炎；常見耐藥變異；突變位點(diǎn)檢測

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種高危致病性病毒，慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是HBV最常引起的一種慢性疾病，1/3以上的感染者在中國［1］?？共《局委熓荂HB的根本治療措施，核苷（酸）類似物［Nucleos（t）ide analogs，NAs］作為目前臨床抗病毒治療的主流藥物，主要包括拉米夫定（lamivudine，LAM）、替比夫定（telbivudine，LdT）、阿德福韋酯（adefovir，ADV）、恩替卡韋（entecavir，ETV）及替諾福韋酯（tenofovir，TDF）5種常用藥物，它們均可抑制病毒DNA復(fù)制［2］。但隨著應(yīng)用時間的推移和應(yīng)用群體的擴(kuò)大，NAs耐藥問題日趨嚴(yán)重。啟動NAs抗病毒治療后，需定期監(jiān)控評估NAs常見耐藥突變位點(diǎn)變異率，根據(jù)應(yīng)答和耐藥情況調(diào)整藥物和療程［3］。這已成為CHB抗病毒治療中的重要監(jiān)測措施。新突變位點(diǎn)的不斷發(fā)現(xiàn)及檢測方法的不斷更新和廣泛應(yīng)用，將為提高CHB抗病毒的治療療效提供重要的理論和技術(shù)支持。本文綜述了近年來報道的基因多位點(diǎn)耐藥相關(guān)突變，這有助于臨床及時發(fā)現(xiàn)乙型肝炎患者是否存在HBV耐藥。同時，文章比較了幾種臨床應(yīng)用的突變監(jiān)控及檢測技術(shù)，結(jié)合其原理及技術(shù)發(fā)展，對耐藥檢測技術(shù)的現(xiàn)狀進(jìn)行分析比較，為臨床動態(tài)監(jiān)測HBV變異病毒株、指導(dǎo)合理用藥奠定了基礎(chǔ)。

1 HBV NAs的耐藥機(jī)制

HBV吸附脫殼感染肝細(xì)胞后，在HBV DNA聚合酶作用下，以負(fù)鏈DNA為模板修補(bǔ)延長正鏈，形成的共價閉合環(huán)狀的雙鏈DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）進(jìn)入細(xì)胞核［4-5］。在核內(nèi)以cccDNA為模板轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA，含有HBV全部遺傳信息，故稱為前基因組RNA。前基因組RNA出核后逆轉(zhuǎn)錄為負(fù)鏈DNA，繼續(xù)以負(fù)鏈為模板合成正鏈，雙鏈環(huán)化形成完整的HBV DNA［4，6］。NAs治療則通過抑制逆轉(zhuǎn)錄酶活性，阻止前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄形成新的病毒DNA，從而發(fā)揮抑制病毒復(fù)制的作用。HBV前基因組RNA是以HBV的cccDNA為模板合成的，即NAs的藥效靶點(diǎn)在cccDNA的下游，見圖1。所以NAs不能直接清除已經(jīng)存在的cccDNA［7-8］，因此，為了維持HBV的低水平復(fù)制，NAs治療需很長時間。其次，由于HBV DNA復(fù)制過程必需的逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏3′-5′外切活性，極易導(dǎo)致堿基錯配，病毒基因自發(fā)突變頻率高。因此，一旦病毒對長期服用的某種NAs藥物產(chǎn)生選擇壓力，此種藥物便失去了療效，從而導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。

體內(nèi)出現(xiàn)耐藥變異后，繼續(xù)維持相同NAs治療，野生敏感病毒株被抑制，變異株加快復(fù)制取代野生株成為優(yōu)勢株，從而導(dǎo)致對NAs耐藥。隨著研究的深入，耐藥機(jī)制已由傳統(tǒng)的定性研究向精確的定量研究跨越，隨之而來的一系列問題需要研究者繼續(xù)去探索：變異株達(dá)到病毒群的多少百分比可以稱為優(yōu)勢株？繼續(xù)使用NAs治療，變異株積累成優(yōu)勢株，最后成為耐藥株的速率與不同NAs的服用劑量有何關(guān)系？優(yōu)勢株占多少比例時會出現(xiàn)病毒學(xué)突破？在檢測到耐藥突變后，如何進(jìn)一步明確患者體內(nèi)變異株的比率或者變異株的拷貝數(shù)與臨床的關(guān)系？新突變位點(diǎn)的不斷發(fā)現(xiàn)及檢測方法的不斷更新，將對這些問題的深入研究和探討提供必要的保障與支持。

2 HBV NAs常見的耐藥突變位點(diǎn)

HBV耐藥基因突變發(fā)生于病毒逆轉(zhuǎn)錄酶基因序列區(qū)域。根據(jù)2001年提議的耐藥突變位點(diǎn)命名規(guī)則，將HBV耐藥變異統(tǒng)一從逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)（各基因型均為344個氨基酸）的第一個氨基酸數(shù)起并加前綴rt，分別為rt1～rt344（例如YMDD變異被命名為rtM 204V）［9］。

2.1 LAM和LdT耐藥變異位點(diǎn)

LAM是最早應(yīng)用于臨床的核苷類似物，迄今仍有CHB患者使用LAM，因此，其耐藥突變位點(diǎn)最多，而且耐藥發(fā)生率以每年約30％的速率增加［10］。LAM耐藥突變主要發(fā)生在逆轉(zhuǎn)錄酶基因C區(qū)的保守序列YMDD區(qū)域，堿基發(fā)生置換時，第204位的蛋氨酸（M）變?yōu)榱涟彼幔╒）或異亮氨酸（I）即為rtM 204V/I/S。在rtM 204V/I出現(xiàn)后，若繼續(xù)維持LAM治療，則會出現(xiàn)耐藥性更強(qiáng)的突變—rtL180V/I/M［11-12］。rtM 204V/I和rtL180V/I/M的患者會進(jìn)一步引發(fā)第3個常見的突變位點(diǎn)rt173L。近年來報道的LAM耐藥突變位點(diǎn)還包括rtA181T及rtQ215S。長期的LAM治療通常會導(dǎo)致許多組合型耐藥突變，rtL180M+rtM 204V、rtL180M+ rtM 204I、rtV173L+rtL180M+rtM 204V、rtM 204I是LAM耐藥變異的主要組合方式［13］。

LdT和LAM同屬于L-核苷，故二者具有交叉耐藥突變位點(diǎn)，包括M 240及L180［14］。由于存在交叉耐藥，故不可在出現(xiàn)LAM耐藥后繼續(xù)使用LdT治療［15］。因此，對于結(jié)構(gòu)相似會出現(xiàn)交叉耐藥現(xiàn)象時，需綜合考慮耐藥位點(diǎn)及相關(guān)變異情況，適時進(jìn)行耐藥監(jiān)控，結(jié)合臨床癥狀，選擇正確的抗病毒治療藥物。

2.2 ADV耐藥變異位點(diǎn)

ADV耐藥突變率較LAM低，初治患者（指未用過NAs抗HBV藥物者）第1年未見耐藥，HBeAg陰性初治患者ADV治療的基因耐藥率前5年分別為0、3％、7％、8％、11％［11］。N236T氨基酸置換是ADV標(biāo)志性耐藥變異位點(diǎn)，繼續(xù)ADV治療，引起YMDD臨近區(qū)域的耐藥變異rtA181V/T。常見的ADV耐藥突變還有C區(qū)的rtV214A、D區(qū)的rtQ215S、rtI233V及rtL217R等。ADV藥物結(jié)構(gòu)與LAM不同，rtN236T變異不會改變LAM的敏感性，但rtA181V/T、rtV214A及rtQ215S變異株會與LAM出現(xiàn)交叉耐藥［16］。

2.3 ETV耐藥變異位點(diǎn)

ETV是鳥嘌呤核苷類似物，ETV的耐藥位點(diǎn)是在拉米夫定耐藥位點(diǎn)（rtL180M+rtM 204I/V/S）基礎(chǔ)上同時出現(xiàn)A區(qū)rtI169T、B區(qū)rtT184C/G、rtS202G/I和D區(qū)rtM 250V等突變。ETV對初治患者基本不發(fā)生耐藥，1～5年的耐藥突變率均為＜1％［17］。而發(fā)生拉米夫定耐藥患者中，ETV治療2年的累積基因耐藥率為16％，病毒學(xué)反彈超過10％，較初治患者明顯升高。ETV具有高基因屏障的特點(diǎn)，多位點(diǎn)突變才可能出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，這也是ETV耐藥發(fā)生率低的重要原因。

2.4 TDF耐藥變異位點(diǎn)

TDF與ADV結(jié)構(gòu)相似，兩者具有類似的抗病毒活性。研究顯示，TDF治療3年后并未出現(xiàn)明確的TDF耐藥，有報道第194位丙氨酸至蘇氨酸的替換（rtA194T）與TDF耐藥相關(guān)，但出現(xiàn)該耐藥后仍對ETV敏感［18］。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，rtA181/T或rtN236T ADV耐藥株對TDF的敏感性下降3～4倍，推測可能是TDF潛在突變位點(diǎn)［19］。

耐藥位點(diǎn)的提出與確立是一個長期的、需要重復(fù)驗(yàn)證的過程。在驗(yàn)證過程中，由于表型耐藥檢測體系的差別可能會出現(xiàn)結(jié)果的不一致。單個變異位點(diǎn)的確定需要結(jié)合HBV基因型、全基因組序列及患者的臨床指標(biāo)等各方面因素［20-21］。此外，我們需要深入了解耐藥變異與臨床耐藥的關(guān)系，結(jié)合臨床癥狀及個體化因素，綜合分析耐藥變異引起的臨床改變，從而確定準(zhǔn)確可靠耐藥變異位點(diǎn)。隨著研究的不斷深入，越來越多的突變位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，表1總結(jié)了近幾年發(fā)現(xiàn)報道的NAs常見的耐藥突變位點(diǎn)，可目前應(yīng)用于臨床指導(dǎo)藥物選擇的位點(diǎn)有限。因此，我們需要在探索新位點(diǎn)的同時，建立更加成熟的突變檢測技術(shù)，制定合理的抗病毒治療方案，對患者服用藥物的相關(guān)耐藥突變位點(diǎn)實(shí)時監(jiān)控，及時調(diào)整治療方案。

3 HBV NAs的耐藥突變檢測

建立準(zhǔn)確、靈敏和經(jīng)濟(jì)可行的耐藥突變檢測方法對于慢性HBV感染抗病毒治療中耐藥性的監(jiān)測和確定具有重要意義。目前已報道的HBV耐藥突變的檢測方法根據(jù)原理的不同大致可分為測序法、反向雜交法及PCR相關(guān)技術(shù)方法等，這些方法各有利弊。隨著臨床耐藥形勢日漸嚴(yán)峻，發(fā)展并推廣特異性強(qiáng)、靈敏度高及價格適中的檢測手段成為當(dāng)務(wù)之急。

3.1 測序法

表1 HBV NAs常見的耐藥突變位點(diǎn)Table 1 Common drug resistance mutations of NAs against HBV

測序法主要包括經(jīng)典直接測序法、克隆測序法、焦磷酸測序法、SNaPshot技術(shù)等。隨著生物科學(xué)的迅猛發(fā)展，作為最準(zhǔn)確的耐藥檢測方法，測序法不斷發(fā)展完善。與其他耐藥檢測方法相比，測序法精準(zhǔn)度和特異性都較高，且能對多個位點(diǎn)同時進(jìn)行檢測。測序法與其他檢測手段進(jìn)行比較，可作為檢測功效的衡量標(biāo)準(zhǔn)。

3.1.1 直接測序法（direct sequencing，DS）與SNaPshot單核苷酸多態(tài)性檢測法

DNA直接測序法一直被認(rèn)為是檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，研究者曾利用DS檢測出HBV YMDD和rtA181T/V位點(diǎn)變異［22］。DS最大的優(yōu)勢是可檢測新發(fā)突變位點(diǎn)，DS的檢測結(jié)果通常與還可與其他突變檢測技術(shù)比較，作為檢測功效的衡量標(biāo)準(zhǔn)。由于DS要求將目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增并連接到載體再行檢測，因此無法滿足HBV快速診斷和大規(guī)模檢測的要求。另外，對于多種基因型同時存在的病毒群，DS只能檢測DNA含量高的優(yōu)勢病毒株。而對于病毒含量低標(biāo)本，DS靈敏度不高，可能會漏檢低比例（＜1％）耐藥突變［23］。

SNapshot單核苷酸多態(tài)性檢測法，即微測序法，是在DNA直接測序基礎(chǔ)上發(fā)展出來的一種新的檢測方法。該技術(shù)依據(jù)待檢測序列設(shè)計特異性引物，在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記的ddNTP，依據(jù)峰的顏色確定樣本的基因型，依據(jù)峰的位置確定延伸產(chǎn)物對應(yīng)的SNP位點(diǎn)。Salpini等［24］利用SNaPshot技術(shù)對204例CHB患者血清檢測耐藥位點(diǎn)檢測，結(jié)果與測序結(jié)果一致，證實(shí)了SNaPshot技術(shù)高度的準(zhǔn)確性。與直接測序法相比該技術(shù)操作簡便，經(jīng)濟(jì)快速。但是此類方法對引物的要求較高，并且一般只可以檢測已知突變位點(diǎn)。

3.1.2 焦磷酸深度測序

焦磷酸深度測序技術(shù)（pyro-sequencing，PyroS）是近年來臨床應(yīng)用較廣的一種實(shí)時DNA序列分析技術(shù)。該技術(shù)敏感度較高，最少可檢測0.1％比例的耐藥突變，因此可作為耐藥變異的早期檢測方法。Ciftci等［25］運(yùn)用該技術(shù)對42位CHB患者的耐藥位點(diǎn)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)了rtL180I、rtQ215P、rtI233Y、rtN238D和rtM 250S 5個獨(dú)立的耐藥突變位點(diǎn)，作者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)rtI266G突變會與LAM耐藥有關(guān)，推測可能是LAM潛在的耐藥變異位點(diǎn)。目前，以高靈敏度及特異性為特點(diǎn)的焦磷酸深度測序已超越經(jīng)典普通測序方法，尤其是在早期監(jiān)控及檢測階段，發(fā)揮了重要的作用。

3.2 雜交法

雜交法是使樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光標(biāo)記探針特異性結(jié)合，通過對鑒別不同熒光檢測突變位點(diǎn)的方法。由于擴(kuò)增產(chǎn)物可同時與多個探針結(jié)合，故雜交法可一次性檢測多個突變模式。

3.2.1 線性探針技術(shù)

線性探針技術(shù)用于檢測HBV耐多藥，具有成本低、特異性高等特點(diǎn)，為耐多藥突變的早發(fā)現(xiàn)、早治療提供了診斷依據(jù)。Yoshida等［26］針對HBV野生型和已知位點(diǎn)（rtM 204V/I）的耐藥型毒株基因序列分別設(shè)計探針，固定于PVDF膜，將待檢測樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增后雜交，結(jié)果在109名CHB患者中，檢出了90名rtM 204V/I突變，檢出率為88.2％。線性探針技術(shù)的缺點(diǎn)是只可檢測已知突變。近年來，以線性探針為基礎(chǔ)發(fā)展起來的交聯(lián)擴(kuò)增技術(shù)（ligation amplification assay，LigAmp）在YMDD變異檢測時具有較高敏感度，可在LAM耐藥突變進(jìn)行早期監(jiān)控［27］。

3.2.2 基因芯片技術(shù)

基因芯片突變檢測技術(shù)是將特定的基因片段或寡核苷片段以特定順序密集排列于某種固相載體上（如硅片或玻片），形成基因芯片，與熒光標(biāo)記樣本雜交，通過激光共聚焦系統(tǒng)檢測雜交信號強(qiáng)度，讀取樣本的數(shù)量和序列信息。已有研究顯示，芯片檢測法準(zhǔn)確率達(dá)96％，敏感性達(dá)95％，特異性為100％，對比傳統(tǒng)的DNA序列分析法（準(zhǔn)確率87％，敏感性82％，特異性100％），該技術(shù)有較高的檢測靈敏度與準(zhǔn)確率［28］。基因芯片技術(shù)與傳統(tǒng)雜交技術(shù)相比，具有檢測效率高、系統(tǒng)微型化、能夠同時對多個位點(diǎn)同步檢測的優(yōu)勢，符合現(xiàn)代分子生物醫(yī)學(xué)發(fā)展的趨勢，但HBV的高突變率縮短了寡核苷探針的使用壽命，偏差的出現(xiàn)導(dǎo)致一定比例的假陰性，制約了該技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用［29］。

3.3 PCR相關(guān)技術(shù)

3.3.1 實(shí)時熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）熔解曲線分析法

RTFQ-PCR技術(shù)利用熒光信號實(shí)時積累監(jiān)控整個PCR過程，SYBR GreenⅠ非特異性地嵌入DNA雙鏈間，發(fā)出強(qiáng)烈熒光信號，若存在其他雙鏈寡核苷酸，便會產(chǎn)生假陽性信號，降低了檢測的精確性［30］。Zeng等［31］利用實(shí)時熒光PCR技術(shù)檢測HBV YIDD耐藥突變，與市售優(yōu)秀HBV耐藥突變測序檢測試劑盒檢測結(jié)果的完全一致率91.2％（93/102），部分一致率8.8％（9/102），未發(fā)現(xiàn)完全不一致（0/102），兩法一致性好（Kappa=0.676，P= 0.000）。克隆測序檢結(jié)果與RTFQ-PCR完全一致。RTFQ-PCR檢測技術(shù)可通過Ct數(shù)值確定變異病毒含量及其與野生毒株的比值，具有重復(fù)性好、靈敏度高、無擴(kuò)增后處理等優(yōu)點(diǎn)，是臨床應(yīng)用時間最長、最成熟的一種分子檢測技術(shù)，目前已成為臨床實(shí)驗(yàn)室普遍采用的檢測技術(shù)。但該方法也有其局限性，如HBV的高突變性導(dǎo)致探針和引物設(shè)計出現(xiàn)偏差，出現(xiàn)假陰性。

3.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)微板核酸雜交-酶聯(lián)免疫吸附法（PCRmicroplate nucleic acid hybridization-enzyme linked immunosorbent assay，PCRmnh-ELISA）

PCRmnh-ELISA檢測技術(shù)將基因擴(kuò)增、核酸雜交和酶聯(lián)顯色3種診斷技術(shù)結(jié)合，通過設(shè)計特定的組合引物將突變基因和正?；蚍直娉鰜?。PCR-mnh增強(qiáng)了核酸雜交的特異性，而與ELISA技術(shù)結(jié)合后則提高了檢測方法的靈敏度。PCRmnh-ELISA可以檢測出已知變異的基因序列，可同時從1 000個正?；蛐蛄兄袡z測出1個變異位點(diǎn)，且檢測結(jié)果不受正?；蛐蛄懈蓴_。但體系中的非特異性探針雜交及過度敏感的信號放大系統(tǒng)均會導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生。此外，此法操作復(fù)雜，需在開放環(huán)境中進(jìn)行，可能會對實(shí)驗(yàn)室造成污染。目前該技術(shù)僅用于科學(xué)研究，臨床普及難度大。

3.4 其他檢測方法

變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC），也稱為溫度調(diào)節(jié)的雜合雙鏈分析技術(shù)，是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新的分析技術(shù)。該技術(shù)利用部分變性條件下同源—異源雙鏈靶DNA解鏈特征的差異性進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測。該檢測方法具有快速、高特異性、高靈敏、高通量、廉價省時及操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。但是，該技術(shù)對待檢樣本的PCR技術(shù)要求很高，對PCR引物設(shè)計、體系優(yōu)化及最適擴(kuò)增片斷等都有較高要求，還需保證PCR產(chǎn)物具有較高的含量和質(zhì)量。當(dāng)PCR片段擴(kuò)增特異性較差時，可能會導(dǎo)致結(jié)果假陽性，以致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

4 展望

隨著對NAs耐藥機(jī)制研究的不斷深入，耐藥管理的觀念也在不斷更新。在整個用藥期間對病患定期隨訪、精確監(jiān)控耐藥位點(diǎn)以便第一時間診斷出病毒耐藥成為臨床最行之有效的耐藥管理方案，精確嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)室檢測則是上述方案取得成功的有力保證。

隨著生物醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，越來越多的新技術(shù)開始應(yīng)用于HBV耐藥突變的檢測。敏感性和特異性越來越高、可檢測位點(diǎn)（尤其是未知變異位點(diǎn)）越來越多、樣本量越來越大、操作簡化、成本低廉，這些特點(diǎn)都是NAs耐藥突變檢測新技術(shù)的發(fā)展趨勢。經(jīng)典的直接測序法特異性強(qiáng)、敏感度高，可檢測未知變異位點(diǎn)，一直被視為變異位點(diǎn)檢測的金標(biāo)準(zhǔn)；熒光定量PCR技術(shù)靈敏度較高，而且熒光定量分析儀目前也已普及，價格相對適中，因此目前認(rèn)為該方法在臨床上應(yīng)用前景最為廣泛，適合大標(biāo)本量檢測；以焦磷酸測序技術(shù)和SNaPshot為代表的第三代測序技術(shù)兼顧了高敏感性、高特異性等特點(diǎn)，高通量的檢測又可大幅度降低成本，SNaPshot技術(shù)更可直觀地檢測基因片段堿基序列，但技術(shù)尚未成熟，且對引物和實(shí)驗(yàn)條件要求較高，臨床普及開展難度大，相信未來會有所改善。

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Hepatitis B virus nucleos（t）ide analogues drug resistance mutations and the clinical application of variation loci detection

CHAOWei★，HEBaoyu
（Medical Clinical Laboratory，The Fourth Hospital Affiliated to Guangxi Medical University，Liuzhou，Guangxi，China，545005）

At present，nucleos（t）ide analogues（NAs）available for clinical application of Chronic hepatitis B（CHB）include lamivudine（LAM），telbivudine（LdT），adefovir（ADV），entecavir（ETV），and tenofovir（TDF）.As virus reverse transcriptase inhibitors，NAs can inhibit HBV DNA replication.Because of the highmutation rate of HBV，long-term treatment with NAs resulting in drug-resistant strains will reduce the effect of NA treatments.Therefore，in order to control the occurrence of drug resistance in CHB antiviral treatment，figuring out the resistance mechanism and monitoring and diagnosis of variation is essential.In this paper，we summarized common mutations discovered in recent years，and compared the clinical application of several technologies monitoring and detecting drug-resistant mutations，which is important for early and rapid mutation detection and optimizing the monitoring of chronic HBV infection.

Nucleos（t）ide analogues；Drug resistance mutations；Hepatitis B virus；Chronic hepatitis B；Common drug-resistance variation；Variation loci detection

國家自然科學(xué)基金（81160269）；柳州市腫瘤疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)（2014G020403）

廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣西，柳州545005

★通訊作者：巢薇，E-mail：2312969581@qq.com