維生素D缺乏影響受孕及胚胎發(fā)育的小鼠動(dòng)物模型研究

王波 王雪云

·論著·

維生素D缺乏影響受孕及胚胎發(fā)育的小鼠動(dòng)物模型研究

王波 王雪云★

目的通過建立小鼠模型考察維生素D缺乏對(duì)受孕力水平及胚胎發(fā)育的影響。方法采用數(shù)字隨機(jī)法則將雌鼠分為維生素D缺乏組（vitamin D deficiency，VDD組）與對(duì)照組（Control組），VDD組采用維生素D低含量飼料喂養(yǎng)，Control組采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)2周后合籠。結(jié)果GD13時(shí)，VDD組孕鼠的胚胎著床數(shù)（9.52±1.75）顯著低于Control組的（13.34±2.16）（P＜0.01）；VDD組孕鼠的胎兒流產(chǎn)率明顯上升；VDD組孕鼠的胎盤重量為（0.058 7±0.017 6）g，顯著低于Control組的（0.078 6±0.014 3）g（P＜0.01）；VDD組孕鼠的胎盤海綿體滋養(yǎng)層細(xì)胞面積為（86.20±6.06）％，顯著小于Control組的（100.00±4.51）％（P＜0.01）；GD21時(shí)，VDD組孕鼠的血清25（OH）D濃度為（6.32±0.51）nmol/ m L，Control組孕鼠的血清25（OH）D濃度為（13.46±0.62）nmol/m L，組間比較Control組顯著更高（P＜0.01），與Control組比較，VDD組的活胎數(shù)、孕鼠孕期增重、胎鼠體重、胎盤重量及胎鼠身長顯著降低（P＜0.01），吸收胎數(shù)與死胎數(shù)顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論母體維生素D缺乏是導(dǎo)致小鼠受孕力水平降低及妊娠后胚胎發(fā)育遲緩的重要影響因素之一，在孕前及孕期科學(xué)補(bǔ)充維生素D對(duì)提高育齡期小鼠受孕力水平及保障妊娠后胚胎良性發(fā)育具有重要意義。

維生素D；受孕力；胚胎發(fā)育；動(dòng)物模型

受孕率水平與胎兒的宮內(nèi)生長發(fā)育是與生殖健康直接相關(guān)的2個(gè)非常重要的方面。而當(dāng)前的一系列研究表明，受多因素影響，人類自然受孕力在近幾十年內(nèi)或?qū)⒊尸F(xiàn)出下降趨勢(shì)［1］。同時(shí)也有報(bào)道顯示，宮內(nèi)生長發(fā)育遲緩（intrauterine grow th retardation，IUGR）的全球發(fā)生率為11％，我國大概為6.4％，雖然低于全球整體水平，但由于我國出生人口的基數(shù)相對(duì)更大，故每年出生的IUGR患兒例數(shù)保守估計(jì)應(yīng)不低于100萬［2］。IUGR不僅存在導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)死亡的風(fēng)險(xiǎn)，而且即使順利出生，在此之后的患病與死亡幾率也顯著高于正常新生兒。因此，科學(xué)防控受孕力水平下降與IUGR 2種情況的發(fā)生對(duì)提高全社會(huì)生殖健康水平與人口素質(zhì)具重要現(xiàn)實(shí)意義。

維生素D缺乏與人類健康的關(guān)系一直受到臨床的普遍關(guān)注。早期的研究證實(shí)維生素D缺乏是佝僂病與軟骨病等疾病的重要誘因之一［3］。人體所需的維生素D主要來源于皮膚經(jīng)光照作用由7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)化并貯存在體內(nèi)的25（OH）D。故隨著很大部分人群其工作模式由過去的戶外作業(yè)向室內(nèi)轉(zhuǎn)移，維生素D缺乏也勢(shì)必更為普遍。最近的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，孕期婦女維生素D水平低下［血清25（OH）D濃度≤30 ng/m L］者約占76.1％，其中嚴(yán)重缺乏［血清25（OH）D濃度≤20 ng/m L］者甚至高達(dá)44.6％。另一項(xiàng)小樣本對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，胚胎停育以及小于胎齡兒其母體孕期維生素D缺乏的發(fā)生率較對(duì)照組顯著更高［4］。然而，維生素D缺乏是否與女性的受孕力水平及發(fā)生IUGR具有直接關(guān)聯(lián)目前尚未探明。鑒于此，本研究特建立維生素D缺乏的小鼠動(dòng)物模型，旨在揭示維生素D缺乏對(duì)受孕力水平及胚胎發(fā)育的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)ICR小鼠60只，每組各30只，小鼠及喂養(yǎng)飼料均購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。小鼠均為8周齡，雄鼠體重31～35 g，雌鼠體重28～30 g。飼料包括標(biāo)準(zhǔn)飼料（維生素D3含量＞800 IU/kg）與維生素D低含量飼料（維生素D3含量25 IU/kg）2種。

1.2 方法

采用數(shù)字隨機(jī)法則將雌鼠分為維生素D缺乏組（VDD組）與對(duì)照組（Control組），2組小鼠的毛色、活動(dòng)度以及本實(shí)驗(yàn)之前的飲食狀況等基線資料組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。VDD組采用維生素D低含量飼料喂養(yǎng)，Control組采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，2組小鼠均自由飲食。喂養(yǎng)過程中控制環(huán)境溫度20～25℃，環(huán)境相對(duì)濕度（50±5）％，接受一致光照，但對(duì)VDD組實(shí)施紫外波段過濾。照上述方法喂養(yǎng)2周后于9：00 PM進(jìn)行雌雄合籠，雌雄比例為4：2，次日7：00 AM檢查雌鼠陰栓，若在陰道至子宮頸的腔內(nèi)有發(fā)現(xiàn)白色漿液性物質(zhì)則視為交配成功，同時(shí)將本日定為妊娠0 d（GD0）。

1.3 觀察指標(biāo)

①于GD13各組隨機(jī)抽取10只孕鼠剖殺，取出子宮及胎盤組織，統(tǒng)計(jì)胚胎著床數(shù)并稱重，另采用蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）法對(duì)胎盤組織進(jìn)行染色，并采用ImageJ軟件測(cè)量胎盤海綿體滋養(yǎng)層細(xì)胞的面積［5］。②于GD21各組再隨機(jī)抽取10只孕鼠剖殺，收集2組孕鼠血清，采用放射免疫法檢測(cè)血清25（OH）D濃度，另分別統(tǒng)計(jì)2組的胎數(shù)、吸收胎數(shù)、死胎數(shù)、活胎數(shù)、孕期增重、胎鼠體重、胎盤重量、身長、尾長、頭圍直徑以及胸圍直徑。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件給予處理，計(jì)量資料采用（±s）表示，檢驗(yàn)方法為t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率（％）表示，檢驗(yàn)方法采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組孕鼠GD13的受孕情況比較

GD13時(shí)，VDD組孕鼠的胚胎著床數(shù)（9.52± 1.75），顯著低于Control組的（13.34±2.16）（P＜0.01），見圖1A；VDD組孕鼠的胎兒流產(chǎn)率明顯上升，見圖1B；VDD組孕鼠的胎盤重量為（0.058 7±0.017 6）g，顯著低于Control組的（0.078 6±0.014 3）g（P＜ 0.01），見圖2；VDD組孕鼠的胎盤海綿體滋養(yǎng)層細(xì)胞面積為（86.20±6.06）％，顯著小于Control組的（100.00±4.51）％（P＜0.01），見圖3。

2.2 2組孕鼠GD21的血清維生素D含量比較

GD21時(shí)，VDD組孕鼠的血清25（OH）D濃度為（6.32±0.51）nmol/m L，Control組孕鼠的血清25（OH）D濃度為（13.46±0.62）nmol/m L，組間比較Control組顯著更高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=33.311，P＜0.01），見圖4。

2.3 2組孕鼠GD21的胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局比較

GD21時(shí)，與Control組比較，VDD組的活胎數(shù)、孕鼠孕期增重、胎鼠體重、胎盤重量及胎鼠身長顯著降低（P＜0.01），吸收胎數(shù)與死胎數(shù)顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），見表1、圖5。

表1 2組孕鼠GD21的胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局比較（±s）Table 1 Comparison of embryonic development andpregnancy outcome of 2 groups of pregnant mouse with GD21（±s）

表1 2組孕鼠GD21的胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局比較（±s）Table 1 Comparison of embryonic development andpregnancy outcome of 2 groups of pregnant mouse with GD21（±s）

測(cè)量指標(biāo)胎數(shù)（只）吸收胎數(shù)（只）死胎數(shù)（只）活胎數(shù)（只）孕期增重（g）胎鼠體重（g）胎盤重量（g）身長（cm）尾長（cm）頭圍直徑（cm）胸圍直徑（cm）Control組13.1±1.3 0.2±0.1 0.2±0.1 12.5±0.8 110±13 6.1±0.4 0.103±0.002 5.21±0.33 1.48±0.18 0.83±0.13 1.03±0.25 VDD組11.6±2.9 0.3±0.1 0.9±0.5 11.0±1.8 83±18 4.5±0.5 0.071±0.048 4.59±0.54 1.40±0.23 0.76±0.18 0.95±0.31 t P 1.493 2.236 4.341 2.408 3.845 7.902 2.106 3.098 0.866 0.997 0.635＞0.05＜0.05＜0.01＜0.05＜0.01＜0.01＜0.05＜0.01＞0.05＞0.05＞0.05

3 討論

關(guān)于孕婦體內(nèi)需要維持的正常維生素D水平目前尚存在一定爭議，但相關(guān)權(quán)威機(jī)構(gòu)如國際骨質(zhì)疏松基金會(huì)與國際內(nèi)分泌學(xué)會(huì)均建議至少應(yīng)不低于30 ng/m L［6-7］。有學(xué)者［8］通過meta分析發(fā)現(xiàn)，與正常女性比較，血清25（OH）D水平低于20 ng/m L的女性群體其臨床受孕率及胎兒活產(chǎn)率均顯著降低。一項(xiàng)經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）注冊(cè)的隨機(jī)對(duì)照研究顯示［9］，將孕婦的血清25（OH）D水平維持在32 ng/m L以上幾乎可完全避免不良妊娠結(jié)局的發(fā)生且具良好穩(wěn)定性。這些結(jié)果我們可結(jié)合維生素D對(duì)女性生殖系統(tǒng)功能的影響給予解釋?；钚跃S生素D在人體內(nèi)發(fā)揮生物作用首先是基于其與維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）的結(jié)合。而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，VDR在女性卵巢、子宮內(nèi)膜、輸卵管上皮細(xì)胞、胎盤以及蛻膜上均有不同程度表達(dá)，同時(shí)其表達(dá)量還將伴隨妊娠而增加［10］。與此同時(shí)，在人體骨骼、乳腺、胎盤以及子宮內(nèi)膜中均發(fā)現(xiàn)存在有維生素D代謝的關(guān)鍵酶1α-羥化酶，且活性維生素D與體內(nèi)胎盤中催乳素及人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）合成及分泌有關(guān)。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在卵巢顆粒細(xì)胞中有觀察到VDRmRNA表達(dá)且其表達(dá)水平與卵泡發(fā)育具關(guān)聯(lián)性，同時(shí)該研究還進(jìn)一步揭示維生素D對(duì)顆粒細(xì)胞中抗苗勒管激素（評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能的指標(biāo)）水平具調(diào)節(jié)作用［11］。國外有學(xué)者［12］將小鼠VDR受體基因突變使其缺陷后發(fā)現(xiàn)，觀察組小鼠的子宮發(fā)育完整性顯著不及對(duì)照組并伴隨出現(xiàn)不孕，提示維生素D參與了小鼠子宮的發(fā)育及成熟。目前業(yè)已證實(shí)，HOXA-10基因在胚胎的著床及分裂過程中發(fā)揮有重要作用，而有研究發(fā)現(xiàn)，活性維生素D作用于子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞可明顯增加HOXA-10mRNA蛋白表達(dá)水平［13］。綜合上述研究，可以認(rèn)為維生素D可從多途徑對(duì)女性生殖系統(tǒng)功能產(chǎn)生影響。本研究成功構(gòu)建了維生素D缺乏小鼠模型，結(jié)果顯示，在GD13時(shí)，與Control組比較，VDD組雌鼠的胚胎著床數(shù)顯著降低，胎兒流產(chǎn)率明顯上升，胎盤海綿體滋養(yǎng)層細(xì)胞面積顯著減小，組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），進(jìn)一步證實(shí)孕前母體低維生素D水平可導(dǎo)致受孕力降低。

本研究結(jié)果還顯示，GD21時(shí)，與Control組比較，VDD組的活胎數(shù)、孕鼠孕期增重、胎鼠體重、胎盤重量及胎鼠身長顯著降低（P＜0.01），吸收胎數(shù)與死胎數(shù)顯著增加（（P＜0.05或P＜0.01）。此部分結(jié)果反映了維生素D缺乏與IUGR及宮內(nèi)死亡的發(fā)生應(yīng)存在關(guān)聯(lián)，然而其具體機(jī)制目前尚不清楚。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)中的胎盤情況以及近期多位學(xué)者的一系列研究可初步確認(rèn)，胎兒宮內(nèi)生長受限原因有：胎兒本身因素（染色體異常、病毒感染等），母體因素（慢性疾病、營養(yǎng)不良、胎盤因素、臍帶因素），胎盤發(fā)育受損和功能障礙是引起胎兒宮內(nèi)生長受限的重要原因之一［14］。胚胎和胎兒生長發(fā)育所需的營養(yǎng)（如必需氨基酸、糖和必需脂肪酸等）主要由胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)，而且，胎盤還分泌生長激素或生長因子（如胰島素樣生長因子IGFs等）；胎盤還可對(duì)母體內(nèi)一些可損害胚胎和胎兒生長發(fā)育的有害物質(zhì)起到屏障作用。一旦胎盤的發(fā)育以及功能受損，胚胎以及胎兒的正常發(fā)育必然遭受損害，繼而導(dǎo)致胚胎和胎兒宮內(nèi)生長受限。

一些小小樣本研究證明：分娩小于胎齡兒的孕婦血清維生素D水平明顯低于分娩正常體重的孕婦，證明維生素D缺乏與早產(chǎn)、流產(chǎn)、胚胎停止發(fā)育有關(guān)［15］，還有研究結(jié)果顯示：與單純l，25（OH）2D3培養(yǎng)組相比，對(duì)照組VDRmRNA水平并未表現(xiàn)有明顯的下降趨勢(shì)，故認(rèn)為維生素D缺乏可能并非通過直接作用而可能是通過某種介質(zhì)間接作用來對(duì)胎盤的發(fā)育與功能造成損害。關(guān)于此方面，目前多方研究證實(shí)，炎癥因子可能是導(dǎo)致胎盤發(fā)育受損和功能障礙的重要原因之一。如有學(xué)者［16］發(fā)現(xiàn)，在接受Tbll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的外源性天然配體-細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理后，孕鼠胎盤組織中的tnf-α以及il-6等促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)將顯著上調(diào)，胎盤均重降低繼而誘發(fā)胎兒宮內(nèi)生長受限。此外，在對(duì)體外人胎盤線毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞加入LPS或腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）孵育時(shí)，發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)葉酸的吸收能力顯著下降。其中，LPS可抑制人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞合成和分泌IGF-1；而另一方面，有研究資料證實(shí)［17］，TNF-α在炎癥介導(dǎo)的胎兒死亡和生長發(fā)育遲緩發(fā)生過程起關(guān)鍵作用。綜上所述，孕鼠血清維生素D缺乏可能并非通過直接抑制胎盤細(xì)胞增殖生長，而是增強(qiáng)體內(nèi)炎性因子表達(dá)，增加體內(nèi)炎癥反應(yīng)繼而抑制胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致IUGR發(fā)生。

綜上所述，本研究所構(gòu)建的維生素D缺乏小鼠模型提示：母體維生素D缺乏是導(dǎo)致小鼠受孕力水平降低及妊娠后胚胎發(fā)育遲緩的重要影響因素之一，在孕前及孕期科學(xué)補(bǔ)充維生素D對(duì)提高育齡期小鼠受孕力水平及保障妊娠后胚胎良性發(fā)育具有重要意義。

［1］Anderson K，Nisenblat V，Norman R.Lifestyle factors in people seeking infertility treatment-a review［J］.AustN Z J Obstet Gynaecol，2010，50（l）：8-20.

［2］Figueras F，Gardosi J.Intrauterine grow th restriction：new concepts in antenatal surveillance，diagnosis，and management［J］.Am JObstet Gynecol，2011，204（4）：288-300.

［3］Masuyama R.Role of local vitamin D signaling and celluar calcium transport system in bone homeostasis［J］.J Bone Miner Metab，2014，32（1）：1-9.

［4］范雅萍，朱中平，吳祥林.孕婦血鎘、鉛、鈣、銅、鋅水平與稽留流產(chǎn)的關(guān)聯(lián)性研究［J］.廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，32（4）：454-457.

［5］Chen YH，Zhao M，Chen X，et al.Zinc supplementation during pregnancy protects against lipopolysaccharide-induced fetal growth restriction and demise through its anti-inflammatory effect［J］.Immunol，2012，189（1）：454-463.

［6］Dawson-Hughes B，M ithal A，Bonjour JP，et al.IOF position statement：vitamin D recommendations for older adults［J］.Osteoporos Int，2010，21（7）：1151-1154.

［7］Holick MF，Binkley NC，Bischoff-Ferrari HA，et al. Evaluation，treatment，and prevention of vitamin D deficiency：an endocrine society clinical practice guideline［J］.JClin Endocrinol Metab，2011，96（7）：1911-1930.

［8］Vanni VS，Vigano'P，Somigliana E，etal.Vitamin D and assisted reproduction technologies：current concepts［J］.Reproductive Biology and Endocrinology，2014，12：47.［9］Hollis BW，Johnson D，Hulsey TC，et al.Vitamin D supplementation during pregnancy：double-blind，randomized clinical trial of safety and effectiveness［J］.J Bone Miner Res，2011，26（10）：2341-2357.

［10］ZarnaniAH，ShahbaziM，Salek-Moghaddam A，etal. Vitamin D3 receptor is expressed in the endometrium of cycling m ice throughout the estrous cycle［J］.Fertil Steril，2010，93（8）：2738-2743.

［11］Wojtusik J，Johnson PA.Vitam in D regulates antimullerian hormone expression in granulosa cells of the hen［J］.Biol Reprod，2012，86（3）：91.

［12］Yoshizawa T，Handa Y，Uematsu Y，etal.M ice lacking the vitamin D receptor exhibit impaired bone formation uterine hypoplasia and grow th retardation after weaning［J］.NatGenet，1997，16（4）：391-396.

［13］Du H，Daftary GS，LalwaniSI，etal.Direct regulation of HOXA10 by 1，25-（OH）2D3 in humanmyelomonocytic cells and human endometrial stromal cells［J］. Mol Endocrinol，2005，19（9）：2222-2233.

［14］Conroy AL，Silver KL，Zhong K，et al.Complement activation and the resulting placental vascular insufficiency drivesfetalgrow th restriction associated with placental malaria［J］.Cell Host M icrobe，2013，13（2）：215-226.

［15］Ota K，Dambaeva S，Han AR，et al.Vitamin D deficiency may be a risk factor for recurrent pregnancy loss by increasing cellular immunity and autoimmunity［J］. Hum Reprod，2014，29（2）：208-219.

［16］Zhao M，Chen YH，Dong XT，et al.Folic acid protects against lipopolysaccharide-induced preterm delivery and intrauterine grow th restriction through its antiinflammatory effect in m ice［J］.Plos One，2013，8（12）：e82713.

［17］范雅萍，朱中平，吳祥林.孕婦血鎘、鉛、鈣、銅、鋅水平與稽留流產(chǎn)的關(guān)聯(lián)性研究［J］.廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，32（4）：454-457.

Effect of vitamin D deficiency on the pregnancy and embryonic development in mouse model

WANG Bo，WANG Xueyun★
（Obstetrics and Gynecology Department，Huai’an First People’s Hospital，Nanjing Medical University，Huai’an，Jiangsu，China，223300）

Objective To study the effect of vitamin D deficiency on the potential to conceive and embryonic development through establishing amouse model.Methods Digital random method was used to divide the female mice into the vitamin D deficient（VDD）group and the control group.The individuals of the VDD group were fed with low levels of vitamin D diet，and the Control group received a standard diet.After 2 weeks，the mice were mated.Results At GD13，embryo implantation number of pregnant mice of VDD group（9.52±1.75）were significantly lower than that of Control group（13.34±2.16）（P＜0.01）；abortion rate of pregnant mice of VDD group were significantly increased；placental weight of pregnant mice of VDD group（0.058 7±0.017 6）g were significantly lower than thatof Control group（0.078 6±0.014 3）g（P＜0.01）；placental trophoblast cells of corpus cavernosum area in pregnant mice of VDD group were（86.20±6.06）％，significantly lower than that of Control group（100.00±4.51）％（P＜0.01）.AtGD21，serum 25（OH）D concentration of pregnant m ice of VDD group was（6.32±0.51）nmol/m L.However，serum 25（OH）D concentration was significantly higher in Control group（13.46±0.62）nmol/m L（P＜0.01）.Compared with the Control group，the number of live fetuses，pregnant mouse weight，fetal weight，placental weight and fetal length in VDD group were significantly decreased（P＜0.01），and the number of dead and absorbed fetus were significant increased（P＜0.05 and P＜0.01respectively）.Conclusion Maternal vitamin D deficiency is one of the important factors resulting in the reduced pregnancy force level and stunted embryonic development in post-pregnancy mouse.So the supply of vitamin D is essential for the mouse of childbearing age during the pre-pregnancy and pregnancy period，which can significantly increase the potential to conceive and guarantee benign post-pregnancy embryonic development.

Vitamin D；Pregnancy force；Embryonic development；Animal model

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇，淮安223300

★通訊作者：王雪云，E-mail：365987071@qq.com